CC BY
30
Бионанотехнологии и нанобиоматериаловедение
УДК 57.013, 543.63
2
А. К. Барсуков, канд. биол. наук, Е. В. Юрченко, соискатель,
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет», г. Ижевск
Оптимизация условий гидролиза совиаля для конструирования модифицированных форм белков
Ключевые слова: сополимеры, полимер-белковые конъюгаты, оптимизация условий процесса, спектроскопия, эсклюзионная хроматография, альдегиды, диацетали.
Key words: copolymers, protein-polymeric conjugates, process conditions optimisation, spectroscopy, liquid chroma-tography, aldehydes, duoacetals.
Выполнен качественный и количественный анализ при исследовании эффективности кислотного гидролиза как способа индукции альдегидных групп в составе совиаля — сополимера винилпирролидона с диацеталем акролеина. Установлено, что альдегидсодержащая (активированная) и нативная формы совиаля имеют сходные параметры выхода в условиях колоночной хроматографии на геле БерНасгу1-В200. Возрастание интенсивности поглощения активированной формы совиаля в диапазоне длин волн 190—260 нм предлагается использовать в качестве контрольной точки при масштабировании стадии синтеза белок-сополимерных конъюга-тов.
Введение
Проблематика обеспечения вирусной безопасности фармацевтических биопрепаратов плазмы приобрела в XXI веке глобальный характер [1]. В рекомендациях ВОЗ предлагается сконцентрировать усилия на разработке методов и технологий инактивации вирусных агентов на разных стадиях производственного процесса. Создание модифицированных форм физиологически активных белков, устойчивых к термохимическому воздействию, может стать предпосылкой разработки технологии производства фармацевтических биопрепаратов с надлежащим уровнем инфекционной безопасности [2].
Из спектра полимеров-модификаторов наибольший практический интерес представляют производные поливинилпирролидона и, в частности, сополимер винилпирролидона с диацеталем акролеина (далее совиаль), обладающий низкой токсичностью, биосовместимостью и другими регистрируемыми свойствами безопасности в соответствии с требованиями медико-биологических стандартов, предъявляемыми к лекарственным средствам [3].
После индукции альдегидных групп совиаль способен вступать в реакцию поликонденсации, например с депротонированными е-аминогруппами остатков лизина в составе белковой макромолекулы. Химерные структуры белок—совиаль имеют повышенный уровень терморезистентности [2]. Полагаем, что развитие исследований в данном направлении позволит создать предпосылки для совершенствования принципов инактивации потенциально-возможных вирусных частиц в составе фармбио-препаратов за счет производства терморезистентных химерных структур, представленных физиологически активными белками, модифицированными совиалем.
С учетом изложенного была поставлена цель — оптимизировать условия индукции альдегидных групп в составе совиаля в условиях, приближенных к технико-технологическому оформлению производства фармацевтических биопрепаратов.
Основная часть
В работе использовался совиаль, любезно предоставленный ФГБУН «Институт высокомолекулярных соединений РАН» Санкт-Петербурга. Известно, что реакционноспособные альдегидные группы на молекуле совиаля возможно индуцировать кислотным гидролизом в водно-спиртовом растворе [5].
Однако при разработке производственных технологий нежелательно использование пожаро- и взрывоопасных комплектующих. С технологических позиций применение сильных катионообменных смол на стадии активирования совиаля не отвечает принципам экономической целесообразности серийного производства модифицированных форм белков. Нами была апробирована методика индукции альдегидных групп за счет гидролиза совиаля в водных растворах соляной кислоты.
Для гидролиза использовались водные растворы соляной кислоты с концентрациями 0,005 моль/л; 0,01 моль/л; 0,05 моль/л; 0,1 моль/л и 0,5 моль/л.
биотехносфера
| № 1 (193/2012
21
Бионанотехнологии и нанобиоматериаловедение
Процесс гидролиза осуществляли в течение 2 ч при температуре 100 °С. Полагаем, что такой исследовательский подход позволяет сохранить принципиальную схему производства, основанную на нехроматографических стадиях фракционирования коллоидных растворов, сложных по белковому составу. В проектировании технологических нововведений планируемое изменение касается всего лишь одной стадии — режима термохимической инактивации потенциально возможных вирусных агентов, которая выполняется на основе стандартной аппаратурной комплектации, предназначенной для обеспечения пастеризации субстанций альбумина.
Образование альдегидных групп, индуцированных гидролизом в составе совиаля, подтверждали с помощью инфракрасной спектроскопии [5]. Спектры нативного и активированного совиаля (рис. 1) снимали на приборе ИКС-29 (ЛОМО) в диапазоне частот 400—4200 см-1. Образцы для исследований готовили в форме пленок, на подложках из калий-бромидного стекла.
Известно, что функциональные группы атомов, такие как С=О; С=С или СН3 поглощают при постоянных длинах волн независимо от обобщенной структуры молекулы, в состав которой они входят. С учетом изложенного были выбраны спектры
а)
1100 1000
2100 1800 1500 1200
б) 1100 1000 жщщщщш5
т ша 2100 1800
1500
1200
в средней области диапазона длин волн соответственно 400-1400 и 1200-4200 см-1. В спектре нативного совиаля при частоте 1060 см-1 присутствует полоса характерная для ацеталей. После активирования в спектре совиаля регистрировалась полоса поглощения при частоте 1710 см-1, свойственная альдегидной группе. Поглощение ацеталей, зарегистрированное в спектре нативного совиаля, в спектре активированного совиаля не обнаружено.
Полученные результаты позволяют утверждать, что водные растворы соляной кислоты, не содержащие этанола либо метанола, в условиях нагревания до 100 °С в течение 2 ч, способны в принципе трансформировать диацеталь акролеинового звена в реакционноспособную альдегидную группу.
Процент трансформации диацеталей акроле-иновых звеньев в альдегидные группы определяли титрованием растворами сульфита натрия и ги-дроксиламина гидрохлорида [6].
Известно, что в составе совиаля на акролеиновое звено и винилпирролидон приходятся соответственно 16 и 84 мольных процента. Молекулярная масса сополимера 33 кДа. Исходя из этих данных, было рассчитано количество звеньев, потенциально способных к трансформации в альдегидные группы, которое и было принято за 100 %.
При определении альдегидных групп в составе совиаля на основе титрования раствором гидро-ксиламина гидрохлорида не выявлено достоверных различий, зависящих от концентрации соляной кислоты, использованной на стадии гидролиза (результаты не приводятся). Ниже, в табл. 1, приведены результаты, полученные титрованием образцов активированного совиаля раствором сульфита натрия.
Методика, основанная на взаимодействии альдегидов с сульфитом натрия, позволяет установить зависимость количества индуцированных альдегидных групп от концентрации соляной кислоты. С увеличением концентрации соляной кислоты до 0,1 и 0,5 моль/л регистрируются практически все потенциально возможные альдегидные группы в составе совиаля.
В литературе обсуждаются особенности и ограничения использованных нами методов количественного определения альдегидных групп [6]. Отмечается, что в реакции альдегидов с гидрохлоридом гидрок-
Рис. 1
Инфракрасные спектры совиаля до (а) и после (б) активации
Таблица 1 Индукция альдегидных групп в составе
совиаля в зависимости от концентра-
ции соляной кислоты, использованном
при гидролизе акролеинового звена
Концентрация НС1, Трансформация диацеталей
(моль/л) в альдегидные группы (М ± т, %)
0 0
0,001 54,34 ± 2,6
0,005 58,73 ± 3,15
0,01 54,9 ± 2,86
0,05 83,43 ± 2,55
0,1 100,19 ± 1,82
0,5 99,58 ± 3,23
П р и м е ч а н и е. М — среднее арифметическое значение;
т — средняя ошибка среднего арифметического.
№ 1 (193/2012 |
биотехносфера
Бионанотехнологии и нанобиоматериаловедение
27
оп
0,500 0,400 0,300 0,200 0,100
150 200 250 300
Длина волны, нм
350
400
Рис. 2
Значения оптических плотностей совиаля до (1) и после (2) активации в диапазоне 190—400 нм
силамина конечные продукты способствуют протеканию реакции в обратном направлении. В частности, рекомендуется для повышения точности и надежности количественного анализа проводить титрование в условиях потенциометрического контроля процесса [6]. Для сульфитной методики ограничения касаются нестабильности раствора основного реагента, который не может храниться длительное время, и его следует использовать в свежеприготовленной форме.
Спектры нативного и активированного совиаля в ультрафиолетовой части спектра получали с помощью СФ-46 (ЛОМО, Россия) в спектральном диапазоне длин волн 190—655 нм. В области длин волн 190—260 нм зарегистрировано повышение оптической плотности (примерно в 6 раз), характерное для активированного совиаля (рис. 2).
В этой области ультрафиолетовой части диапазона способны поглощать альдегидные группы, что обусловлено п—п-переходом неподеленной пары электронов атома кислорода. С целью выявления оптически активной составляющей образцы на-тивного и активированного совиаля подвергали эсклюзионной хроматографии.
оптические характеристики активированного совиаля анализировали в режиме гель-фильтрации в колоночном варианте эсклюзионной хроматографии на геле Sephadex G15.
Колонку (диаметром 0,9 см и высотой 15 см) упаковывали гелем Sephadex G15, уравновешивали 0,15 моль/л раствором хлорида натрия до объема сорбента 15 мл. В качестве калибрантов использовали растворы Blue Dextran и мертиоля-та. Объемы анализируемых образцов калибрантов, нативного или активированного совиаля составили по 0,5 мл. Хроматографические фракции объемами по 0,5 мл собирали в отдельные пробирки при общем объеме пропущенного через систему элюента 30 мл. Профиль хроматографического процесса образцов совиаля анализировали с йодным реагентом при длине волны 460 нм и в ультрафиолетовой области при длине волны 220 нм. Результаты исследований приведены в табл. 2.
Отметим, что используемый нами режим гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G15 позволяет
фракционировать глобулярные белки с молекулярной массой не более 15 кДа. Для образцов совиаля с молекулярной массой 33 кДа основная масса индивидуальных сополимеров должна выходить в свободном объеме геля. В общем объеме геля будут выходить низкомолекулярные составляющие сополимера, в том числе потенциально возможные технологические примеси, оставшиеся от стадии синтеза совиаля. С учетом изложенного профиль хроматографического процесса активированного со-виаля дополнительно анализировали в ультрафиолете при длине волны 220 нм.
Как следует из приведенных в табл. 2 данных, и нативный, и активированный совиаль выходят в свободном объеме колонки. При этом активированный совиаль дополнительно регистрируется в ультрафиолетовой области также в форме пика, только в свободном объеме колонки. Следовательно, изменение интенсивности поглощения активированного совиаля в ультрафиолетовой области спектра связано с макро-молекулярной фракцией сополимера, конформация которой соответствует белкам с молекулярной массой более 15 кДа.
Особенности молекулярного состава совиаля анализировали в колоночном варианте хроматографии низкого давления на геле сефакрила 8-200. Колонку с площадью поперечного сечения 4,67 см2 упаковывали гелем 8ерЬасгу1 8-200 и уравновешивали 0,15 моль/л раствором хлорида натрия до высоты столба сорбента 76,5 см. С целью определения свободного и общего объема сорбента использовали растворы голубого декстрана и мертиолята. Собирались фракции обемом 4,0 мл. Общий объем про-
Таблица 2
Анализ профилей хроматографического процесса фракционирования образцов совиаля с целью определения объема выхода составляющей сополимера, оптически активной при длине волны 220 нм
Образец
Blue Dextran
Мертиолят
Нативный совиаль
Активированный совиаль
Объем выхода пика по максимуму поглощения (M ± m, мл)
6,5 ± 0,3
15,0 ± 1,0 6,5 ± 0,4
6,5 ± 0,3
Дополнительная информация
Профиль хроматографического процесса регистрировали по ОП 280 нм
То же
Профиль хроматографи-ческого процесса регистрировали по ОП 460 нм с йодным реагентом
Профиль хроматографи-ческого процесса регистрировали по ОП 460 нм с йодным реагентом и по ОП 220 нм
П р и м е ч а н и е. М — среднее арифметическое значение; т — средняя ошибка среднего арифметического; ОП 220 нм, 280 нм и ОП 460 нм — оптические плотности элюата при длинах волн 220, 280 и 460 нм соответственно; ОП — оптическая плотность
биотехносфера
| № 1 (193/2012
2!
Бионанотехнологии и нанобиоматериаловедение
Таблица 3
Анализ профилей хроматографического процесса с целью определения особенностей молекулярного состава совиаля
Образец
Blue Dextran
Мертиолят Нативный
Активированный совиаль
Сывороточный альбумин человека
Объем выхода пика по максимуму поглощения (M ± m, мл)
150 ± 4
360 ± 8 238 ± 8
240 ± 8 236 ± 8
Дополнительная информация
Профиль хроматографического процесса регистрировали по ОП 280 нм
То же
Профиль хроматографи-ческого процесса регистрировали по ОП 460 нм с йодным реагентом
То же
Профиль хроматографи-ческого процесса регистрировали по ОП 280 нм
П р и м е ч а н и е. М — среднее арифметическое значение; ±т — средняя ошибка среднего арифметического; ОП 280 нм и ОП 460 нм — оптические плотности элюата при длинах волн 280 и 460 нм соответственно; ОП — оптическая плотность
пущенного через систему элюента составил два объема колонки.
Для сравнения особенностей хроматографиче-ского фракционирования искусственного сополимера и белковых макромолекул использовали альбумин, который выделяли из плазмы крови по ранее опубликованному методу [7].
На рис. 3 приводятся профили альбумина и со-виаля, регистрируемые соответственно по ОП280 и ОП460, как это было изложено выше. Анализ хро-матографических профилей представлен в табл. 3.
Известно, что альбумин и совиаль по своим структурно-конформационным характеристикам существенно различаются. Искусственные полимеры, включая совиаль, как правило, не формируют
ОП 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5
0
100
200 300
Объем выхода, мл
400
Рис. 3
Хроматографические профили альбумина (1), нашивного (2) и активированного (3) совиаля
вторичной структуры, т. е. они присутствуют в растворе в виде статистических клубков. В частности, для гомологичного ряда линейных молекул полимеров можно считать установленным, что плотность клубка не зависит от молекулярного веса (массы), так как по мере увеличения молекулярной массы размеры (конформация) тоже возрастают. Совиаль содержит множество индивидуальных компонентов с близкими конформациями (молекулярными массами), о чем свидетельствует ширина хроматогра-фического пика. Объемы выхода совиаля (33 кДа) и альбумина (65 кДа) совпадают, однако по ранее приведенным причинам из этого не следует вывод о равенстве их молекулярных масс. При этом селективность хроматографического процесса фракционирования совиаля, обусловленная множеством индивидуальных сополимеров, не позволяет планировать стадию очистки конъюгированных форм белка на основе использования эсклюзионных сорбентов.
Заключение
Результаты инфракрасной спектроскопии и количественного определения альдегидных групп позволяют утверждать, что инкубирование совиаля в 0,05—0,1 моль/л растворах соляной кислоты при температуре 100 °С в течение 2 ч является достаточным условием для индукции максимального количества функционально активных альдегидных групп.
Увеличение оптической плотности растворов совиаля в диапазоне длин волн 190—260 нм, индуцированное кислотным гидролизом, целесообразно использовать для оценки стадии активирования сополимера в прикладных исследованиях и научно-технических разработках.
I Литература I
1. Панов В. П. Принципы обеспечения вирусной безопасности препаратов крови // Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38. № 3. С. 39-47.
2. Патент № 2414237. Модификация альбумина совиалем как способ повышения его стабильности для производства фармацевтического биопрепарата альбумина в комплексе с гентамицином и стимаденом / А. К. Барсуков. Опубл. 20.03.11; Бюл. № 8.
3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Руководство по проведению клинических исследований новых лекарственных средств. В 2 т.; Под ред. Р. У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. 832 с.
4. А. с. № 56042. Способ получения водорастворимых полимеров, содержащих альдегидные группы / И. И. Гав-рилова, Е. Ф. Панарин. Опубл. 08.02.1977.
5. Панарин Е. Ф., Гаврилова И. И., Нестеров В. В. // Синтез и свойства сополимеров винилпирролидона с диацеталем акролеина // Высокомолекулярные соединения. 1977. № 8. С. 66-69.
6. Сиггиа С., Ханна Дж. Г. Количественный органический анализ по функциональным группам. М.: Химия, 1983. 672 с.
7. Выделение белков-стандартов иммуноглобулина С и альбумина, изучение их олигомеризации и антигенных свойств в процессе хранения в насыщенном растворе сульфата аммония / А. К. Барсуков, А. В. Бармин, А. И. Кузнецов, О. Ю. Нестерова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. № 3. С. 378-383.
совиаль
№ 1 (193/2012 I
биотехносфера
