CC BY
75
© Москвичева Я.Б., Петровский С.В., Г инак А.И., 2014
®
УДК 547.144.615.281 ББК 24.7
ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Москвичева Яна Борисовна
Аспирант кафедры молекулярной биотехнологии
Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) [email protected]
Московский проспект, 26, 190013 г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Петровский Станислав Викторович
Аспирант кафедры молекулярной биотехнологии
Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) [email protected]
Московский проспект, 26, 190013 г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Гинак Анатолий Иосифович
Доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) [email protected]
Московский проспект, 26, 190013 г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Аннотация. Изучали взаимодействие окисленных циклических декстранов-цик-лодекстрина (далее - ЦД) с белком - бактериальной стрептокиназой. При максимальном молярном трехсоткратном избытке ЦД молекулярная масса коньюгата стрепто-киназы с циклодекстрином достигает 65 кД, причем с одной макромолекулярной стреп-токиназы связывается 14 остатков ЦД.
Включение аденозина в конъюгат стрептокиназы с ЦД приводит к образованию тройного комплекса, где один остаток циклодекстрина поглощает одну молекулу аденозина.
Ключевые слова: циклодекстрин, стрептокиназа, аденозин, химическая модификация, гель-хроматография, окисление олигосахаридов, комплексы.
Известно, что стрептокиназа [К.Ф.3.4.99.22] - бактериальный белок, обладающий тромболитической активностью [6].
Ранее подробно описан процесс химической модификации стрептокиназы окисленным декстраном [2].
В некоторых случаях тромболитической терапии целесообразно сочетать такой курс
лечения с применением вазодилятаторов. Так, аденозин оказывает отчетливое сосудорасширяющее действие. Аденозин участвует в обменных процессах, усиливает ресинтез АТФ в миокарде при ишемии, оказывает коронаро-расширяющее действие, что позволяет рекомендовать аденозин в качестве гипотензивного антиаритмического средства [5].
Представляло интерес осуществить такую модификацию стрептокиназы, которая бы позволила сочетать в препарате тромболити-ческую активность и гипотензивное действие.
В качестве модифицирующего агента мы выбрали окисленный олигосахарид. Взаимодействие белков с окисленными декстранами -хорошо изученный процесс [3]. Здесь мы выбрали в качестве олигосахарида у-циклодекст-рин, являющийся циклическим олигосахаридом с молекулярной массой равной 1298 Да. Циклодекстрины способны включать в свою внутреннюю полость малые молекулы.
Нами использован метод иммобилизации при включении в у-циклодекстрин аденозина (Ад). Предварительно у-циклодекстрин (у-ЦД) окисляли периодатом калия и затем химически связывали с белком стрептокиназой (СК) в условиях, аналогичных тем, в которых была изучена химическая модификация стрептоки-назы окисленным декстраном [1].
В водном растворе СК представляет глобулу с радиусом Стокса равным 31,1 Ао. Концентрацию белка СК в растворе определяли по оптической плотности в ультрафиолетовой области спектра, используя приведенные значения удельного коэффициента поглощения
е Т"™ =8,8 и е 0'277 = 0,98 [4]. Спектральные
. А280
характеристики растворов исследовали с помощью спектрофотометра НйасЫ и-2900 производства Японии.
В качестве олигомера-модификатора использовали у-ЦД фирмы «РЬатаІес. Jnc.»
Количество ковалентных связей в конъюгатах, образованных между стрептокиназой и окисленным у-циклодекстрином, определяли по убыли свободных аминогрупп в конъюгатах по сравнению с нативным белком.
у-циклодекстрин окисляли периодатом калия. Реакцию проводили в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Количество пери-одата калия, необходимое для окисления ЦД, рассчитывали по уравнению реакции: у-ЦД + Ю4 ® у-ЦД (окисленный) +
+ ГО3 - НСОО - Н2О
3 + 2
Активация ЦД заключалась в окислении его глюкопиранозных звеньев с образованием свободных альдегидных групп с помощью
калия йоднокислого мета. Перед проведением реакции химического связывания активированного ЦД со СК проводили его очистку от избытка ионов окислителя JО- и образовавшихся ионов JО3.
Для этой цели использовали слабоосновный анионит типа АРА. Анионит предварительно переводили в ацетатную форму с помощью
0,5 М раствора уксусной кислоты.
Определение содержания альдегидных групп в окисленном ЦД, а также в восстановленных препаратах основано на реакции этих групп с солянокислым гидроксиламином. При этом взаимодействии выделяется соляная кислота, которую оттитровывают стандартным раствором №ОН и по количеству щелочи, пошедшей на титрование, рассчитывают содержание альдегидных групп [1].
Контроль за степенью модификации СК осуществляли с помощью метода гель-хроматографии. Хроматографию проводили на стеклянной колонке объемом 100 мл, заполненной гелем Сефадекс G-200 в качестве неподвижной фазы.
В качестве элюента на колонку подавался физиологический раствор со скоростью 5 мл/час. Под действием потока подвижной фазы вещества, нанесенные на колонку, перемещаются вдоль нее с различными скоростями, величины которых обратно пропорциональны коэффициенту распределения (Кау) хроматографируемых веществ, причем чем меньше размер молекулы, тем больше К
Для калибровки колонки использовали набор фирмы Serva со стандартизованными белками известной молекулярной массы (Мм).
Коэффициент распределения определяли по формуле:
Каю V - V ,
У т У 0
где V - максимальный объем удерживания, соответствующий веществу полностью включенному в гранулы геля (фенилаланин, Vm=100 мл); V1 - объем удерживания исследуемого вещества; V0 - свободный объем данной колонки, определяемый веществом, полностью исключенным из гранул геля (голубой декстран, V0 =40 мл);
В таблице 1 приведены результаты калибровки колонки с Сефадексом G-200. На
рисунке 1 приведена зависимость Кау от величины ^ (Мм).
За степень окисления у-ЦД принимали величину, численно равную количеству пар альдегидных групп, приходящихся на 100 элементарных звеньев а^-глюкозы.
Определение количества свободных аминогрупп и степени модификации белка (а) проводили спектрофотометрически с помощью 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты (ТНБС). Калибровочную прямую строили по растворам глицина. Степень модификации рассчитывали на основе 3-5 измерений оптической плотности растворов с различными концентрациями белка. Результаты измерений а рассчитывали как долю аминогрупп, вступивших в реакцию образования ковалентных
связей с олигомерной матрицей от общего числа свободных аминогрупп исходной СК.
При определении концентрации вещества в растворе спектрофотометрическими методами погрешность определения составляла < 5 %.
Содержание альдегидных групп по результатам иодометрического титрования определяется с погрешностью 10 %. Погрешность определения степени модификации СК с помощью ТНБС составляет 3-5 %.
Погрешность определения молекулярных масс по данным гель-хроматографии составила 15 %.
Модификацию стрептокиназы окисленным очищенным ЦД проводили в 0,5 М содовом буферном растворе при рН 9,5 в течение
Таблица 1
Объемы удерживания и коэффициенты распределения веществ с известной молекулярной массой на колонке с Сефадексом G-200 в 0,9 % ^О,
объем геля V = 100 мл
№ Наименование Молекулярная масса (Мм), Да Объем удерживания, мл ^ (Мм)
1 Г олубой декстран 2 000 000 40 - -
2 Бычий сывороточный альбумин 66 000 65 0,42 4,8
3 С тр ептокиназа 47 300 69 0,49 4,7
4 Химо трипс иноге н 25 000 77 0,62 4,4
5 Цитохром С 12 400 84 0,73 4,1
6 Фенилаланин 165 100 - -
0,2 I 1 ! —|—Н— ! ! 1— ! ! I 1 — ! I 1 ——1—! I 1 ! —Ч
3,8 4 4,2 4,4 4,6 4,8 5 5,2 ^(Мм)
Рис. 1. Зависимость коэффициента распределения белков (К ) с известной молекулярной массой
от величины ^ (Мм)
1 часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании. В результате взаимодействия е-аминогрупп лизиновых остатков белка с альдегидными группами окисленного у-ЦД образуется высокомолекулярный продукт СК-ЦД, содержащий неустойчивые двойные С=^связи (основание Шиффа).
Для восстановление двойных связей С=N вносили в реакционную смесь двукратный молярный избыток боргидрида № или К. При этом происходит стабилизация двойных связей с превращением их в одинарные, а непрореагировавших (избыточных) альдегидных групп декстрана в спиртовые.
Очистку, деминерализацию и концентрирование модифицированного раствора СК проводили на ультрафильтрационной установке Vivaflow 200, используя мембранный модуль 5 кДа HYS.
Деминерализацию проводили 4 раза десятикратным объемом очищенной воды. Контроль за степенью очистки вели спектрофотометрически по оптической плотности ^235) при длине волны 1 = 235 нм, добиваясь ее значения ниже 0,25 в кювете 1 см.
Для исследования связывания СК с окисленным г-циклодекстрином использовали препарат у-ЦД со степенью окисления 10,1 %. В таблице 2 приведены исходные соотношения СК и окисленного у-ЦД в реакционной среде и характеристика полученного продук-
та модифицированной СК. В последнем столбце приведены рассчитанные молекулярные массы модифицированной СК. При максимальном молярном трехсоткратном избытке у-ЦД в реакционной среде молекулярная масса конъюгата достигает 65 кД, причем на одну макромолекулу СК оказывается присоединенным до 14 остатков у-ЦД. Объемы удерживания полученных продуктов систематически снижаются при увеличении степени модификации СК, но это снижение не очень сильно выражено.
Получение тройного комплекса СК-ЦД-Ад проводили с модифицированной СК, полученной при десятикратном массовом избытке у-ЦД (см. табл. 2, строка 1).
Полученную на первом этапе модифицированную СК-ЦД после очистки высушивали лиофильно. Включение Ад в полученный препарат модифицированной СК проводили, растворяя 100 мг препарата СК-ЦД в 10 мл 0,01 М №2С03 при рН = 11,05. Затем в полученный раствор внесли 0,2 ммоль (54,3 мг) аденозина. Смесь выдерживали 1 час при температуре 20 ± 2 оС и хроматографировали на колонке с сефадексом G-10. 100 мг препарата СК-ЦД соответствует 1,53 • 10-3 ммоль модифицированной СК, причем ЦД в этом препарате содержится 0,02 ммоль. Таким образом избыток Ад по отношению к количеству ЦД в растворе составляет 0,2 ммоль
Таблица 2
Условия химической модификации стрептокиназы окисленным
у-циклодекстрином
№ п/п Исходное соотношение СК и у-ЦД в реакционной среде СК : ЦД Объем удержания (Гмл), мл Соотношения в конечном продукте СК : ЦД, моль/моль Степень модифи- кации (а), % КаV Рассчитанная молекулярная масса
Мм (Мм)
мг/мг моль/моль
1 1 10 1 364 66 1 14 44 0,43 65 472 4,82
2 1 5 1 182 66 1 14 44 0,43 65 472 4,82
3 1 1 1 36 68 1 8 25 0,45 57 684 4,76
4 1 0,5 1 18 68 1 6 19 0,49 55 088 4,74
5 1 0 1 0 69 1 0 0 0,49 47 300 4,70
Примечание. СК - стрептокиназа; у-ЦД - циклодекстрин; V - объем удерживания модифицированной СК.
Ад на 0,02 ммоль ЦД, входящего в структуру СК-ЦД.
Колонка с Сефадексом G-10 диаметром 1,3 см и высотой 15 см содержала 64 мл набухшего геля G-10. Скорость элюции составляла 26,5 мл/час ■ см2. Объем удерживания голубого декстрана составлял 27 мл, тирозина - 60 мл. На колонку с Сефадексом G-10 нанесли 10 мл приготовленного ранее раствора СК-ЦД-Ад в содовом буфере. Собрали высокомолекулярную фракцию, соответствующую объему удерживания голубого декстра-на, в объеме 30 мл.
Если предположить, что потери модифицированной СК при хроматографии на колонке с Сефадексом G-10 отстутствовали, то ее концентрация составила в собранной фракции
0,51 ■ 10-4 ммоль/мл.
Спектр поглощения СК в указанной концентрации показан на рисунке 2 (1). Спектр у-ЦД приведен на рисунке 2 (2). На рисунке 2 (3) приведен спектр Ад. Видно, что в зоне максимума поглощения Ад при длине волны 1=259 нм СК и полиглюкин практически не вносят заметный вклад в оптическую плотность.
Таким образом, замерив оптическую плотность раствора модифицированной СК и Ад можно при длине волны 1=259 нм определить концентрацию Ад в растворе высокомолекулярной фракции, то есть рассчитать количественно Ад, включенного в модифицированную СК. Предварительно определив оптическую плотность контрольного раствора Ад, расчетным путем нашли, что соотношение Ад и СК-ЦД в полученном растворе соответствует одному молю Ад, включенному в один моль ЦД (см. табл. 3).
(1)
(2)
(3)
Рис. 2. Спектральные характеристики модифицированной стрептокиназы (1), у-ЦД (2) и аденозина (3)
Таблица 3
Характеристика модельной смеси модифицированной СК в присутствии Ад в соотношении СК-ЦД 0,003 ммоль/л : Ад 0,044 ммоль/л (1:14)
Название вещества Концентрация вещества С, моль/л Оптическая плотность D * Оптическая плотность D **
Стрептокиназа 0,003 0,050 0,050
Аденозин 0,044 0,695 0,695
Стрептокиназа + аденозин 0,003 : 0,044 0,735 0,685
у-ЦД 0,044 *** 0 0
Примечание. D* - оптическая плотность при 1 =259 нм; D** - оптическая плотность с учетом плотности стрептокиназы при 1 =259 нм; *** - концентрация у-ЦД (рассчитано из молекулярной массы 1 звена).
В заключение можно отметить, что циклодекстрин, связанный с белком стрептоки-назой в результате взаимодействия окисленных глюкопиранозных звеньев с аминогруппами белка, сохраняет способность поглощать малые молекулы в свою внутреннюю полость.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. А. с. 1371004 СССР. Способ получения иммобилизованной стрептокиназы / Москвичев Б. В., Таратина Т. М., Иванова Г. П. [и др.] (СССР).
2. Москвичев, Б. В. Иммобилизованные ферменты в медицине и медицинской промышленности / Б. В. Москвичев, М. С. Поляк. - М. : Медбиоэ-кономика, 1983. - С. 51-71.
3. Пат. 1622986 Российская Федерация, Способ получения препарата Терридеказа, обладающего протеолитической активностью для парентерального введения / Москвичев Б. В., Иванова Г. П., Таратина Т. М., Безъязычная Т. С., Гринберг Г.Е. ; заявитель и патентообладатель ВНИТИ Антибиотиков и ферментов медицинского назначения. -Приоритет - прекратил действие 24.12.1994 ; опубл. 1997, Бюл. №> 11.
4. Conformational properties of streptokinase-differential scanning calorimetric investigations / K. Welfle et al. // International Journal Biological - Macromolecules 14. - 1992. - P. 19-22.
5. Munoz, A. Arch. Intern. Physiol. Cardiovascular Pharmacotherapy International Symposium / A. Munoz et al. // Int. Symp. - 1985. - J№ 45 - Р. 37-39.
6. Yoshinori, M. Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods / M. Yoshinori, H. K. Wong, B. Jiang // Food Research International. - 2005. -Vol. 38. - Iss. 3. - P 243-250.
REFERENCES
1. Moskvichev B.V, Taratina T.M., Ivanova G.P., etc. (USSR). Sposob polucheniya immobilizovannoy streptokinazy [The Way of Manufacturing the Immobilized Streptokinase]. A. s. 1371004 USSR.
2. Moskvichev B.V., Polyak M.S. Immobilizovannye fermenty v meditsine i meditsinskoy promyshlennosti [The Immobilized Enzymes in Medicine and Medical Industry]. Moscow, Medbioekonomika Pabl., 1983, pp. 51-71.
3. Moskvichev B.V, Ivanov G.P., Taratina T.M., etc. Sposob polucheniya preparata Terridekaza, obladayushchego proteolicheskoy aktivnostyu dlya parenteralnogo vvedeniya [The Way of Receiving the Terridekaz Substance Possessing the Proteolytic Activity for Parenteral Introduction]. Pat. RF 1622986. 1997, byul. no. 11.
4. Welfle K., e. a. Conformational properties of streptokinase-differential scanning calorimetric investigations. International Journal Biological -Macromolecules 14, 1992, pp. 19-22.
5. Munoz A., e. a. Arch. Intern. Physiol. Cardiovascular Pharmacotherapy International Symposium. Int. Symp., 1985, no. 45, pp 37-39.
6. Yoshinori M. Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods. Food Research International, 2005, vol. 38, iss. 3, pp. 243-250.
MULTIFUNCTIONAL MODIFICATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES
Moskvicheva Yana Borisovna
Postgraduate Student, Department of Molecular Biotechnology,
Saint Petersburg State Technological Institute (Technical University) [email protected]
Moskovskiy Prospect, 26, 190013 Saint Petersburg, Russian Federation
Petrovskiy Stanislav Viktorovich
Postgraduate Student, Department of Molecular Biotechnology,
Saint Petersburg State Technological Institute (Technical University) [email protected]
Moskovskiy Prospect, 26, 190013 Saint Petersburg, Russian Federation
Ginak Anatoliy Iosifovich
Doctor of Chemical Sciences, Professor,
Head of the Department of Molecular Biotechnology,
Saint Petersburg State Technological Institute (Technical University) [email protected]
Moskovskiy Prospect, 26, 190013 Saint Petersburg, Russian Federation
Abstract. The article studies the interracting of oxidized cyclic cyclodextrin dextrans (CD) with the protein - bacterial streptokinase. The oxidation was carried out with potassium periodate; free aldehyde groups were formed in CD molecule during this process. Excess of potassium periodate was removed on a column using ion - exchange resin (anionite APA with acetate ion). Reaction between streptokinase and oxidized cyclic dextran was monitored by gel-permation chromatography (sephadex G-200). The mass of complex of streptokinase with exciding cyclodextrin goes up to 65 kDa (the ratio by moles is 1-3). One streptokinase macromolecule is bound to 14 molecules of CD. It was shown that the chemical reaction between streptokinase and cyclodextrin proceeded in a way which is similar to its reaction with oxidized linear dextrans.
It was found that protein-bound CD retained the ability to absorb small molecules like adenosine in its inner shell. The complex of streptokinase with CD absorbs the molecule of adenosine and forms a new complex with adenosine intercalated in cyclodextrin part of the new complex.
Key words: cyclodextrin, streptokinase, adenosine, chemical modification, gel-chromatography, oxidation of oligosaccharides, complex.
