CC BY
20
DOI: 10.23868/202012008
ПОКАЗАТЕЛИ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС ПРИ ПОДКОЖНОЙ ИМПЛАНТАЦИИ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗИРОВАННОГО МАТРИКСА ПИЩЕВОДА
К.И. Мелконян, Р.З. Накохов, Т.В. Русинова, Я.А. Козмай, И.М. Быков, А.Н. Редько, С.Н. Алексеенко
Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России, Краснодар, Россия
Поступила: 25.02.2020 Принята к печати: 23122020 Опубликована on-line: 30.12.2020
SERUM CYTOKINE PROFILE INDICATORS AFTER SUBCUTANEOUS IMPLANTATION OF THE DECELLULARIZED ESOPHAGUS MATRIX IN RATS
K.I. Melkonyan, R.Z. Nakokhov, T.V. Rusinova, Y.A. Kozmai, I.M. Bykov, A.N. Redko, S.N. Alekseenko
Kuban State Medical University, Krasnodar, Russia
e-mail: kimelkonian@gmail.com
Изучение постимплантационного иммунного ответа на де-целлюляризированные матриксы необходимо для оценки биосовместимости тканеинженерных конструкций на их основе, так как воспалительный процесс и избыточная продукция медиаторов воспаления может привести к осложнениям и отторжению имплантата.
Цель исследования: изучение цитокинового профиля в сыворотке крови крыс после подкожной имплантации децел-люляризированного матрикса пищевода на разных сроках эксперимента.
Экспериментальные данные были получены на самцах крыс линии Wistar возрастом 5-6 мес. (п=55). Крысы были разделены на 4 группы: две контрольные, экспериментальную и группу сравнения. Контрольную группу 1 составили условно-здоровые крысы (п=10), контрольную группу 2 — прооперированные животные (нанесение разреза в области лопатки) без имплантации (п=15). Крысам экспериментальной группы (п=15) подкожно имплантировали фрагменты децеллюляризированного пищевода, крысам группы сравнения (п=15) — фрагменты нативного алло-генного пищевода. Забор периферической крови и эксплантацию фрагментов децеллюляризированного и нативного пищевода выполняли на 7, 14, 21 сут. В сыворотке крови определяли содержание 11_1а, 11_2, 11_4, 11_17А, ТЫРа, !Р1\1у, вМ-ОБР методом иммуноферментного анализа. Эксплантированные фрагменты подвергали рутинному гистологическому анализу.
На 7 сут. эксперимента в сыворотке крови крыс экспериментальной группы содержание 11_1а было значимо больше, а содержание !_17А, !Р1\1у, вМ-ОБР — значимо меньше по сравнению с контрольной группой 1 (р<0,05). На 14 сут. было обнаружено резкое снижение концентрации 11_17А по сравнению с 7 сут. эксперимента и контрольной группой 1 (р<0,05); снижение содержания 11_1а до значений контрольной группы 1 (р>0,05) и уменьшение концентрации !Р1\1у по сравнению с 7 сут. (р<0,05). На 21 сут. было выявлено снижение содержания 11_17А, !Р1\1у, 11_1а в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой 1. В экспериментальной группе изменение концентраций изучаемых цитокинов соответствовало гистоморфологиче-ской картине адекватного репарационного процесса. В группе сравнения уровень !1_17А, !Р1\1у, !1_1а повышался по сравнению с экспериментальной группой. Снижение концентраций !1_1а, !1_4, !1_17А, !Р1\1у в экспериментальной группе отражает позитивную динамику процесса заживления и отсутствие отторжения децеллюляризированных матриксов.
Ключевые слова: подкожная имплантация, децеллюляри-зация, иммунный ответ, провоспалительные цитокины, пищевод.
Study of postimplantation immune response to decellularized matrices has great importance for assessing biocompatibility of tissue-engineered structures based on them, since inflammatory process and excessive production of inflammatory mediators lead to complications and implant rejection.
The aim of this research: serum cytokine profile studying after subcutaneous implantation of decellularized esophagus matrix in rats.
Experimental data were obtained on male Wistar rats aged 5-6 months (n=55). Rats were divided into 4 groups: two control groups, experimental and comparison group. Control group
1 consisted of conditionally healthy rats (n=10), control group 2 — shame-operated animals (incision in scapula without implantation, n=15). In experimental group (n=15), rats underwent subcutaneous implantation of decellularized esophagus fragments; in group
2 (n=15) — native esophagus fragments. Peripheral blood sampling and fragment explantation were performed on 7th, 14th and 21st experimental days. Serum samples were tested for IL1a, IL2, IL4, IL17A, TNFa, IFNy, GM-CSF content by ELISA. Explanted native esophagus and decellularized esophagus fragments were subjected to histological analysis.
On 7th experimental day, significant increase in IL1 a content was observed in rats with implantation of decellularized esophagus fragments. IL17A, IFNy, GM-CSF content significantly decreased. On 14th day, IL17A concentration sharply decreased in comparison with value on 7th experimental day and control 1. IL1 a and IFNy concentration decreased in comparison with control group 1 values and 7th day respectively. On 21st day, dynamics of decrease in IL17A, IFNy, IL1 a content in this rat group was revealed.
Thus, it was found change in concentrations of studied cytokines corresponds to regeneration histomorphological picture in group that underwent implantation of acellular matrices against of active inflammatory reaction in comparison group. Concentrations of IL1 a, IL4, IL17A, IFNy reflect positive dynamics of wound healing process and absence of decellularized matrix rejection.
Keywords: subcutaneous implantation, decellularization, immune response, pro-inflammatory cytokines, esophagus.
Введение
Разработка тканеинженерных конструкций на основе децеллюляризированных матриксов с последующей рецеллюляризацией может стать альтернативным методом восстановления органов с нарушенными функциями за счет регенерации клеток и тканей [1]. Восстановление повреждённого пищевода является важной задачей современной гастроэнтерологии, так
как его травмы нарушают функциональную целостность одной из основных систем организма. Небольшое повреждение пищевода, выявленное на ранней стадии, можно восстановить с помощью стандартной терапии, однако дефекты со значительной потерей ткани или обусловленные новообразованиями не поддаются лечению, что приводит в дальнейшем к снижению качества жизни пациентов и высокой смертности [2].
Для преодоления проблемы отторжения в области тканевой инженерии был предложен альтернативный способ лечения — пересадка реципиентам тканей и органов, подвергнутых децеллюляризации. Децеллюляризация — удаление клеток из тканей и органов для получения внеклеточного матрикса (ВКМ) — временного каркаса, который не вызывает воспалительный ответ и способствует процессам миграции, пролиферации и диффе-ренцировки реимплантированных клеток [3]. Метод децеллюляризации с последующей рецеллюляризацией активно используют в экспериментальных исследованиях для получения каркасов из различных структур, например, кожи, кровеносных сосудов, сердечных клапанов и нервов, в том числе и пищевода [4-7].
Для оценки тканевой реакции на имплантацию и динамики биодеградации матриксов, как правило, применяют метод подкожной имплантации [8]. На разных сроках после операции выполняют гистологический анализ образцов для выявления локальных структурных изменений во фрагментах матриксов и для характеристики воспалительного процесса после имплантации. Метод подкожной имплантации также может быть использован для анализа системной реакции и степени тяжести воспалительного ответа на матрикс при биохимическом или иммунологическом исследовании проб периферической крови.
Имплантация биоматериала in vivo индуцирует системный и локальный иммунный ответы, при которых макрофаги являются одними из основных участников тканевой воспалительной реакции и находятся на границе биоматериал-ткань в течение всего срока после имплантации [9]. Макрофаги активно продуцируют различные медиаторы (IL1, IL4, IL8, IFNy, TNF, GM-CSF, TGFß и др.), которые могут вызывать пролиферацию клеток и синтез молекул, включенных в процессы воспаления и заживления раны, а также участвуют в деградации имплантированного биоматериала, свертывании крови, фибринолизе и в активации системы комплемента. IL1 — важный медиатор воспаления: стимулируя активность фибробластов, IL1 индуцирует продукцию коллагена, пролиферацию эндотелиальных и гладкомышечных клеток. На пролиферацию, хемотаксис и синтез коллагена в фибробластах также влияют TNF, фибронектин, макрофагальный фактор роста и ряд других факторов, например IL8, который индуцирует синтез хемокинов эндотелиальными клетками сосудов и является хемоаттрактантом для полиморфноя-дерных лейкоцитов [10, 11].
При оценке воспалительного и репаративного процессов после имплантации необходимо учитывать весь спектр цитокинов — интерлейкинов, интерферонов, TNF, колониестимулирующих факторов, факторов роста и хемокинов. В условиях in vivo невозможно активировать синтез молекул только одного типа, поскольку цитокиновая регуляторная сеть включает различные стимулирующие и ингибирующие эффекты самих цито-кинов и их рецепторов в пределах одного биологического ответа [12]. Для полноты иммунологической картины необходимо определить динамику изменения уровней как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов. В качестве противовоспалительного цитокина зачастую выступает IL4 [13, 14], подавляющий провос-палительную активность макрофагов и секрецию ими IL1, TNFa и IL6. Следовательно, для анализа адекватности иммунной реакции целесообразно определять содержание основных провоспалительных цитокинов—IL1 и TNFa. Не менее важно оценивать уровень IL2, который оказывает влияние на механизмы врождённого иммунитета и на адаптивный антиген-зависимый иммунный ответ,
реализующийся через Т- и В-лимфоциты [15], уровень цитокина GM-CSF, стимулирующего рост, дифференци-ровку гранулоцитарных, макрофагальных клеток и поддерживающего дифференцировку и жизнеспособность дендритных клеток, и уровень интерферона IFNy, активирующего эффекторные функции нейтрофилов, макрофагов, цитотоксических T-лимфоцитов и естественных киллерных клеток [16]. Особый интерес представляет изучение роли одного из малоизученных провоспали-тельных цитокинов — IL17A, участвующего в стимуляции нейтрофилов в месте воспаления [16].
Цель исследования: определение цитокинового профиля в сыворотке крови крыс после подкожной имплантации децеллюляризированного матрикса пищевода для оценки особенностей системной реакции организма на данный имплантат.
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Системную реакцию организма на подкожную имплантацию децеллюляризированного матрикса пищевода изучали на самцах крыс линии Wistar (масса тела 230± 50 г, возраст 5-6 месяцев, n=55). Все эксперименты проводили в соответствии с общими этическими принципами работы с животными, Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986), и были одобрены локальным этическим комитетом Кубанского государственного медицинского университета (протокол № 21/1 от 23.07.2013).
Крысы были разделены на 4 группы: две контрольные группы, экспериментальную группу и группу сравнения. Контрольную группу 1 составили условно-здоровые крысы (контроль 1, n=10); контрольную группу 2 — прооперированные животные без имплантации (нанесение разреза в области лопатки; контроль 2, n=15). Крысам экспериментальной группы подкожно имплантировали фрагмент децеллюляризированного аллогенного пищевода (группа ДП, n=15). Крысам группы сравнения подкожно имплантировали фрагмент нативного аллогенного пищевода (группа НП, n=15).
Через 7, 14 и 21 сут. имплантаты удаляли и проводили гистологический анализ. Концентрацию IL1a, IL2, IL4, IL17A, TNFa, IFNy и GM-CSF определяли в сыворотке крови крыс на 7, 14 и 21 сут. эксперимента с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
Забор нативного пищевода
Выведение животных выполняли интраперито-неальным введением летальной дозы барбитуратов (150 мг/кг). Выделяли органокомплекс единым блоком с последующей диссекцией пищевода. Отсечение пищевода производили как можно ближе к глотке (проксимальная часть) и пищеводно-желудочному переходу (дистальная часть) для выделения участка пищевода наибольшей протяженности. Проксимальную и дис-тальную часть пищевода канюлировали для фиксации в биореакторе (Harvard Apparatus, Массачусетс, США).
Децеллюляризация пищевода
Пищевод крысы децеллюляризировали детергент-энзиматическим методом с использованием дезоксихо-лата натрия (Sigma Aldrich, Германия) и ДНКазы-I (Sigma Aldrich, Германия) по отработанной ранее нами
методике [4]: пищевод промывали фосфатно-солевым буфером, (ФСБ, pH=7,45; Gibco (Thermo Fisher Scientific), США), содержащим 1% раствор пенициллина-стрептомицина (Gibco (Thermo Fisher Scientific), США); перфузи-ровали деионизированной водой (1 ч.); 4% дезоксихола-том натрия, содержащим 0,0004 М ЭДТА (Sigma Aldrich, Германия) (800 мкл 0,5 М ЭДТА добавляли на 1 л 4% раствора дезоксихолата натрия) в течение 3 ч.; ФСБ в течение 10 мин.; ФСБ с добавлением 2000 ЕД/мг свиной панкреатической ДНКазы-I в течение 1 ч. и снова промывали ФСБ, содержащим 1% раствор пенициллина-стрептомицина (24 ч.). Все растворы были стерильными, комнатной температуры. Скорость подачи растворов составляла 6 мл/мин.
Количественное определение содержания ДНК
Иммуногенность децеллюляризированного матрикса напрямую зависит от количества остаточной ДНК, так как нуклеиновые кислоты распознаются иммунными клетками хозяина.
Для определения количества остаточной ДНК в децеллюляризированном и нативном пищеводах использовали стандартный набор реактивов (Dneasy Blood and Tissue Kit, Qiagen, Швеция). Образцы натив-ного и децеллюляризированного пищеводов (до 25 мг) пропитывали 30% этанолом в течение 10 с. Полученный материал в стерильных условиях переносили в пробирки типа эппендорф и проводили исследование согласно инструкции фирмы-производителя. После пробоподго-товки количество ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., США).
Подкожная имплантация
Образцы ДП и НП (5x5 мм) помещали в подкожный карман на холке крысы и фиксировали двумя швами. Кожную рану ушивали непрерывным швом. Операцию проводили под наркозом с использованием 2% Ксилазина (Alfasan International B.V., Нидерланды), 10 ED, подкожно и Золетила (Virbac Sante Animale, Франция), 8 ED, внутримышечно.
Эксплантация имплантатов
На 7, 1 4 и 21 сут. животных выводили из эксперимента с помощью хлороформа, эксплантировали имплантаты ДП и НП вместе с окружающей их соединительной тканью, измеряли размер имплантированных фрагментов, толщину соединительнотканной капсулы, и обрабатывали образцы для рутинного гистологического исследования.
Гистологическое исследование
Гистологический анализ образцов пищевода выполняли при помощи гистопроцессора TP1020 (Leica, Германия). Образцы НП и ДП фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. После дегидратации препараты заключали в парафин с помощью установки EG1150H (Leica, Германия). На ротационном микротоме RM2235 (Leica, Германия) получали парафиновые срезы образцов толщиной 5 мкм и последовательно проводили депарафинизацию, гидратацию и окрашивание.
Для сравнительной оценки качества децеллюляри-зации образцы НП и ДП окрашивали гематоксилином и эозином (Histolab, Швеция), а также флуорофором DAPI
(4',6-диамидино-2-фени-линдол; Sigma Aldrich, США). Для качественной оценки компонентов ВКМ образцы НП и ДП окрашивали пикрофуксином по Ван Гизону (Первая лабораторная компания, Санкт-Петербург).
Гистологический анализ эксплантированных образцов проводили на 7, 14 и 21 сут. эксперимента после окрашивания гематоксилином и эозином.
Все образцы НП и ДП до и после имплантации исследовали с помощью светового микроскопа (Olympus СХ 41, Япония) при различном увеличении.
Определение концентрации цитокинов
Периферическую кровь у исследуемых крыс забирали на 7, 14 и 21 сут. эксперимента. Пробы хранили при температуре -20 °С. Количество IL1a, IL2, IL4, IL17A, TNFa, IFNy и GM-CSF определяли с помощью ИФА (Platinum ELISA, eBioscience, Австрия) согласно инструкции фирмы-производителя. В основе анализа использовали метод твердофазного ИФА в «сэндвич»-модификации. Результаты оценивали по оптической плотности на микропланшетном ридере Multiskan Ascent (Labsystems, Финляндия) при 450 нм. Уровень цитокинов в сыворотке крови рассчитывали с помощью стандартной кривой.
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы Graph Pad Prism version 6.04, результаты представляли как медиану с верхним и нижним квартилем (Me[Q1;Q3]), для сравнения групп использовали критерий Манна-Уитни и критерий Вилкоксона. Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты
Оценка качества децеллюляризации полученного каркаса пищевода показала, что по сравнению с нативным пищеводом (рис. 1А, Б) в децеллюляризированном пищеводе отсутствовали клеточные ядра (рис. 1В, Г). Стенка децеллюляризированного пищевода сохранила структурную организацию, свойственную нативному органу, и имела те же дифференцируемые оболочки. В пищеводе были сохранены продольные складки, образованные слизистой оболочкой и подслизистой основой, но толщина этих складок была меньше, чем в нативном пищеводе, что привело к увеличению площади просвета органа (рис. 1A, В). Процесс децеллюляризации приводил к уменьшению толщины стенки пищевода, в основном, за счет снижения объема подслизистой основы и мышечной оболочки, что, вероятно, являлось результатом удаления части клеток под воздействием детергента.
При окрашивании DAPI в образцах НП выявлялось свечение клеточных ядер, а в образцах ДП ядерные структуры отсутствовали (рис. 2).
Для оценки наличия волокон ВКМ и их архитектоники использовали окрашивание по методу Ван Гизона, являющегося тропным к компонентам ВКМ (рис. 3).
В нативном органе соединительнотканные элементы присутствовали в основном в участках базальной мембраны и в зоне мышечной оболочки (рис. 3A). В ВКМ децеллюляризированного органа клетки и ядра отсутствовали, детектировались коллагеновые структуры. Структура соединительнотканных волокон не была нарушена. Морфологические признаки изменений структуры и исходного расположения элементов ВКМ пищевода отсутствовали (рис. 3Б).
Рис. 2. Пищевод крысы: А, Б — нативный пищевод, флуоресценция клеточных ядер; В, Г — децеллюляризированный пищевод, свечение ядер отсутствует; аутофлюоресценция компонентов внеклеточного матрикса. Окраска: ОДР!. Ув.: А, В х40; Б, Г х200
Рис. 3. Участок пищевода крысы: А — нативный пищевод; Б — децеллюляризированный пищевод. Окраска по Ван Гизону. Ув. х400
Рис. 4. Содержание ДНК до и после децеллюляризации пищевода крысы: НП — нативный пищевод, ДП — децеллюляризированный пищевод (*р<0,0001)
А ^ - л* Б
ж ^ .у 1 / тж В г /ЯШ \ Г
Рис. 5. Внешний вид раны
при подкожной имплантация
фрагментов нативного (А, Б)
и децеллюляризованного
(В, Г) пищевода крыс, 7 сут:
А, В — образование кожного дефекта,
Б, Г — соединительнотканная капсула
Рис. 6. Фрагменты пищевода крысы после подкожной имплантации: А-В — нативного пищевода, Г-Е — децеллюляризованного пищевода; A, Г — 7 сут., Б, Д — 14 сут., В, Е — 21 сут. Окраска: гематоксилин, эозин. Ув. х200
Количественный анализ содержания ДНК в образцах пищевода показал, что при децеллюляризации было удалено около 92,0% ДНК. В нативном пищеводе содержание ДНК составило 1576,37 ± 279,6 нг/мг, а в децел-люляризированном — 123,85 ± 22,61 нг/мг (рис. 4).
При макроскопическом анализе на месте подкожной имплантации фрагментов НП и ДП на 7 сут. была обнаружена соединительнотканная капсула, однако у крыс с имплантацией фрагментов НП воспалительная реакция была более выраженной и проявлялась значительным кожным дефектом (рис. 5).
При гистологическом исследовании образцов НП на 7 сут. после имплантации была выявлена выраженная воспалительная реакция. На 14 сут. отмечалось незначительное снижение тяжести отека вокруг имплантированного фрагмента НП и выраженная инфильтрация мононуклеарными клетками, что связано с высокой иммуногенностью нативного пищевода и указывает на острое иммунное отторжение. Сам имплантат был отделен от окружающих тканей соединительнотканной капсулой, содержащей кровеносные сосуды. На 21 сут. гистологическая картина характеризовалась выраженной лимфоцитарной инфильтрацией макрофагами фрагмента НП и окружающих тканей в зоне имплантации и значительным уменьшением размера фрагмента НП, ограниченного данной капсулой (рис. 6А, Б, В).
При подкожной имплантации образцов ДП на 7 сут. вокруг них были обнаружены: отек тканей, образование большого количества сосудов в зоне имплантации, слабая воспалительная реакция и формирование зрелой грануляционной ткани с пролиферирующими фибро-бластами и большим количеством сосудов диаметром до 18 мкм. В имплантатах были детектированы базо-фильно окрашенные клетки вытянутой (фибробласто-подобной) формы и лимфомакрофагальная инфильтрация. На 14 сут. объем имплантата снижался, вероятно, за счет уменьшения отека тканей и расстояния между коллагеновыми волокнами децеллюляризированного матрикса, также наблюдалось снижение выраженности воспалительной клеточной инфильтрации. Было отмечено прорастание имплантата новообразованными тонкостенными сосудами диаметром до 14 мкм. На 21 сут. было зарегистрировано дальнейшее
уменьшение размеров имплантата, снижение выраженности воспалительной клеточной инфильтрации вокруг него с преобладанием базофильно окрашенных клеток фибробластоподобной формы. В зоне имплантации образцов появлялось большое количество сосудов диаметром до 10 мкм (рис. 6Г, Д, Е).
Гистоморфологическая картина при имплантации фрагментов НП коррелировала со значимым повышением уровня цитокинов IL17A, TNFa, IL4 (p<0,05) и незначительным повышением уровня GM-CSF и IL2 (p>0,05). Несмотря на длительную воспалительную реакцию концентрации провоспалительных цитокинов IFNy и IL1 a были ниже значений в контрольной группе 1 (p<0,05). Сильный антигенный эффект аллогенных фрагментов НП коррелировал с высокой концентрацией IFNy и относительно низкой концентрацией IL1 a по сравнению со значениями контрольной группы 2. На 14 и 21 сут. эксперимента значимых изменений концентраций всех исследуемых цитокинов, кроме IL4, (p>0,05) (табл.) не произошло: уровень IL1 a стабилизировался и существенно не отличался от значений в обеих контрольных группах. Стоит отметить постепенное снижение уровня IL4 к 21сут. эксперимента в группе сравнения и в контрольной группе 2 по отношению к значениям у интактных крыс.
Через 1 нед. после начала эксперимента содержание IL1 a в сыворотке крови крыс, которым была выполнена подкожная имплантация фрагментов ДП, было значимо выше по сравнению с контрольной группой 1 (p<0,05) и группой Нп (p<0,05), но различий по сравнению с контрольной группой 2 отмечено не было;уровни цитокинов IL2, TNFa, IL4 не отличались от значений контрольной группы 1 (p>0,05) и контрольной группы 2 (p<0,05), при этом концентрация IL4 в группе НП значительно превышала данный показатель в группе ДП (p<0,05), что свидетельствует о менее интенсивной воспалительной реакции у крыс с имплантацией децел-люляризированных матриксов. Следует отметить, что содержание IL17A, IFNy и GM-CSF в группе ДП было достоверно меньше по сравнению с группой интактных крыс (p<0,05, табл., рис. 7А). Уровень IL17A был ниже (p<0,05), а уровень FNy выше (p<0,05) у крыс в группе ДП, чем у крыс группы НП.
Таблица. Содержание цитокинов (пк/мл) в сыворотке крови крыс после подкожной имплантации фрагментов децеллюляризированного матрикса пищевода и нативного пищевода (Ме [О,,;О3]).
Группа GM-CSF ^у Ма ^2 TNFа IL17A ^4
Контрольная группа 1 (интактные крысы)
Контроль 1 72,7 90,6 29,4 428,8 181,4 109,5 0,342
[71,0; 77,2] [54,3; 129,7] [27,1; 31,4] [415,2; 450,8] [157,1; 257,4] [99,4; 116,5] [0,117; 0,963]
Контрольная группа 2 (прооперированные крысы без имплантации)
Контроль 2 69,6 78,5* 67,3* 418,5 164,7* 18,0* 0,693*
7 сутки [66,0; 71,3] [75,6; 80,1] [64,4; 69,7] [414,4; 421,9] [161,7; 166,8] [13,5; 20,1] [0,658; 0,722]
Контроль 2 68,4 84,7 12,3* 405,9* 167,5* 57,8* 0,425*
14 сутки [66,4; 70,2] [81,2; 85,3] [7,9; 16,9] [394,5; 411,2] [162,7; 171,2] [54,5; 60,1] [0,417; 0,429]
Контроль 2 70,1 88,7 18,9* 415,4 174,7 87,7 0,381
21 сутки [63,7; 75,2] [71,9; 95,7] [13,2; 25,9] [369,2; 423,5] [161,7; 178,4] [72,3; 99,3] [0,174; 0,523]
Группа ДП (экспериментальная группа)
Группа ДП 67,2Л 67,7*л 53,9*л 435,6 217,2# 58,1*#л 0,374#л
7 сутки [66,3; 67,9] [63,2; 74,1] [30,4; 76,0] [429,3; 472,6] [171,2; 221,0] [29,1; 64,6] [0,341; 14,037]
Группа ДП 68,0 60,1*#л 33,2#л 433,2 214,6# 8,3*#л 0,418л
14 сутки [66,5;77,6] [49,2; 61,3] [29,9;39,5] [428,9; 463,1] [208,2;215,9] [5,7; 9,4] [0,254;1,199]
Группа ДП 71,0 8,5*#л 11,0* 419,7 212,0# 7,6*#л 0,154*#л
21 сутки [68,5; 73,6] [5,0; 12,0] [8,5; 13,5] [415,2; 424,3] [209,4; 214,6] [4,4; 10,8] [0,077; 0,231]
Группа НП (группа сравнения)
Группа НП 77,3 33,3*# 0,083*# 475,6 236,3*# 164,2*# 2,341*#
7 сутки [76,1; 78,4] [25,7; 41,0] [0,042; 0,125] [459,1; 492,1] [225,5; 247,2] [151,8; 176,6] [1,964; 2,723]
Группа НП 72,5 35,8*# 13,9* 436,2 225,3 134,1*# 1,431*#
14 сутки [71,1; 80,5] [29,7; 40,8] [12,7; 17,1] [412,7; 469,7] [217,5; 269,7] [125,3; 196,6] [1,247; 1,935]
Группа НП 70,7 38,6*# 15,8* 496,4 221,7 108,4 0,834*#
21 сутки [68,8; 73,6] [32,6; 48,4] [9,7; 19,7] [479,1; 512,7] [207,9; 237,1] [96,2; 156,9] [0,551; 0,998]
Примечание: ДП — децеллюляризированный пищевод; НП — нативный пищевод; *— различия значимы по отношению к контрольной группе 1; # — различия значимы по отношению к контрольной группе 2; Л — различия между группами 1 и 2 в соответствующие сроки.
На 14 сут. эксперимента в группе ДП было выявлено резкое снижение концентрации 11_17А по сравнению со значением на 7 сут. эксперимента и контрольными группами 1 и 2 (в 7 раз, 13 раз и 6,9 раз соответственно). Было обнаружено снижение содержания 1_1 а до значений контрольной группы 1 (р>0,05), однако его концентрация не достигла значений контрольной группы 2; было зафиксировано уменьшение концентрации !РЫу по сравнению с 7 сут. (р<0,05, рис. 7Б). Значимых изменений в отношении уровней !_2, ТЫРа, ЭМ-ОБР, !_4 не наблюдалось. Также были обнаружены более высокие концентрации !РЫу и !_1а и более низкие концентрации !_17А и !_4 по сравнению с группой НП, что можно объяснить процессами неоангиогенеза в имплантатах, происходящими в данном временном интервале.
На 21 сут. эксперимента была выявлена динамика снижения содержания !_17А, !РЫу, !_1а у крыс в группе ДП по сравнению с контрольными значениями группы интактных крыс (рис. 7В). По сравнению со сниженной концентрацией этих цитокинов в группе ДП, в группе НП их уровень был более высоким.
Таким образом, на 21 сут. эксперимента в сыворотке крови крыс с подкожной имплантацией фрагментов ДП было показано в основном снижение концентрации провоспалительных цитокинов, что отражает положительную динамику процесса заживления раны и отсутствие локальных процессов воспаления и отторжения.
Обсуждение
Формирование соединительнотканной капсулы вокруг имплантированного материала обусловлено реакцией организма на инородное тело — это очень длительный процесс заживления, обусловленный физическим присутствием имплантата [1 7]. В месте имплантации накапливаются макрофаги для элиминации инородного тела, которые, однако, не могут быстро разрушить материал имплантата, в результате чего образуется макрофагальный вал, отграничивающий имплантат от окружающих тканей. Грануляции характеризуются наличием большого количества кровеносных сосудов, что обусловлено как разрастанием существующих сосудов, так и ростом новых, благодаря миграции клеток-предшественниц эндотелиоцитов и перицитов [17].
При адгезии к поверхности биоматериала и образовании соединительнотканной капсулы макрофаги подвергаются процессу активации, который характеризует морфологические и цитоплазматические изменения, приводящие к взаимодействию комплемента и клеток и, высвобождению внутриклеточных компонентов. При этом провоспалительные цитокины активируют метаболизм соединительной ткани, стимулируют пролиферацию фибробластов и клеток эпителия, что важно для заживления. При избыточной секреции провоспалительных цитокинов и поступлении их в кровь реализуются системные эффекты.
Значительную роль в развитии воспалительного ответа играют гуморальные факторы иммунной системы
Рис. 7. Профиль цитокинов на разных этапах подкожной имплантации фрагментов децеллюляризированного пищевода крыс: A — 7 сут., Б — 14 сут., В — 21 сут. ДП — децеллюляризированный пищевод
специфического и неспецифического иммунитета и локальные эффекторные функции иммунных клеток, близких к источнику антигенной информации. Эти клетки продуцируют цитокины, а также участвуют в распознавании и элиминации других клеток окружающих тканей [18].
Цитокины оказывают влияние почти на все клетки и играют ключевую роль в прогрессировании воспаления путем модуляции активности гранулоцитов, макрофагов, фибробластов, эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов [19]. Их роль в развитии воспаления при травме как на местном, так и на системном уровнях весьма значительна. При системном воспалении цитокины достигают высоких концентраций в кровотоке и вызывают острую реакцию со стороны различных органов и тканей. Существенная роль в воспалительном процессе принадлежит провоспалительным цитокинам, в частности, !_1 а, !_2, !РЫу, !_17А, ТЫРа, которые усиливают пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, синтез антител, молекул адгезии, белков острой фазы и участвуют в реализации специфического и неспецифического иммунитета.
Начало воспалительной реакции связано с нейтро-фильной инфильтрацией и сопровождается повышением уровня !_6, !_8, ТЫРа и !_1а [20]. На 5-7 сут. от начала воспаления их концентрация постепенно снижается и преобладают цитокины, способствующие перси-стированию воспаления и привлечению макрофагов и иммунокомпетентных клеток [21]. На 7 сут. нашего эксперимента у крыс с подкожной имплантацией натив-ных и децеллюляризированных образцов при гистологическом анализе наблюдалась картина адекватной воспалительной реакции.
Данные, полученные в нашей работе для уровня !_1 а в сыворотке крови крыс исследуемых групп, противоречивы: уровень !_1а повышался в контрольной группе 2 по сравнению с контрольной группой 1 и группой ДП, однако при имплантации фрагментов НП подобного увеличения концентрации данного цитокина не происходило. Это может быть связано с неэффективным развитием воспалительной реакции на аллогенный имплантат, что косвенно подтверждается повышением уровня !_17А,
С. Крысы с натиен ым пищеводом (НП]
Рис. 8. Динамика изменения концентрации цитокинов при подкожной имплантации фрагментов децеллюляризированного пищевода крыс, в процентах от значений контрольной группы; *различия статистически значимы при сравнении с контрольной группой 1; #различия значимы между 7 и 14 сут; Лразличия статистически значимы между 7 и 21 сут.
оказывающего сильное воспалительное воздействие на стромальные клетки многих тканей [22, 23] (рис. 8).
Наши результаты согласуются с литературными данными об увеличении концентрации !_1а у крыс с воспалительными ранами [24]. !_1а играет важную роль в метаболизме соединительной ткани, стимулируя пролиферацию фибробластов и выработку простаглан-дина, повышая активность факторов роста и синтез цитокинов [25], стимулируя выработку коллагена и синтез некоторых ферментов [26]. Однако заживление ран может привести к гипертрофическим или келоидным рубцам с появлением грануляционной ткани [27]. Наши эксперименты показали, что в динамике у животных с подкожной имплантацией наблюдается снижение уровня !_1а. Это может иметь благоприятные последствия для уменьшения количества рубцовой ткани при пересадке тканеинженерных конструкций на основе децеллюляризированных каркасов. Данные, полученные при подкожной имплантации нативного пищевода, вероятно, свидетельствуют о негативной регуляции содержания !_1 а противовоспалительным цитокином !_4.
Известно, что !РЫу и ТЫРа обладают иммуномо-дулирующими эффектами; их относят к индукторам клеточного иммунитета, которые функционально связаны с другими важными провоспалительными цитокинами [28-31]. Нами было показано, что в условиях постепенного образования грануляционной ткани количество !РЫу значительно снижается на 21 сут.
эксперимента, обуславливая уменьшение воспаления и низкую иммуногенность децеллюляризированных фрагментов пищевода. Следует отметить, что в развитии воспаления критическую роль играет ТЫРа [32]. Этот цитокин стимулирует пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, выработку антител, синтез молекул адгезии и активацию белков острой фазы [33]. Мы обнаружили, что в условиях подкожной имплантации концентрация ТЫ Ра увеличивалась недостоверно в ходе эксперимента, что можно интерпретировать как отсутствие развития активной адаптивной иммунной реакции на матрикс пищевода. Усиление выработки этого цитокина опосредовано травмой при имплантации фрагментов НП и ДП и, вероятно, свидетельствует о защитно-приспособительной роли умеренного повышения его продукции.
Противовоспалительный цитокин !_4 синтезируется клетками ТИ2 и ТИ3. он является антагонистом провоспалительных цитокинов, подавляет пролиферацию Т-лимфоцитов, участвует в иммунных реакциях на различные антигены [34], снижает уровень !_1а, ТЫРа, оксида азота и простагландинов, что может привести к проявлениям реакций воспалительного процесса [35-37]. В эксперименте было показано, что происходит уменьшение !_4 в сыворотке крови крыс группы ДП по сравнению с контрольной группой 2 и группой НП на 7 сут., что можно рассматривать как прогностический фактор успешной репарации тканей. В то же время, воспалительный процесс индуцирует
выработку иммунокомпетентными клетками противовоспалительных цитокинов, а равновесие между эффектами про- и противовоспалительных цитокинов влияет на его исход [18]. Так, на 7 сут. было выявлено повышение концентрации !_4 в сыворотке крови крыс с подкожной имплантацией образцов НП в 6 раз по сравнению с концентрацией данного цитокина как в контрольной группе 1, так и в группе ДП. Повышение его уровня коррелировало с повышением уровня ТЫРа, что свидетельствует о его компенсаторной роли и регуляции продукции ТЫРа, синтезируемого в ответ на оперативное вмешательство и использование имплантата [21].
Заключение
Изучение постимплантационного системного иммунного ответа на децеллюляризированные матриксы для создания тканеинженерных конструкций пищевода имеет важное значение при разработке оптимальных методов тканевой инженерии, как в гастроэнтерологии, так и в других областях. В результате эксперимента было выявлено, что изменение концентраций изучаемых цитокинов соответствует гистоморфологической картине с положительной динамикой в группе животных,
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Costa F., Silva R., Boccaccini A.R. Fibrous protein-based biomaterials (silk, keratin, elastin, and resilin proteins) for tissue regeneration and repair. In: Barbosa M.A., Martins C.L., editors. Peptides and proteins as biomaterials for tissue regeneration and repair. Cambridge: Woodhead Publishing; 2018. p. 175-204.
2. Londono R., Badylak S.F. Regenerative medicine strategies for esophageal repair. Tissue Eng. Part B-Re. 2015; 21(4): 393-410.
3. Cui H., Chai Y., Yu Y. Progress in developing decellularized bioscaf-folds for enhancing skin construction. J. Biomed. Mater. Res. Part A 2019; 107A: 1849-59.
4. Губарева Е.А., Куевда Е.В., Быков М.И. и др. Оптимизация протокола децеллюляризации с целью сохранения ангиогенных свойств биологического каркаса пищевода. Медицинский вестник Северного Кавказа 2019; 14(1.2): 186-92. [Gubareva E.A., Kuevda E.V., Bykov M.I. et al. Optimization of the decellularization protocol with the purpose of preserving the angiogenic properties of the biological scaffold. Medical Bulletin of the North Caucasus 2019; 14(1.2): 186-92].
5. Kwon T., Moon K.H. Decellularization. In: Kim B., editor. Clinical regenerative medicine in urology. Singapore: Springer; 2018. p. 125-41.
6. Сотниченко А.С., Губарева Е.А., Куевда Е.В. и др. К вопросу о морфологических критериях децеллюляризации органов и тканей. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2017; 19(3): 65-9. [Sotnichenko A.S., Gubareva E.A., Kuevda E.V. et al. Modern outlook on morphological criteria of organ and tissue decellularization. Russian Journal of Transplantology and Artificial Organs 2017; 19(3): 65-9].
7. Arakelian L., Kanai N., Dua K. et al. Esophageal tissue engineering: from bench to bedside. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2018; 1434(1): 156-63.
8. Anderson J.M. Biological responses to materials. Annu. Rev. Mater. Res. 2001; 31(1): 81-110.
9. Sheikh Z., Brooks P.J., Barzilay O. et al. Macrophages, foreign body giant cells and their response to implantable biomaterials. Materials 2015; 8: 5671-701.
10. Mintern J.D., Villadangos J.A. Editorial overview: New proteins, cellular processes and intercellular interactions involved in antigen presentation. Curr. Opin. Immunol. 2019; 58: III-IV.
11. Ishii M. Imaging of inflammation and regeneration: a novel trend dissecting dynamic features of biological phenomena in vivo. Inflamm. Reg. 2017; 37(26): 1-2.
12. Domaga a-Kulawik J., Radkowski M., Stelmaszczyk-Emmel A. et al. Cytokine network in relation to regulatory cells in lung cancer microenvironment. Eur. Respir. J. 2017; 50(61): PA4211.
13. Азарова Д.А., Чумакова С.П., Уразова О.И. и др. Интерлейкины 4 и 6 как факторы модуляции субпопуляционного состава моноцитов крови у больных ишемической кардиомиопатией. Казанский медицинский журнал 2018; 99(6): 900-5. [Azarova D.A., Chumakova S.P., Urazova O.I. et al. Interleukins 4 and 6 as factors of modulation of subpopulation composition of blood monocytes in patients with ischemic cardiomyopathy. Kazan medical journal 2018; 99(6): 900-5].
14. Паскова Е.В., Шахгельдян К.И., Маркелова Е.В. Оценка динамики содержания интерлейкина-17 и интерлейкина-4 в сыворотке крови при посттравматическом остеомиелите нижней челюсти. Клиническая стоматология 2019; 2: 62-4. [Paskova E.V., Shahgeldyan K.I., Markelova E.V. Assessment of interleukin-17 and interleukin-4 in blood serum in posttraumatic osteomyelitis of the mandible. Clinical dentistry 2019; 2: 62-4].
которым выполняли имплантацию децеллюляризиро-ванных матриксов и активной воспалительной реакции в группе с имплантацией фрагментов нативного алло-генного пищевода. Снижение концентрации !_1 а, !_4, !1_17А и !РЫу на 21 сут. после имплантации децеллюлю-ляризированных фрагментов отражает положительную динамику процесса заживления раны и отсутствие локальных процессов воспаления и отторжения децел-люляризированных матриксов.
Благодарности
Работа проведена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации по теме «Разработка и создание экспериментальных образцов тканеинженерных конструкций на основе биологических (децеллюляризованных) матриксов для применения в регенеративной медицине» (рег. номер АААА-А18-118122690051-6).
Работа была выполнена при частичной поддержке комплексной НИР «Клеточные механизмы регенерации. Разработка тканеинженерных конструкций с использованием биологических и синтетических каркасов» (рег. номер № АААА-А16-116042550089-5).
15. Унт Д.В., Лобов Г.И. Сократительная функция лимфатических узлов: эффекты интерлейкина-1р и интерлейкина-2. Современные проблемы науки и образования 2016; 5, http://www.science-education.ru/ ru/article/view?id=25149 . [Unt D.V., Lobov G.I. Contractile function of the lymph nodes: effects of interleukin IL-1 p and interleukin-2. Modern Problems of Science and Education 2016; 5, http://www.science-education.ru/ru/ article/view?id=25149].
16. Газатова Н.Д., Меняйло М.Е., Малащенко В.В. и др. Прямые эффекты гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора на функциональные свойства моноцитов/макрофагов человека. Медицинская иммунология. 2019; 21(3): 419-25. [Gazatova N.D., Meniailo M.E., Malashchenko V.V. et al. Direct effects of GM-CSF on the functions of human monocytes/macrophages. Medical Immunology 2019; 21(3): 419-25].
17. Gunay H., Staufenbiel I., Geurtsen W. et al. The granulation tissue preservation technique in regenerative therapy of peri-implantitis — a treatment concept with case reports. Dtsch. Zahnarztl. Z. Int. 2019; 1: 4-15.
18. Raetska Y.B., Chornenka N.M., Koval T.V. et al. Cytokine profile indicators in rat blood serum in a model of esophagus burn induced by antioxidant chemical preparation. Biomed. Res. Ther. 2017; 4(9): 1591-606.
19. Rizza R., Moretti F., Capone I. et al. Role of type I interferon in inducing a protective immune response: perspectives for clinical applications. Cytokine Growth F. R. 2015; 26(2): 195-201.
20. Карагодин В.П., Бобрышев Ю.В., Орехов А.Н. Воспаление, имму-нокомпетентные клетки, цитокины — роль в атерогенезе. Патогенез 2014; 12(1): 21-35. [Karagodin V.P., Bobrishev J.V., Orekhov A.N. Inflammation, immunocompetent cells, cytokines — a role in atherogenesis. Pathogenesis 2014; 12(1): 21-35].
21. Sun B.K., Siprashvili Z., Khavari P.A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science 2014; 346(6212): 941-5.
22. Tesmer L.A., Lundy S.K., Sarkar S. et al. Th17 cells in human disease. Immunol Rev. 2008; 223: 87-113.
23. Ouyang W., Kolls J.K., Zheng Y. The biological functions of T helper 17 cell effector cytokines in inflammation. Immunity 2008; 28(4): 454-67.
24. Agarwal N. UVR and role of pigmentation in skin aging and cancer. In: Dwivedi A., Agarwal N., Ray L. et al. editors. Skin Aging & Cancer. Singapore: Springer; 2019. p. 59-69.
25. Duncan M.R., Berman B. Differential regulation of collagen, glycos-aminoglycan, fibronectin, and collagenase activity production in cultured human adult dermal fibroblasts by interleukin 1-alpha and beta and tumor necrosis factor-alpha and beta. J. Invest. Dermatol. 1989; 92(5): 699-706.
26. Зорин В.Л., Зорина А.И., Петракова О.С. и др. Дермальные фибробласты для лечения дефектов кожи. Гены & Клетки 2009; IV(4): 26-40. [Zorin V.L., Zorina A.I., Petrakova O.S. et al. Dermal fibroblasts for the treatment of skin defects. Genes & Cells 2009; IV(4): 26-40].
27. Rahimnejad M., Derakhshanfar S., Zhong W. Biomaterials and tissue engineering for scar management in wound care. Burns & Trauma 2017; 5: 4.
28. Razaghi A., Owens L., Heimann K. Review of the recombinant human interferon gamma as an immunotherapeutic: impacts of production platforms and glycosylation. J. Biotechnol. 2016; 240: 48-60.
29. Fiorillo L., Cervino G., Herford A.S. et al. Interferon crevicular fluid profile and correlation with periodontal disease and wound healing: A systemic review of recent data. Int. J.M. Sci. 2018; 19(7): 1908-18.
30. Chen K., Liu J., Cao X. Regulation of type I interferon signaling in immunity and inflammation: A comprehensive review. J. Autoimmun. 2017; 83: 1-11.
31. Lima M.S.R., de Lima V.C.O., Piuvezam G. et al. Mechanisms of action of molecules with anti-TNF-alpha activity on intestinal barrier inflammation: A systematic review protocol. Medicine 2019; 98(39): 17285-300.
32. Kim Y.S., Morgan M.J., Choksi S. et al. TNF-induced activation of the Nox1 NADPH oxidase and its role in the induction of necrotic cell death. Mol. Cell 2007; 26(5): 675-87.
33. Литвицкий П.Ф., Синельникова Т.Г. Врожденный иммунитет: механизмы реализации и патологические синдромы. Часть 4. Вопросы современной педиатрии 2009; 8(4): 95-101. [Litvitsky P.F., Sinelnikova T.G. Congenital immunity: mechanisms of realization and
pathological syndromes. Part 4. Questions of modern pediatrics 2009; 8(4): 95-101].
34. Li-Weber M., Krammer P.H. Regulation of IL4 gene expression by T cells and therapeutic perspectives. Nat. Rev. Immunol. 2003; 3(7): 534-43.
35. Weiner H.L. Induction and mechanism of action of transforming growth factor-beta-secreting Th3 regulatory cells. Immunological Reviews 2001; 182(1): 207-14.
36. Franz S., Rammelt S., Scharnweber D. et al. Immune responses to implants — a review of the implications for the design of immunomodulatory biomaterials. Biomaterials 2011; 32(28): 6692-709.
37. Julier Z., Park A.J., Briquez P.S. et al. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system. Acta Biomaterialia 2017; 53: 13-28.
