Генетическая вариабельность Anaplasma phagocytophilum в областях симпатрии Ixodes persulcatus и Ixodes trianguliceps Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»



УДК 577.21+595.42

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM В ОБЛАСТЯХ СИМПАТРИИ IXODES PERSULCATUS И IXODES TRIANGULICEPS

В.А. Рар1, Т.И. Епихина1, В.В Якименко2, М.Г. Малькова2, А.К. Танцев2, М.Т. Макенов2, Е.И. Бондаренко3, М.К. Иванов3,4, Н.В. Тикунова1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Россия, 630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8. Тел.: (383) 363-51-50 2ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, Россия, 644080, г. Омск, просп. Мира, 7; mail@oniipi.org 3ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск Россия, 630117, г. Новосибирск ул. Арбузова, д. 1/1, оф. 307, 309 3Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск Россия, 630090, Новосибирск, Россия, пр. ак. Лаврентьева, 10; icg-adm@bionet.nsc.ru

На наличие ДНК A. phagocytophilum были исследованы образцы крови/селезенок от полевок, снятые с грызунов I. trianguliceps и I. persulcatus, а также собранные на флаг имаго I. persulcatus из трех участков Омской области, характеризующихся совместным обитанием I. persulcatus и I. trianguliceps. Было показано, что обнаруженные образцы анаплазм относятся к трем генетическим группам A. phagocytophilum, ранее выявленным в России. Полученные в данной и предыдущих работах результаты позволяют предположить, что анаплазмы генетической группы 1 и 2 переносятся полевкам клещами I. persulcatus и I. trianguliceps, соответственно, а анаплазмы группы 3 - клещами I. persulcatus бурундукам. Анаплазмы второй группы на основании анализа нуклеотидных последовательностей groESL оперона, msp4 гена и DOV1 межгенной области наиболее схожи с европейскими изолятами A. phagocytophilum от грызунов и I. trianguliceps, анаплазмы третьей группы - с европейскими изолятами A. phagocytophilum от косуль и I. ricinus, а анаплазмы генетической группы 1 существенно отличаются от других известных последовательностей A. phagocytophilum.

Ключевые слова: Anaplasma phagocytophilum; Ixodes persulcatus; Ixodes trianguliceps; полевки; генетические группы.

GENETIC VARIABILITY OF ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM IN TICKS AND VOLES FROM IXODES PERSULCATUS AND IXODES TRIANGULICEPS SYMPATRIC AREAS

V.A. Rar1, T.I. Epikhina1, V.V. Yakimenko2, M.G. Malkova2, A.K. Tancev2, M.G. Makenov2, E.I. Bondarenko3, M.K. Ivanov3,4, N.V. Tikunova1

institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russian Federation;

2Omsk Research Institute of Natural Foci Infections, Omsk, Russian Federation;

Joint-stock company "Vector-Best", Novosibirsk, Russian Federation;

4The Institute of Cytology and Genetics, SB RAS, Novosibirsk, Russian Federation

The presence of Anaplasma phagocytophilum was assayed in vole blood and spleen samples, in Ixodes trianguliceps and Ixodes persulcatus ticks taken from voles, and in collected by flagging adult I. persulcatus from three I. persulcatus/I. trianguliceps sympatric areas in the Omsk region. The revealed A. phagocytophilum samples were shown to belong to three A. phagocytophilum genetic groups previously identified in Russia. The results of this and previous studies let us to suppose that A. phagocytophilum of genetic groups 1 and 2 are transmitted to voles by I. persulcatus and I. trianguliceps ticks, correspondingly, while A. phagocytophilum of genetic group 3 is transmitted by I. persulcatus to chipmunks. Based on groESL operon, msp4 gene, and intergenic region DOV1 sequence analysis A. phagocytophilum of genetic group 2 is closely related to A. phagocytophilum isolates revealed in voles and I. trianguliceps in Europe, A. phagocytophilum of group 3 - to European A. phagocytophilum isolates from roe deer and I. ricinus, while A. phagocytophilum of group 2 significantly differ from known A. phagocytophilum sequences.

Keywords: Anaplasma phagocytophilum; Ixodes persulcatus; Ixodes trianguliceps; voles; genetic groups.

Молекулярно-генетические исследования

Введение. Переносимый иксодовыми клещами возбудитель гранулоцитарного анаплазмоза человека A. phagocytophilum отличается высокой генетической вариабельностью [8, 9]. В ряде работ показано наличие отдельных генетических линий A. phagocytophilum, различающихся по тропизму к переносчикам и позвоночным хозяевам, а также по патогенным свойствам [1, 4]. Нами ранее на территории России на основании анализа нуклеотидных последовательностей groESL оперона и гена 16S рРНК было выявлено три генетические группы A. phagocytophilum [6]. Анаплазмы группы 1 обнаружены в клещах I. persulcatus и мышевидных грызунах на территории различных областей России, анаплазмы группы 3 - в I. persulcatus и бурундуках, а анаплазмы группы 2 - только в мышевидных грызунах и землеройках на территории Северного Урала, но не в I. persulcatus. Поскольку анаплазмы группы 2 были обнаружены в области совместного обитания двух видов клешей

- I. persulcatus и I. trianguliceps, мы предположили, что I. trianguliceps может участвовать в переносе A. phagocytophilum группы 2 мелким млекопитающим.

Для проверки этого предположения были исследованы встречаемость и генетическая вариабельность A. phagocytophilum в клещах и мышевидных грызунах из трех участков на территории Омской области из области симпатрии I. persulcatus и I. trianguliceps.

Материалы и методы. Отлов грызунов и сбор клещей проводили на трех участках Омской области. На участке 1 (Тевризский район, южная тайга) сбор материала проводили в июне 2011 г., на участке 2 (Большеуковский район, граница подтайги и южной тайги) - в сентябре 2011 г. и на участке 3 (Знаменский район, южная тайга)

- в июле и сентябре 2013 г. Всего для последующего анализа были взяты образцы крови и/или селезенки от 211 полевок рода Clethrionomys; 437 собранных на флаг голодных имаго I. persulcatus; а также снятые с грызунов 61 нимф и имаго I. trianguliceps и 33 нимф I. persulcatus. Выявление ДНК A. phagocytophilum проводили методом ПЦР в режиме реалного времени с использованием наборов «РеалБест ДНК Anaplasma phagocytophilum/ Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffeensis» (ЗАО «Век-тор-Бест», Новосибирск), а также методом двух-раундовой ПЦР в присутствии родоспецифичных праймеров из области гена 16S рРНК [5]. Для последующего определения нуклеотидных последовательностей были также амплифицированы фрагменты groESL оперона, msp4 гена и DOV1 межгенной области, как описано ранее [1, 2, 3, 5]. Анализ полученных нуклеотидных последо-

вательностей выполняли с использованием программ CLUSTALW и В1аэШ.

Результаты и обсуждение. На наличие A. phagocytophilum были исследованы полевки и клещи из трех участков симпатрии I. persulcatus / I. trianguliceps, находящихся друг от друга на расстоянии более 60 км. ДНК A. phagocytophilum была выявлена в образцах от грызунов и клещей со всех трех исследованных участков. Было показано, что обнаруженные образцы анап-лазм относятся к трем генетическим группам A. phagocytophilum, ранее выявленным на территории азиатской части России [6].

Всего ДНК A. phagocytophilum была обнаружена в 35,5 % образцов от полевок, на разных участках доля инфицированных зверьков составляла 32,0-46,9 % (табл. 1). Анализ нуклеотид-ных последовательностей показал, что на всех участках более 75 % зверьков инфицированы A. phagocytophilum второй генетической группы, 7-25% зверьков содержат ДНК анаплазм первой генетической группы, и лишь одна полевка была инфицирована анаплазмами генетической группы 3 (табл. 2).

Таблица 1

Выявление ДНК А. phagocytophilum в образцах от клещей и грызунов методом двухраундовой ПЦР

Участок Источник выделения ДНК Кол-во образцов Кол-во (%) образцов, содержащих ДНК A. phagocytophilum

1 Clethrionomys эрр. 59 19 (32.2)

I. persulcatus с полевок 12 1 (8.3)

I. trianguliceps с полевок 19 6 (31.6)

I. persulcatus собранные на флаг 279 18 (6.5)

2 Clethrionomys эрр. 49 23 (46.9)

I. trianguliceps с полевок 15 7 (46.7)

3 Clethrionomys эрр. 103 33 (32,0)

I. persulcatus с полевок 21 3 (14,3)

I. trianguliceps с полевок 27 13 (48,1)

I. persulcatus собранные на флаг 158 3 (1,9)

Среди собранных на флаг I. persulcatus анаплазмы были обнаружены в 18 из 279 клещей с первого участка и в 3 из 158 клещей с третьего участка; все обнаруженные анаплазмы относились к генетической группе 3.

Анализ снятых с грызунов клещей показал, что на разных участках 8,3-14,3 % I. persulcatus и 31,6-48,1% I. trianguliceps содержит ДНК A. phagocytophilum. Нуклеотидные последовательности были определены для 13 инфицированных I. trianguliceps; было показано, что все они содержат ДНК анаплазм второй генетической группы (табл. 1, 2).

Для ряда образцов, относящихся к разным генетическим группам по groESL оперону, были

также определены нуклеотидные последовательности msp4 гена и DOV1 межгенной области. Определенные нуклеотидные последовательности по всем этим локусам были практически идентичны внутри каждой группы, но существенно различались между группами. Проведенный филогенетический анализ показал, что A. phagocytophilum генетической группы 2 наиболее схожи с европейскими изолятами A. phagocytophilum от грызунов и I. trianguliceps, а A. phagocytophilum генетической группы 3 - с европейскими изолятами от косуль и I. ricinus [1]. Анаплазмы генетической группы 1 существенно отличаются от известных последовательностей A. phagocytophilum, при этом они наиболее схожи с анаплазмами генетической группы 2, образуя с ними общие кластеры по всем исследованным генетическим локусам.

Таблица 2

Генотипирование образцов A. phagocytophilum по groESL оперону

Участок Источник выделения ДНК Кол-во образцов Генетические варианты

1 2 3 1+2

1 Clethrionomys spp. 16 3 11 1 1

I. Ыа^иИсеря с полевок 6 - 6 - -

I. регяикаШя собранные на флаг 18 - - 18 -

2 Clethrionomys spp. 20 2 18 - -

I. Ыа^иИсеря с полевок 7 - 7 - -

3 Myodes spp. 27 2 25 - -

I. регяикаШя собранные на флаг 3 - - 3 -

Таким образом, на всех трех исследованных в данной работе участках доля грызунов, инфицированных А. phagocytophilum была высока и превышала 30 %, что существенно выше по

сравнению с уровнем инфицированности грызунов (3-4%), обнаруженном ранее на территории Новосибирской области и Хабаровского края, где I. trianguliceps отсутствовал в популяции клещей [6]. Большинство исследованных образцов А. phagocytophilum от грызунов и все образцы от I. trianguliceps относились ко второй генетической группе. В I. persulcatus анаплазмы данной группы не были обнаружены, что подтверждает наше предположение об участии I. trianguliceps в передаче А. phagocytophilum из генетической группы 2 мелким млекопитающим.

По современным представлениям, А. phago-cytophilum представляет комплекс из различных генетических линий, которые могут циркулировать на одной территории, но различаться по тропизму к позвоночным хозяевам и переносчикам [4, 7]. В исследуемых в данной работе участках симпат-рии I. регяикаШя/1 trianguliceps были обнаружены три генетические группы А. phagocytophilum, циркулирующие одновременно на одних и тех же участках. Анаплазмы генетических групп 1 и 2 переносятся одним и тем же хозяевам - полевкам рода Clethrionomys, и их наиболее вероятными переносчиками являются клещи I. persulcatus и I. trianguliceps, соответственно. Анаплазмы генетических групп 1 и 3 переносятся одним и тем же видом клещей - I. persulcatus, но различаются по тропизму к хозяевам, а анаплазмы генетических групп 2 и 3 различаются между собой по тропизму и к переносчикам, и к хозяевам.

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 14-04-00567 и междисциплинарного интеграционного проекта № 135 фундаментальных исследований СО РАН.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Bown K.J., Lambin X., Ogden N.H., et al. Delineating Anaplasma phagocytophilum ecotypes in coexisting, discrete enzootic cycles // Emerg. Infect. Dis. 2009. V. 15. P. 1948-1954.

2. de la Fuente J., Massung R.F., Wong S.J., et al. Sequence analysis of the msp4 gene of Anaplasma phagocytophilum strains // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 1309-1317.

3. Liz J.S., Anderes L., Sumner J.W., et al. PCR detection of granulocytic ehrlichiae in Ixodes ricinus ticks and wild small mammals in western Switzerland // J. Clin. Microbiol. 2000. V. 38. P. 1002-1007.

4. Massung R.F., Priestley R.A., Miller N.J., et al. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice // J. Infect. Dis. 2003. V. 188. P. 1757-1763.

5. Rar V.A., Livanova N.N., Panov V.V., et al. Genetic diversity of Anaplasma and Ehrlichia in Asian part of Russia // Ticks Tick Borne Dis. 2010. V. 1, P. 57-65.

6. Rar V.A., Epikhina T.I., Livanova N.N., et al. Genetic variability of Anaplasma phagocytophilum in Ixodes persulcatus ticks and small mammals in the Asian part of Russia. Vector-Borne and Zoonotic Dis. 2011. Vol. 11. P. 1013-1021.

7. Reichard M.V., Roman R.M., Kocan K.M., et al. Inoculation of white-tailed deer (Odocoileus virginianus) with Ap-V1 or NY-18 strains of Anaplasma phagocytophilum and microscopic demonstration of Ap-V1 in Ixodes scapularis adults that acquired infection from deer as nymphs // Vector Borne Zoonotic Dis. 2009. Vol. 9. P. 565-568.

8. Scharf W., Schauer S., Freyburger F., Petrovec M., et al. Distinct host species correlate with Anaplasma phagocytophilum ankA gene clusters // J. Clin. Microbiol. 2011. Vol. 49. P. 790-796.

9. von Loewenich F.D., Baumgarten B.U., Schuppet K., et al. High diversity of ankA sequences of Anaplasma phagocytophilum among Ixodes ricinus ticks in Germany // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41. P. 5033-5040.

Молекулярно-генетические исследования

т

Рар Вера Александровна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Епихина Тамара Ивановна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Якименко Валерий Викторович - доктор биологических наук, заведующий лабораторией арбовирусных инфекций ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора

Малькова Марина Георгиевна - доктор биологических наук, доцент, главный научный сотрудник лаборатории арбовирусных инфекций ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора

танцев Алексей Константинович - научный сотрудник лаборатории зоонозных инфекций ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора

Макенов Марат Темирханович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории арбовирусных инфекций ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора

Бондаренко Евгений Иванович - кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории ПЦР ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск

Иванов Михаил Константинович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией ПЦР ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск

Тикунова Нина Викторовна - доктор биологических наук, доцент, заведующая лабораторией молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

© Коллектив авторов, 2014 Статья поступила в редакцию 3 октября 2014 г.

УДК 577.21:578.833.26

ОЦЕНКА ВНУТРИВИДОВОЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПРИ АНАЛИЗЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОДОНОВ У РАЗЛИЧНЫХ ПОДТИПОВ ВКЭ

Тюлько Ж.С.1, Якименко В.В.2 1Омская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Россия, 644043, Омск, ул. Ленина, 12 2ФБУН "Омский НИИ природно-очаговых инфекций" Роспотребнадзора; лаборатория арбовирусных инфекций ОПОВИ Россия, 644080, г. Омск, просп. Мира, 7; таЛ@опир1.о^

Вирус клещевого энцефалита, представлен тремя основными подтипами, имеющими широкое географическое распространение (дальневосточный, европейский, сибирский), и подтипами с ограниченным распространением (178-79 и 886-84). В этой работе была исследована стратегия использования синонимичных кодонов, как у основных подтипов, так и у отдельных геновариантов принадлежащих к дальневосточному и сибирскому подтипам. Для чего рассчитывались показатели относительного использования синонимичных кодонов, которые в дальнейшем изучались методами дискриминантного анализа. В итоге было показано различие в стратегиях кодирования не только между подтипами ВКЭ, но и между отдельными геновариантами, относящимися к одному и тому, же подтипу. Предполагается, что изменение стратегии кодирования аминокислот может быть начальным этапом микроэволюционного процесса у ВКЭ.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита; показатель относительного использования синонимичных кодонов; дискриминантный анализ; стратегия кодирования белков, микроэволюция.