CC BY
127
EXPERIMENTAL ARTICLES
УДК 577.151.4
АКТИВАЦИЯ ПЛАЗМИНОГЕНА
«_» __________ ___________ «_»
НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОИ СТРЕПТОКИНАЗОИ И ЭФФЕКТ ФИБРИНА
Е. И. Юсова Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
Получено 09.12.2013
Целью работы было изучение плазминогенактиваторной активности 36-кДа фрагмента стрепто-киназы, влияния на этот процесс desAB-фибрина, а также низкомолекулярной стрептокиназы на каталитические свойства плазмина.
Фрагмент стрептокиназы с молекулярной массой 36 кДа, у которого отсутствуют 63 N-и 34 С-концевых аминокислотных остатка, получали из химотрипсинового гидролизата нативной стрептокиназы препаративным электрофорезом. Показано, что этот фрагмент активирует Glu-плазминоген в растворе только при высоких концентрациях реагирующих компонентов (2 ■ 10-7 М). Процесс активации начинается после длительного лаг-периода и происходит в 100 раз медленнее по сравнению с нативной стрептокиназой. В отличие от нативной Glu-формы, активация частично деградированной Lys-формы проэнзима и мини-плазминогена (Уа1442-плазминоген) происходит при значительно более низкой концентрации протеинов (510-8 М), при этом скорость реакции с мини-плазминогеном на порядок выше, чем с Lys-плазминогеном, и равна 4,310-2 и 5,010-3 оп.
ед.-мин1 соответственно. DesAB-фибрин эффективно увеличивает скорость активации Glu- и Lys-плазминогена 36 кДа-стрептокиназой и практически не влияет на скорость активации мини-плаз-миногена. Низкомолекулярная стрептокиназа, в отличие от нативной, не влияет на амидазную и фибринолитическую активность плазмина и не предотвращает ингибирования энзима
а,2-антиплазмином. Плазмин в присутствии этого фрагмента стрептокиназы не проявляет активирующей способности по отношению к плазминогену.
Результаты этих исследований свидетельствуют, что при активации плазминогена низкомолекулярной стрептокиназой в присутствии desAB-фибрина определенный участок молекулы фибрина выполняет функцию N-концевого пептида нативной стрептокиназы, индуцируя в проэнзиме кон-формационные изменения, необходимые для быстрого образования комплекса с 36 кДа-стрепто-киназой, и формирование активного центра в молекуле проэнзима этой формой стрептокиназы.
Ключевые слова: стрептокиназа, 36 кДа-фрагмент стрептокиназы, плазминоген, фибрин.
Стрептокиназа — тромболитик, который успешно применяется в отечественной и зарубежной медицине при различных сердечно-сосудистых заболеваниях для растворения тромбов и реканализации сосудов. Стрептокиназа — протеин (47 кДа), активатор плазминогена бактериального происхождения, не является энзимом и активирует плазминоген уникальным, некаталитическим путем без расщепления пептидной связи А^561-Уа1562. Существенным недостатком стрептокиназы как тромбо-литического агента является способность активировать не только ассоциированный с поверхностью полимерного фибрина, но и свободноциркулирующий плазминоген. Поэтому современные исследования на-
правлены на поиск возможных путей превращения стрептокиназы в тромболитик направленного действия, который будет активировать плазминоген по фибринзависи-мому механизму.
Превращение проэнзима плазминогена в сериновую протеиназу плазмин (К.Ф.3.21.7), обеспечивающий расщепление фибриновой основы тромба, относится к ключевым реакциям системы фибринолиза. При физиологических условиях активация плазминогена обеспечивается двумя высокоспецифическими протеиназами — тканевым активатором плазминогена (К.Ф.3.4.21.68.) и урокиназой (К.Ф.3.4.21.31.). Существуют и неэнзи-мативные активаторы плазминогена — стрептокиназа и стафилокиназа [1, 2].
Тканевой активатор и стрептокиназа применяются в тромболитической терапии при остром инфаркте миокарда, остром тромбозе вен, тромбоэмболии легочной артерии и других нарушениях процесса фибринолиза. Всестороннее изучение молекулярных механизмов действия этих активаторов — важная медико-биологическая задача, направленная на совершенствование тромболитической терапии и создание новых тромболитических агентов.
Согласно современным представлениям, активация плазминогена тканевым активатором происходит вследствие гидролиза активационной пептидной связи Arg561-Val562. Новая N-концевая группа образует солевой мостик с Asp740, расположенной вблизи Ser741, входящего в состав каталитической триады, что вызывает конформацион-ные изменения, которые приводят к формированию активного центра энзима [3]. Тканевой активатор специфически сорбируется на фибрине и действует на поверхности тромба [4, 5]. В настоящее время созданы препараты рекомбинантного тканевого активатора, соизмеримые по эффективности с нативным энзимом [6].
Стрептокиназа не является энзимом и активирует плазминоген уникальным не-протеолитическим способом. На первой стадии реакции она образует эквимолярный комплекс с плазминогеном человека, на второй — вызывает изменения конформации в серинпротеиназном домене проэнзима, приводящие к формированию активного центра и появлению каталитической активности. На следующей стадии активаторный комплекс энзимативным путем расщепляет в молекуле субстратного плазминогена активационную пептидную связь с образованием плазмин-стрептокиназного комплекса (Пм-Ск) или, при каталитическом количестве стрептокиназы, свободного плазмина [Т]. Опосредованная Пм-Ск-комплексом активация плазминогена не зависит от присутствия в системе фибрина, что приводит к активации растворенного проэнзима. Это является существенным недостатком стрептокиназы в качестве тромболитика. Образующийся при внутривенном введении стрептокина-зы свободный плазмин инактивируется a2-антиплазмином, что приводит к снижению фибринолитического потенциала крови [8]. Кроме того, при быстром появлении плазми-на в системе циркуляции высока вероятность возникновения артериальной гипотензии вследствие резкого увеличения количества брадикинина [9].
Специфичность Пм-Ск в отношении высоко- и низкомолекулярных субстратов существенно отличается от специфичности плазмина. Пм-Ск эффективно активирует плазминоген, избирательно расщепляя пептидную связь Arg561-Val562, амидазная активность комплекса возрастает, а протео-литическая активность в отношении физиологического субстрата — фибрина, напротив, снижается. Связанный со стрептокиназой плазмин защищен от ингибирования a2-антиплазмином и автолиза [10, 11].
Известно, что стрептокиназа в составе Пм-Ск-комплекса нестабильна и быстро подвергается частичному гидролизу [12, 13]. Уже через 10 с существования комплекса формируется несколько производных форм с молекулярной массой от 4Т до 36 кДа. В течение 30 мин практически вся 47 кДа-стрептокиназа переходит в 36 кДа-фрагмент, сохраняющийся в течение последующих 5 ч на фоне появления еще более низкомолекулярных фрагментов. При этом амидазная и фибринолитическая активность деградируемого плазмин-стрептокиназного комплекса практически не изменяется, сохраняется и способность стрептокиназы защищать плазмин от ингибирования а2-антиплазмином и автолиза. В то же время активаторное действие в отношении Glu-плазминогена снижается почти на 50% [14].
В 1999 г. Reed at al. получили рекомбинантную стрептокиназу, лишенную 59 N-концевых аминокислотных остатков (гСкА59), и установили, что, по сравнению с нативной стрептокиназой, она в 600 раз медленнее активирует растворенный плаз-миноген. В присутствии же фибрина (но не фибриногена) активирующая способность восстанавливается [15]. Добавление гСкА59 к раствору плазмы, содержащему полимерный фибрин, приводило к полному лизису последнего, в то время как фибриногенолиз практически отсутствовал. Это свидетельствует о селективной активации плазминоге-на, сорбированного на поверхности фибрина. Поэтому возникает ряд вопросов, связанных с возможным активационным действием формирующегося при ограниченном проте-олизе стрептокиназы ее 36 кДа-фрагмента (Ск36), лишенного 63 N- и 34 С-концевых аминокислот. Каково его действие на плаз-миноген в отсутствие и в присутствии фибрина? Оказывает ли Ск36 модифицирующее действие на активный центр плазмина и если оказывает, то насколько оно подобно действию интактной стрептокиназы? Выяснение этих вопросов и являлось целью проведенных нами исследований.
Материалы и методы
Glu-плазминоген выделяли методом аффинной хроматографии на лизин-сефарозе из донорской цитратной плазмы [16] в присутствии панкреатического ингибитора трипсина — апротинина («Контрикал», Меркле ГмбХ, Германия).
Lys-плазминоген выделяли методом аффинной хроматографии из фракции плазмы III-2 по Кону на лизин-сефарозе [16].
Мини-плазминоген (Val442-плазми-ноген), состоящий из пятого крингла и серинпротеиназного домена, выделяли из эластазного гидролизата плазминогена гель-фильтрацией на сефадексе G-75 с последующей аффинной хроматографией на лизин-се-фарозе [1Т].
a2-Aнтиплазмин выделяли из донорской плазмы [18] со следующими модификациями. Плазму, истощенную по плазминогену на лизин-сефарозе, пропускали через две последовательно соединенные колонки с I и II аффинно-хроматографическими формами кринглов 1-3 плазминогена, иммобилизованными на BrCN-активированной сефарозе 4B. Колонки предварительно уравновешивали 0,04 М Na-фосфатным буфером с 0,5 М NaCl, рН 7,0. Неспецифически адсорбированные протеины элюировали тем же буфером. Элюцию проводили отдельно с каждой колонки 0,05 М 6-аминогексановой кислотой (6-АГК), растворенной в вышеуказанном буфере. С первой колонки элюировали гистидинбогатый протеин и примесь фибриногена, с другой — a2-антиплазмин. 6-АГК удаляли диализом против воды. Активность a2-антиплазмина определяли по ингибированию амидазной активности плазмина при молярном соотношении ингибитора к энзиму 1:1. Препараты a2-антиплазмина содержали более 90% активного ингибитора. Протеин хранили при -20 “С.
Плазмин получали активацией плазми-ногена урокиназой, иммобилизованной на BrCN-активированной сефарозе 4В [19]. 1 мг плазминогена инкубировали с 0,5 мл геля урокиназ-сефарозы (1250 МЕ/мл) в течение 1 ч при 37 “С в 50 мМ трис-Н^буфере, рН 7,4, содержащем 25%-й глицерол. Эффективность активации оценивали по скорости гидролиза образующимся плазмином специфического хромогенного субстрата S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNA2HCl) и данным электрофореза в 10% ПААГ c 0,1% ДСН в присутствии 2% Р-меркаптоэтанола.
Коммерческий препарат стрептокиназы (Kabikinase, Pharmacia & Upjohn, Швеция) отделяли от стабилизатора (альбумина че-
ловека) аффинной хроматографией на голубой сефарозе CL-6B, уравновешенной 0,05 М трис-HCl-буфером, рН 7,4 [20]. Основное количество стрептокиназы содержалось в протеиновых фракциях, объем которых был равен свободному объему колонки. Концентрацию стрептокиназы определяли по молярному коэффициенту экстинкции. По данным электрофореза в 10% ПААГ с 0,1% ДСН стрептокиназа была гомогенной. Хранили препарат при -20 “С.
36 кДа-фрагмент стрептокиназы выделяли препаративным электрофорезом [21]. Гидролиз стрептокиназы a-химотрипсином (Sigma, USA) проходил в 0,05 М трис- HCl-буфере, рН 7,4, в течение 10 мин при комнатной температуре, при весовом соотношении энзима к протеину 1:150. Реакцию останавливали 3 мМ фенилметилсульфонил-фторидом. Електрофорез фрагментов стрептокиназы проводили в 16% трисин-ПААГ с ДСН. Полиакриламидный гель отмывали в течение 2 ч в 2,5% тритоне Х-100 для удаления ДСН и нарезали на полоски с протеиновыми зонами разной молекулярной массы. Фрагменты стрептокиназы экстрагировали 12 ч при 0 “С в 0,05 М трис-HCl-буфере (рН 7,4), содержащем 0,15 М NaCl, 0,1 мМ п-нитрофенилгуанидинбензоат. Выделенные фрагменты анализировали в 10% трисин-ПААГ с ДСН и сохраняли при -20 “С. Молекулярную массу фрагментов стрептокиназы определяли с помощью пакета ImageMaster TotalLab.
Фибрин desAB получали активацией фибриногена (2,5 мг/мл) тромбином (1 ед. NIH/ 1 мг фибриногена) в 0,05 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 4 ч при 37 “С. Реакционная среда содержала ингибитор фактора XIIIa — п-хлор-меркурийбензоат Na (0,35 мг/мл реакционной смеси) и 0,1 М 6-АГК для удаления примеси плазминоге-на. Образовавшийся сгусток растворяли в 0,125%-й уксусной кислоте при 0 “С, дважды переосаждали — в 0,06 М К-фосфатном буфере, рН 6,5, далее — в 0,05 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,13 М NaCl. Препарат фибрин-мономера растворяли в 0,125%-й уксусной кислоте до концентрации 1,5-2,0% и сохраняли при 0 “С.
Кинетику активации Glu-, Lys- и мини-плазминогена эквимолярным количеством низкомолекулярной стрептокиназы в присутствии и в отсутствие desAВ-фибрина изучали по скорости освобождения образующимся плазмином п-нитроанилина из специфического хромогенного субстрата S-2251. Поглощение п-нитроанилина
регистрировали на микроридере (Titertek Multiskan MC, Финляндия) в двулучевом режиме при 405 и 492 нм через определенные промежутки времени. Отсчет времени начинался от момента добавления S-2251 (конечная концентрация 0,3 мМ). Реакции проводили в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,4), с 0,15 М NaCl при 37 “С в микропланшетах для иммуноэнзимного анализа. Объем реакционной смеси — 0,25 мл. Концентрации протеиновых компонентов: Glu-, Lys-плазми-ноген — 45 нМ; мини-плазминоген — 50 нМ; 36 кДа стрептокиназа — 45 или — 50 нМ; desAB-фибрин — 1,2 мкМ.
Скорость активации рассчитывали по формуле: V = АА405/А^ где АА405 — изменение поглощения при длине волны 405 нм, At — промежуток времени, в течение которого проводилось измерение изменения поглощения.
Амидазную активность плазмина в присутствии 36 кДа стрептокиназы определяли по скорости освобождения п-нитроанилина из хромогенного субстрата S-2251. В инкубационную среду последовательно вносили 0,05 М Na-фосфатный буфер, с 0,15 М NaCl, рН 7,4, плазмин (5 нМ), 36 кДа стрептоки-назу (5 нМ), S-2251 (3 мМ). Объем реакционной смеси — 0,25 мл. В контрольную пробу вместо стрептокиназы вносили соответствующий объем буфера. При изучении влияния 36 кДа-стрептокиназы на ингибирование плазмина a2-антиплазмином в реакционную смесь дополнительно добавляли 5 нМ a2-антиплазмина. Поглощение п-нитроанилина регистрировали на микроридере в двухлучевом режиме при 405 и 492 нм.
Для определения плазминогенактива-торной активности плазмина в присутствии эквимолярного количества 36 кДа стрепто-киназы в реакционную среду последовательно вносили 0,05 М Na-фосфатный буфер, с 0,15 М NaCl, рН 7,4, плазмин (1 нМ), 36 кДа стрептокиназу (1 нМ), Glu-плазминоген (100 нМ), S-2251 (3 мМ). Конечный объем —
0,25 мл. Контрольные пробы вместо Glu-плазминогена содержали такой же объем буферного раствора. Поглощение п-нит ро-анилина фиксировали через определенные промежутки на микроридере в двухлучевом режиме при 405 и 492 нм.
Фибринолитическую активность плазми-на в присутствии эквимолярного количества 36 кДа-стрептокиназы исследовали с помощью турбидиметрии, регистрируя время полулизиса фибриновых сгустков. В термостатированную кювету спектрофотометра СФ-26 («ЛОМО», Россия) последовательно
вносили 0,02 М вероналовый буфер, содержащий 1 мМ CaCl2, 0,13 М NaCl, рН 7,4, плазмин (3,5 нМ), Ск36 (3,5 нМ). Реакцию начинали, добавляя desAB-фибрин-мономер (580 нМ). Объем реакционной смеси — 1,0 мл, температура 37 “С. Процесс образования и растворения сгустка регистрировали по изменению мутности среды при 350 нм. Активность плазмина определяли по времени от момента полимеризации сгустка до уменьшения его максимальной мутности в два раза. Скорость гидролиза оценивали как 1/t1/2.
Концентрацию протеинов в растворах устанавливали спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность при 280 нм и вычитая значение поглощения при 320 нм. Для расчета концентраций использовали следующие значения коэффициентов экс-тинкции для 1%-х растворов протеинов и молекулярные массы: Glu-плазминоген — 17,0 и 92 кДа, плазмин — 17,0 и 84 кДа [22], ми-ни-плазминоген — 14,0 и 38 кДа [17], стрептокиназа — 9,8 и 47 кДа [23], desAB-фибрин-мономер (в кислой среде) — 15,06 и 300 кДа [24], a2-антиплазмин — 6,7 и 70 кДа [25], 36 кДа-стрептокиназа — 6,0 и 36 кДа [26].
Математическую обработку результатов исследования выполняли с помощью пакета ORIGIN 8.6. В работу включены результаты экспериментов, допустимая погрешность которых не превышала 5% (Р < 0,05). Кривые, представленные на рисунках, являются типичными для серии повторных исследований (не менее трех в каждой серии).
Результаты и обсуждение
Молекула стрептокиназы состоит из 414 аминокислотных остатков, Mr 47 кДа. N-концевая аминокислота — изолейцин, С-концевая — лизин [23, 27]. В результате ограниченного гидролиза нативной молекулы a-химотрипсином образуется ряд охарактеризованных по аминокислотным последовательностям фрагментов с молекулярной массой от 36 до 7 кДа, в той или иной степени сохраняющих сродство к плазминогену. 36 кДа-фрагмент образуется при расщеплении пептидных связей Ск 63-64 и Ск 380-381 [13, 26, 28]. Он был выделен из химотрипсинового гидролизата стрептокиназы препаративным электрофорезом в 16% трисин-ПААГ с ДСН, как описано в разделе «Материалы и методы» (рис. 1).
Исследования плазминогенактиватор-ной активности низкомолекулярной стреп-токиназы показали, что активация Glu-плазминогена 36 кДа-стрептокиназой, по
Рис. 1. Электрофореграмма 36 кДа (1) и 47 кДа (2) стрептокиназы в 10%-м ПААГ с ДС-Na
сравнению с 47 кДа, происходит в 100 раз медленнее. Она начинается только через 1 ч от начала реакции при высокой (200 нМ) эквимолярной концентрации протеинов (рис. 2). При более низких концентрациях реагирующих компонентов (20 и 45 нМ) развитие окраски, свидетельствующее о появлении амидазной активности в реакционной среде, не наблюдается в течение 2 ч. Эти результаты согласуются с данными, представленными в [29], где показано, что химическое модифицирование N^-групп стреп-токиназы тринитробензолсульфокислотой приводит к снижению скорости активации плазминогена более чем в 100 раз, а отщепление С-концевого лизина карбоксипептидазой В уменьшает ее активирующую активность в 3 раза. Молекула стрептокиназы состоит из трех доменов — a, Р и у (аминокислотные последовательности 12-150, 151-287, 288-372), объединенных двумя подвижными сегментами, а также N- и С-концевых неупорядоченных участков [30]. Каждый из этих доменов может связывать плазминоген, но не активирует его. Исследования с применением мутагенеза показали, что только кооперативное действие всех трех доменов обеспечивает формирование активного центра в молекуле плазминогена. Распознавание субстратного плазминогена осуществляется прежде всего a-доменом [30-32]. Результаты наших исследований и данные литературы позволяют сделать вывод, что для проявления актива-торной активности стрептокиназы, т. е. индуцирования конформационных изменений в каталитическом домене, ведущих к образованию активного центра энзима, важна
целостность как N-, так и С-концевых пептидов стрептокиназы. Нарушение либо отсутствие этих участков молекулы вызывает снижение скорости процесса активации, что объясняет незначительную активирующую активность 36 кДа-стрептокиназы по отношению к свободному Glu-плазминогену.
Стрептокиназа образует комплексы с Glu-и Lys-формами плазминогена с (RD = 6,2107 М и 3,8-10-8 М, соответственно) [33], а также с фрагментами плазминогена, в состав которых входит каталитический домен — мини-плазминогеном [34], микроплазминогеном (Lys-530-плазминоген) и легкой цепью плаз-мина [35, 36]. Однако исследования процесса активации Glu-, Lys-, мини- и микро-плазминогена каталитическим количеством срептокиназы показали, что скорость реакции зависит от наличия в молекуле проэнзима крингловых доменов, содержащих ли-зинсвязывающие участки, участвующие не только в процессах комплексообразования, но и в индукции каталитической активности в молекуле плазминогена, а также в последующем взаимодействии плазмин(оген)-стрептокиназного комплекса с субстратным плазминогеном [37]. Изучение кинетики активации Glu-, Lys- и мини-плазминогена 36 кДа-стрептокиназой при 50 нМ концентрации реагирующих протеинов выявило, что в случае Glu-плазминогена энзиматическая активность не регистрировалась в течение всего времени наблюдения, в то время как активность Lys- и мини-плазмино-гена появлялась через 30- и 10-минутные лаг-периоды, соответственно (рис. 3). При
<м
га
I
ю
о
Время, мин
Рис. 2. Активация Glu-плазминогена эквимолярными количествами стрептокиназы:
1 — 47 кДа-стрептокиназа (200 нМ);
2 — 36 кДа-стрептокиназа (20 нМ);
В — 36 кДа-стрептокиназа (50 нМ);
4 — 36 кДа-стрептокиназа (200 нМ)
1
2
Время, мин
Рис. В. Кинетика активации разных форм плазминогена эквимолярным количеством 36 кДа стрептокиназы:
1 — Glu-плазминоген;
2 — Lys-плазминоген;
В — мини-плазминоген
Время, мин
Рис. 4. Влияние фибрина на активацию разных форм плазминогена эквимолярным количеством 36 кДа стрептокиназы:
1, 2, В — Glu-, Lys- и мини-плазминоген в отсутствие фибрина;
4, 5, б — Glu-, Lys- и мини-плазминоген в присутствии фибрина
этом скорость активации мини-плазминоге-на была на порядок выше, чем Lys-плазми-ногена, — 4,310-2 и 5,010-3 оп. ед.-мин-1, соответственно. Следовательно, N- или С-концевой участок нативной стрептокина-зы отвечает за те конформационные изменения в молекуле проэнзима, которые обеспечивают доступность центров связывания активатора с протеиназным доменом, что составляет необходимое условие формирования активного центра. Высокая скорость активации мини-плазминогена указывает на то, что такой сайт связывания стрептоки-назы в его молекуле открыт и доступен для взаимодействия.
С целью выяснения влияния фибрина на процесс активации плазминогена 36 кДа-срептокиназой исследовали кинетику активации разных форм плазминогена (Glu-, Lys- и мини-плазминогена) эквимолярным количеством низкомолекулярной стреп-токиназы в присутствии desAB-фибрина. Экспериментальные данные представлены на рис. 4. Если в реакционную среду, содержащую эквимолярные концентрации протеинов, добавляли фибрин-мономер, то после 20-30 мин лаг-периода фиксировали активацию Glu-плазминогена. Полученные результаты можно объяснить изменением конформации молекулы Glu-плазминогена на Lys-плазминогенподобную. В таком случае скорость активации Glu-плазминогена низкомолекулярной стрептокиназой в присутствии фибрина должна была бы достичь скорости активации Lys-плазминогена в растворе, однако она значительно превышала
ее. DesAB-фибрин на порядок увеличивает скорость активации Lys-формы плазмино-гена. Эти данные свидетельствует о том, что на поверхности фибрина происходят кон-формационные изменения не только нативной, но и частично деградированной формы проэнзима. При этом изначально высокая скорость активации мини-плазминогена 36 кДа-стрептокиназой в присутствии desAB-фибрина увеличивалась незначительно. Эти результаты подтверждают наше предположение о том, что в молекуле мини-плазминогена сайт связывания активатора, необходимый для формирования активного центра, экспонирован и доступен для взаимодействия.
Существуют две гипотезы относительно механизма формирования активного центра в молекуле плазминогена, находящегося в комплексе со стрептокиназой. Согласно первой из них, N-концевой изолейцин стрепто-киназы образует солевой мостик с остатком Asp740 плазминогена, расположенным рядом с Ser741 каталитической триады. Такое взаимодействие является пусковым механизмом формирования активного центра и S1-субцентра [38]. Согласно второй, у-домен стрептокиназы связывается с серинпротеи-назным доменом плазминогена вблизи консервативного остатка Lys698, что приводит к изменениям конформации этого участка молекулы с образованием связи между Lys698 и Asp740 [30]. Поскольку рекомбинантная стрептокиназа, у которой отсутствуют 59 N-концевых аминокислот, проявляет очень низкую плазминогенактиваторную активность [15], логично предположить, что имен-
но Ы-концевой участок молекулы стрептоки-назы является триггером конформационных изменений и инициации каталитической активности проэнзима. В случае активации плазминогена низкомолекулярной стреп-токиназой на поверхности ёввАБ-фибрина возможно, что определенный участок его молекулы выполняет функцию Ы-концевого пептида нативной стрептокиназы, индуцируя в проэнзиме конформационные изменения, необходимые для быстрого образования комплекса с 36 кДа-стрептокиназой и формирования активного центра проэнзима.
Известно, что 47 кДа-стрептокиназа изменяет специфичность плазмина по отношению к высоко- и низкомолекулярным субстратам, а также защищает энзим от ингибирования а2-антиплазмином. Результаты наших экспериментов свидетельствуют о том, что 36 кДа-стрептокиназа не модифицирует плазмин подобно нативной стреп-токиназе. Эквимолярные количества низкомолекулярной стрептокиназы не влияют на амидазную активность плазмина. Энзим с одинаковой скоростью гидролизует хромогенный субстрат 8-2251 как в присутствии, так и в отсутствие 36 кДа-стрептокиназы (рис. 5). Добавление в реакционную среду, содержащую эквимолярные количества плазмина и низкомолекулярной стрептокиназы, 100-кратного молярного избытка С1и-плазминогена не приводит к увеличению освобождающегося из хромогенного субстрата п-нитроанилина (рис. 6). Эти результаты показывают, что плазмин в комплексе с 36 кДа-фрагментом не проявляет плазмино-генактиваторную активность. В отличие от нативной, низкомолекулярная стрептокина-
1; 2
1Л-,
U-
S и
eg О і 10-
405- 0S
Ой-
(М-
0,2-
5 10 1$
Время, мин
20
за практически не влияет на взаимодеиствие плазмина с а2-антиплазмином, поскольку амидолитическая активность энзима полностью ингибируется а2-антиплазмином в присутствии эквимолярного количества 36 кДа-фрагмента стрептокиназы (рис. 7). Не оказывает она влияния и на фибринолитиче-скую активность энзима, так как скорость гидролиза полимерного фибрина плазмином в присутствии 36 кДа-стрептокиназы не отличается от таковоИ самого плазмина (рис. 8). Это может свидетельствовать о том, что модификация активного центра плазмина 47 кДа стрептокиназой осуществляется с участием 7 кДа Ы-концевого и/или 4 кДа С-концевого участков нативной молекулы.
Поскольку показано, что 36 кДа-стреп-токиназа медленно активирует плазминоген в растворе и быстро — в присутствии фибрина, а комплекс плазмина с низкомолекулярной
<м
га
I
ю
о
1; 2
Рис. 6. Плазминоген-активаторная активность плазмина: без (1) и в присутствии (2) эквимолярного количества 36 кДа-стрептокиназы
<м
га
I
ю
о
4f
Рис. 5. Амидолитическая активность плазмина: без (1) и в присутствии (2) низкомолекулярной стрептокиназы
Время, мин
Рис. 7. Влияние 36 кДа-стрептокиназы на ингибирование плазмина а2-антиплазмином:
1 — плазмин; 2 — плазмин в присутствии а2-антиплазмина; 3 — плазмин в присутствии 36 кДа-стрептокиназы и а2-антиплазмина
1
-T-
2
Рис. 8. Гидролиз полимерного фибрина: плазмином (1); плазмином в присутствии 36 кДа-стрептокиназы (2)
стрептокиназой не активирует свободный плаз-миноген и ингибируется а2-антиплазмином, можно предположить, что введение 36 кДа-стрептокиназы в кровоток обеспечит актива-
цию лишь сорбированного на фибрине плазми-ногена, тогда как неконтролируемый протеолиз протеинов плазмы происходить не будет.
REFERENCES
1. Collen D., Lijnen H. R. The fibrinolytic system in man. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1986, 4 (3), 249-301.
2. Wun T. C. Plasminogen activation: biochemistry, physiology and therapeutics. Crit. Rev. Biotechnol. 1988, V. 8, P. 131-148.
3. Wang S., Reed G., Hedstrom L. Zymogen activation in the streptokinase-plasminogen complex. Ile1 is required for the formation of a functional active site. Eur. J. Biochem. 2000, 267 (13), 3994-4001.
4. Ranby M., Bergsdorf N., Nilsson T. Enzymatic properties of the one- and two-chain form of tissue plasminogen activator. Thromb. Res. 1982, 27 (2), 175-183.
5. Collen D., Lijnen H. R. Tissue-type plasminogen activator, mechanism of action and thrombo-ly tic properties. Haemostasis. 1986, V. 16, P. 25-32.
6. Dev B. Baruah, Rajendra N. Dash, Chaudha-ri M. R., Kadam S. S. Plasminogen activators: a comparison. Vasc. Pharmacol. 2006, V. 44, P. 1-9.
7. Reddy K. N. N. Mechanism of activation of human plasminogen by streptokinase. Fibrinolysis. Kline G., Reddy K. N. (Ed.). CRC Press, Inc. Boca Ration. 1980, P. 71-94.
8. Torr S. R., Nachowiak D. A., Fujii S., Sobel B. E. Plasminogen steal and clot lysis. J. Am. Coll. Cardiol. 1992, 19 (5), 1085-1090.
9. Hoffmeister H. M., Ruf M., Wendel H. P., Heller W., Seipel L. Streptokinase-induced
activation of the kallikrein-kinin system and of the contact phase in patients with acute myocardial infarction. J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998, 31 (5), 764-772.
10. Reddy K., Markus G. Esterase activities in the zymogen moiety of the streptokinase-plasminogen complex. J. Biol. Chem. 1974, 249 (15), 4851-4857.
11. Cederholm-Williams S. A., De Cock F., Lijnen H. R., Collen D. Kinetics of the reactions between streptokinase, plasmin and alpha 2-antiplasmin. Eur. J. Biochem. 1979, 100 (1), 125-132.
12. Siefring G., Castellino F. Interaction of streptokinase with plasminogen. Isolation and characterization of a streptokinase degradation product. J. Biol. Chem. 1976, 251 (13), 3913-3920.
13. Parrado J., Conejero-Lara F., Smith R., Marshall J., Ponting C., Dobson C. The domain organization of streptokinase: nuclear magnetic resonance, circular dichroism, and functional characterization of proteolytic fragments. Prot. Sci. 1996, 5 (4), 693-704.
14. Grinenko T. V., Makogonenko E. M., Juso-va O. I., Sederhol’m-Vil’jams S. A. Degradation of streptokinase and catalytic properties of plasmin-streptokinase complex. Ukr. Biokhim. Zh. 2002, 74 (2), 50-57. (In Russian).
15. Reed G. L., Houng A. K., Liu L., Parhami-Se-ren B., Matsueda L. H., Wang S., Hedstrom L. A catalytic switch and the conversion
of streptokinase to a fibrin-targeted plasminogen activator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96 (3), 8879-8883.
16. Deutsch D. G., Mertz E. T. Plasminogen: purification from human plama by affinity chromatography. Science. 1970, 170 (3962), 1095-1096.
17. Sottrup-Jensen L., Claeys H., Zajdel M., Petersen T. E., Magnusson S. The primary structure of human plasminogen: isolation of two lysine-binding fragment and one “miniplasminogen” (M. W. 38000) by elastase catalyzed specific limited proteolysis. Progress in chemical fibrinolysis and thrombolysis. Davidson V.F., Rowan R.H., Samama M.M., Desnoyers D.C. (Ed.). N.-Y.: Raven Press. 1978, P. 191-209.
18. Grinenko T. V., Makogonenko E. M., Jusova E. I., Zadorozhnaja M. B., Volkov G. L. Sposob vydelenija vysokoochishhennogo a 2-antiplazmina iz plazmy krovi cheloveka. Pat. Ukr. № 53146 S2, Institut biochemistry NAS Ukrainy. Applied. 22.03.2002; Published. 15.01.2003, Bull. N 1.
19. March S. C., Parikh I., Cuatrecasas P. A simplified method for cyanogen bromide activation of agarose for affinity chromatography. Anal. Biochem. 1974, 60 (1), 149152.
20. Castellino F. J., Sodetz J. M., Brockway W. J., Siefring G. E. Streptokinase. Meth. Enzimol. 1976, V. 45, P. 244-257.
21. Korol’chuk V. I., Makogonenko E. M., Se-derhol’m-Vil’jams S. A. Zv’jazuvannja plazminogenu z dekapeptidnimi ta poli-peptidnimi fragmentami streptokinazi. Ukr. Biokhim. Zh. 1999, 71 (5), 51-58. (In Russian).
22. Violand B. N., Castellino F. J. Mechanism of the urokinase-catalyzed activation of human plasminogen. J. Biol. Chem. 1976, 251 (13), 3906-3912.
23. Brockway W. J., Castellino F. J. A characterization of native streptokinase and altered streptokinase isolated from a human plasminogen activator complex. Biochemistry. 1974, V. 13, P. 2063-2070.
24. Posdnjakova T. M., Musjalkovskaja A. A., Ugarova T. B. On the properties of fibrin monomer prepared from fibrin clot with acetic asid. Thromb. Res. 1979, 16 (1-2), 283-288.
25. Wiman B., Collen D. Purification and characterization of human antiplasmin, the fast-acting plasmin inhibitor in plasma. Eur. J. Biochem. 1977, 78 (1), 19-26.
26. Korol’chuk V. I., Makogonenko E. M., Seder-hol’m-Vil’jams S. A. Sajazyvanie plazmino-gena s dekapeptidnymi i polipeptidnymi fragmentami streptokinazy. Ukr. Biokhim. Zh. 1999, 71 (5), 51-58. (In Russian).
27. Jackson K. W., Tang J. Complete amino acid sequence of streptokinase and its homology with serine protease. Biochemistry. 1982, 21 (26), 6620-6625.
28. Shi G. Y., Chang B. I., Chen Sh. M., Wu H. L. Function of streptokinase fragments in plasminogen activation. Biochem. J. 1994, 304 (1), 235-241.
29. Sokolovskaja L. I., Makogonenko E. M., Grinenko T. V., Sederhol’m-Vil’jams S. A. The role of lysine-binding sites in the activation of plasminogen streptokinase. Ukr. Biokhim. Zh. 2003, 75 (2), 25-32. (In Russian).
30. Wang X., Lin X., Loy J. A., Tang J., Zhang X. C. Crystal structure of the catalytic domain of human plasmin complexed with streptokinase. Science. 1998, 11 (281) (5383), 1662-1665.
31. Loy J., Lin X., Schenone M., Castellino F., Zhang X., Tang J. Domain interactions between streptokinase and human plasminogen. Biochemistry. 2001, V. 40, P. 1468614695.
32.Arabi R., Roohvand F., Norouzian D., Sardari S., Aghasadeghi M. R. A comparative study on the activity and antigenicity of truncated and full-length forms of streptokinase. Pol. J. Microbiol. 2011, 60 (3), 243-251.
33. Boxrud P. D., Bock P. E. Streptokinase binds prefentially to the extended conformation of plasminogen thtought lysine binding site and catalytic domain interaction. Biochemistry. 2000, 39 (45), 13974-13981.
34. Lin L.-F., Houng A., Reed G. L. Epsilon amino caproic acid inhibits streptokynase-plasminogen activator complex formation and substrate binding through kringle-dependent mechanism. Biochemistry. 2000, 39 (16), 4740-4745.
35. Shi G. Y., Wu H. L. Isolation and characterization of microplasminogen: low molecular weight form of plasminogen. J. Biol. Chem. 1988, 263 (32), 17071-17075.
36. Summaria L., Robbins K. C. Isolation of a human plasminogen-derived, functionally active light (B) chain capable of forming with streptokinase an equimolar light (B) chain-streptokinase complex with plasminogen activator activity. J. Biol. Chem. 1976, 251 (18), 5810-5813.
37. Grinenko T. V. Reguljacija fibrinolizu nekata-litichnimi diljankami molekul plazminogena/ plazminu. Manuscript. Ph.D. dissertation in biology, specialty 03.00.04. Biochemistry. Kyiv. 2007, 42 p. (In Ukrainian).
38. Wang S., Reed G., Hedstrom L. Deletion of Ile1 changes the mechanism of streptokinase: evidence for the molecular sexuality hypothesis. Biochemistry. 1999, V. 38, P. 5232-5240.
АКТИВАЦІЯ ПЛАЗМІНОГЕНУ НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНОЮ СТРЕПТОКІНАЗОЮ ТА ЕФЕКТ ФІБРИНУ
Є. І. Юсова
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
E-mail: [email protected]
Метою роботи було вивчення плазміноген-активаторної активності 36 кДа-фрагмен-та стрептокінази, впливу на цей процес desAB-фібрину, а також низькомолекулярної стрептокінази на каталітичні властивості плазміну. Фрагмент стрептокінази з молекулярною масою 36 кДа, у якого відсутні 63 N- і 34 С-кінцеві амінокислотні залишки, отримували із хімотрипсинового гідролізату нативної стрептокінази препаративним електрофорезом. Показано, що цей фрагмент активує Glu-плазміноген у розчині тільки за високих концентрацій реагуючих компонентів (210-7 М). Процес активації розпочинається після тривалого лаг-періоду і відбувається у 100 разів повільніше порівняно з нативною стрептокіназою. На відміну від нативної Glu-форми, активація частково деградованої Lys-форми проензиму та міні-плазміногену (Val442-плазмiноген) відбувається за значно нижчої концентрації протеїнів (510-8 М), при цьому швидкість реакції з міні-плазміногеном є на порядок вищою, ніж із Lys-плазміноге-ном, і дорівнює 4,310-2 і 5,010-3 оп. од.-хв-1 відповідно. DesAB-фібрин ефективно збільшує швидкість активації Glu- та Lys-плазміногену 36 кДа-стрептокіназою і практично не впливає на швидкість активації міні-плазміногену. Низькомолекулярна стрептокіназа, на відміну від нативної, не впливає на амідазну та фі-бринолітичну активність плазміну і не захищає ензим від інгібування a2-антиплазмiном. Плазмін за присутності цього фрагменту стреп-токінази не виявляє активаторної активності стосовно плазміногену. Із результатів цих досліджень випливає, що за активації плазміно-гену низькомолекулярною стрептокіназою за присутності desAB-фібрину певна ділянка молекули фібрину виконує функцію N-кінцевого пептиду нативної стрептокінази, індукуючи в проензимі конформаційні зміни, необхідні для швидкого утворення комплексу з 36 кДа-стрептокіназою і формування активного центра в молекулі проензиму цією формою стрептокінази.
Ключові слова: стрептокіназа, 36 кДа-фраг-мент стрептокінази, плазміноген, фібрин.
PLASMINOGEN ACTIVATION BY LOW MOLECULAR WEIGHT STREPTOKINASE AND FIBRIN EFFECT
E. I. Yusova
Palladian Biochemistry Institute of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
The purpose is to study the plasminogen-activating activity of 36 kDa-streptokinase fragment, influences of desAB-fibrin on this process and low molecular weight streptokinase on plasmin catalytic properties as well.
The 36 kDa-fragment lacking the 63 N- and 34 C-terminal amino acid residues was obtained by preparative electrophoresis from chymotrypsin hydrolyzate of the native streptokinase. It was shown that 36 kDa streptokinase activates Glu-plasminogen in solution only at high concentrations of reacting components (210-7 M). Activation process begins after a long lag-period and is in 100 times slower compared with the native streptokinase. Lys-plasminogen, mini-plasminogen (Val442-plasminogen) but not its Glu-form are activated at definitely lower protein concentrations (510-8 M), while the reaction rate with miniplasminogen is order of magnitude greater as compared with Lys-plasminogen and is equal to 4,310-2 and 510-3 o.u./min respectively. DesAB-fibrin increases efficiently the rate of Glu- and Lys- plasminogen activation by 36 kDa-streptokinase and practically has no effect on the rate of mini-plasminogen activation. Low molecular weight streptokinase has no influence on amidase and fibrinolytic activity of plasmin and does not protect the enzyme from inhibitory effect of a2-antiplasmin. In the presence of the streptokinase fragment, plasmin showed no its activator activity towards plasminogen.
A conclusion is made, that during plasminogen activation by low molecular weight streptokinase in the presence of desAB fibrin, a certain site of the fibrin molecule acts as N-terminal peptide of the native streptokinase, inducing conformational changes in proenzyme. These changes are necessary for quick complex formation with 36-kDa streptokinase and formation of the active centre in proenzyme molecule by this form of streptokinase.
Key word: streptokinase, 36 kDa-streptokinase fragment, plasminogen, fibrin.
