CC BY
58
ГЕПАТОСПЕЦИфИЧЕСКИй МЕЛКОДИСПЕРСНый МАТРИКС
как важный компонент имплантируемых клеточно-инженерных конструкций вспомогательной
ПЕЧЕНИ
Н.А. Онищенко 1, М.Е. Крашенинников 2, М.Ю. Шагидулин12, М.М. Боброва 3, В.И. Севастьянов 1, С.В. Готье 1 2
1 Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени акад. В.И. Шумакова, Москва, Россия
2Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва, Россия
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Hepato-specific small-dispersioned matrix as the important component of implanted cell-engineering designs for an auxiliary liver
NA. Onischenko 1, M.E. Krasheninnikov 2, M.Y. Shagidulin 1■2, M.M. Bodrova 3, V.I. Sevastjanov1, S.V. Gautier12
1 Academican V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Moscow, Russia
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia
3 M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
Современные биомедицинские технологии уже позволили создать биосовместимые и биодеградируемые матрик-сы, однако разработка и применение тканеспецифических матриксов остается актуальной проблемой современной тканевой инженерии
Цель работы — показать, что мелкодисперсный матрикс из децеллюляризированной печени (ДЦП), полученный по разработанной авторами технологии, пригоден для изготовления клеточно-инженерных конструкций вспомогательной печени
В работе изложена технология изготовления мелкодисперсного матрикса из ДЦП; с помощью методов световой, фазово-контрастной и электронной микроскопии охарактеризованы его микроструктура и биологические свойства Для определения сохранности гепатоспецифиче-ских свойств матрикса, изготовленного из ДЦП, проведена количественная оценка результатов МТТ-теста на 5 сут . раздельного культивирования на матриксе 4 видов клеток (HepGг, клеток почечного эпителия, мультипотентных ме-зенхимальных стромальных клеток костного мозга и клеток печени крыс).
При микроскопическом исследовании мелкодисперсного матрикса из ДЦП была выявлена его пористая структура, на поверхности которой присутствовали сохранившиеся молекулы нативного внеклеточного матрикса При сравнительном анализе адгезивных свойств мелкодисперсного матрикса из ДЦП и матрикса Цитодекс-3 показано, что они обладают способностью адгезировать различные виды клеток . Кроме того, у матрикса из ДЦП сохранена гепато-тропная активность
Сохранение биосовместимости и гепатотропной активности мелкодисперсного матрикса из ДЦП, изготовленного по предложенной нами технологии, позволяет рекомендовать его для изготовления трансплантируемых клеточно-инженерных конструкций вспомогательной печени
Ключевые слова: децеллюляризация печени, мелкодисперсный матрикс, тканеспецифический матрикс, кле-точно- и тканеинженерные конструкции
Biocompatible and biodegraded matrixes have already framed by the modern biomedical technologies however working out and application of tissue-specific matrixes remains an actual problem of the modern tissue engineering
Aim of this work is to show that the technique, which is proposed by the authors for producing of small-dispersioned matrices of decellularization liver (DCL), is good for the making of cell-engineering designs of auxiliary liver
The paper presents the technology of producing the small-dispersioned matrix of DCL and the results of using the light, phase- contrast and electron microscopy to characterize the biological properties of the made matrix The hepato-specific properties of the matrix have been studied by using a quantitative evaluation of the MTT-test results on the 5th day of separate cultivation on this matrix 4 types of cells (HepG2, renal epithelial cells, bone marrow MSCs and liver cells from allogeneic donors).
On photographs of microscopic examination of the matrix particles of DCL it was seen their porous structure, on the surface of which the preserved conglomerates of native extracellular matrix molecules were presented At comparative study of adhesive properties of the Cytodex-3 matrix particles and the small-dispersioned matrix of DCL it was found out that both matrices had the ability to adhere different cell types, but the matrix of DCL had the ability to preserve of hepato-specific activity significantly expressed
Keeping of biocompatibility and hepato-specific properties by small-dipersioned matrices of DCL, produced on the proposed technology, allows to recommend them for the making of implantable cell-engineering designs of auxiliary liver
Keywords: liver decellularization, small-dispersioned matrices, tissue-specific matrix, cell- and tissue-engineered constructions
Введение
По современным представлениям долгосрочная коррекция тяжёлых нарушений структуры и функции печени в организме при печёночной недостаточности может быть обеспечена с помощью трансплантируемых в печень клеточно-инженерных конструкций, созданных на основе принципов тканевой инженерии [1].
e-mail: allanik64@yandex. ru
Тканевая инженерия печени предназначена для создания in situ с помощью тканеспецифических (гепатоспецифических) матриксов условия для формирования de novo гепатоподобных структур (клеточно-матриксных ассоциатов), длительное функционирование и интеграция которых с печенью реципиента должны происходить за счёт гепатоспе-цифических регуляторных сигналов, поступающих
к ним из нативного матрикса и из сохранившейся ткани печени реципиента .
Длительное функционирование вновь образованных тканеподобных конструкций в печени должно, в свою очередь, создавать условия для восстановительной реконструкции всей повреждённой печени путём перепрограммирования в ней процессов регенерации с фиброзирующего типа на дефибро-зирующий . Однако трансплантируемых длительно функционирующих нативных гепатоспецифических клеточно-инженерных конструкций пока нет ни в нашей стране, ни за рубежом
Основным элементом для создания таких кле-точно-инженерных эквивалентов печёночной ткани должен стать нативный гепатоспецифический ма-трикс . Понимание того, что только тканеспецифиче-ский матрикс может быть оптимальным субстратом для заселения его специализированными клетками, способными к пролиферации и межклеточному взаимодействию, подтверждают многочисленные публикации последних лет по разработке технологии децеллюляризации паренхиматозных органов: почек [2], сердца [3, 4], легких [5], печени [6—8]. Полагают, что децеллюляризированные матриксы сохраняют тканевую специфичность соответствующих органов за счёт внеклеточных нативных ма-триксных белков, которые интегративно содержат в своем составе остатки тканевых структур (гликопро-теиды, структурные белки межклеточных контактов и пептидные последовательности для адгезии клеток) и позволяют оптимизировать условия для пролонгированной жизнедеятельности прикрепившихся клеток без дополнительной подготовки (модифицирования) их поверхности
Установлено, что в структуре децеллюляризи-рованной печени (ДЦП) сохраняется до 19% VEGF, 13% iGF-1, 19% HGF и 20% bFGF по сравнению с их содержанием в нативной печени [9]
Между тем, проблема рецеллюляризации (ревита-лизации) отмытого от клеток целого децеллюляризи-рованого органа, в частности, печени путём длительного (до 18 ч . ) перфузионного реинженеринга через сосудистое русло в настоящее время не решена из-за сложности процесса рецеллюляризации [10]. Клетки, используемые для рецеллюляризации, должны не только пройти сквозь толщу сосудистой стенки и расположиться на её наружной стороне, но и сохранить жизнеспособность, способность обеспечивать регуляцию межклеточных взаимодействий, а также участие в формировании адекватной биологической функции вновь реконструируемой ткани печени
Таким образом, для создания имплантируемых клеточно-инженерных конструкций, обеспечивающих пролонгированную коррекцию восстановительных процессов в повреждённых органах (печени), необходима разработка доступного, дешевого и универсального способа получения нативных ма-триксов с тканеспецифическими свойствами, которые могли бы быть использованы для простого и быстрого заселения их соответствующими донорскими клетками
Цель работы — показать, что мелкодисперсный матрикс из децеллюляризированной печени, полученный по разработанной нами технологии, биосовместим, сохраняет гепатотропную активность, и,
следовательно, пригоден для изготовления клеточно-инженерных конструкций вспомогательной печени .
Материал и методы
Разработка технологии изготовления мелкодисперсного тканеспецифического матрикса печени проводилась на крысах-самцах породы «Вистар» (n = 40) массой 200±20 г . Все манипуляции с лабораторными животными выполнялись в соответствии с правилами «Европейской конвенции защиты позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» .
Техника децеллюляризации печени
Медикаментозную защиту микроциркуляторного русла печени и профилактику внутрисосудистой агрегации форменных элементов крови проводили перед эксплантацией (изъятием) печени за 40—100 мин . до начала перфузионной отмывки её от крови путём внутримышечного введения донору дезагрегантов: трентала (Aventis, Россия) в дозе 5—10 мг/кг массы донора и гепарина (Московский эндокринный завод, Россия) в дозе 500 МЕ . Далее под эфирным (ингаляционным) наркозом канюлировали воротную вену и осуществляли in situ перфузионную отмывку донорской печени от крови физиологическим раствором, забуференным фосфатами (invitrogen/ Gibco, Великобритания): 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, pH 7,4 (PBS) и содержащим гепарин в дозе 50 МЕ/мл . Длительность отмывки печени от крови in situ составляла 5—7 мин . Перфузию выполняли по воротной вене с объёмной скоростью перфузии 25—27 мл/мин . 100—150 мл перфузионного раствора . Затем осуществляли эксплантацию (изъятие) донорской печени
Децеллюляризацию изолированной и отмытой от крови печени проводили ex vivo перфузией растворами детергентов с постепенно повышающейся концентрацией в течение 48—72 ч . через воротную вену с объёмной скоростью перфузии 30—70 мл/мин в рециркуляторном режиме, используя последовательно 3 раствора:
a) 150 мл PBS, содержащего 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, США) и 0,1% додецилсульфата натрия (SDS, Sigma-Aldrich, США), применяли в течение 1,5 ч . , заменяли на свежий раствор того же состава (100 мл) и продолжали перфузию не менее 5 ч . ;
b) 150 мл PBS, содержащего 2% Triton X-100 и 0,1% SDS, применяли в течение 12 ч . , заменяли на свежий раствор (100 мл) и продолжали перфузию в течение 4 ч ;
c) 150 мл PBS, содержащего 3% Triton Х-100 и 0,1% SDS, применяли в течение 12 ч . , затем заменяли на свежий раствор (100 мл) и продолжали перфузию не менее 3 ч
Децеллюляризированную печень отмывали от детергентов перфузией 150—200 мл PBS, с трёх-, четырехкратной заменой раствора на свежий через каждый час перфузии в рециркуляторном режиме не менее 12 ч
На рис . 1 представлен внешний вид печени до и после её децеллюляризации
Рис. 1.
Внешний вид печени до (А) и после (Б) децеллюляризации
Технология изготовления мелкодисперсного
матрикса из ДЦП
Разработанная нами технология изготовления мелкодисперсного матрикса [11] включала первоначальное пропитывание децеллюляризированного органа раствором криопротектора . Сосудистое русло децеллюляризированной печени (матрикс) перфузи-ровали криопротекторным раствором PBS с pH 7,4, содержащим 1% сывороточного альбумина (Sigma, США) и 10-15% глицерина (Sigma, США) или 10-15% диметилсульфоксида (DMSO, Sigma, США) . Объём используемого криопротекторного раствора был равен двойному объёму сосудистого русла децеллюляризированного органа
Для печени крысы объём раствора криопро-тектора составлял 10 мл, объёмная скорость перфузии — 150 мл/час . После насыщения органа криопротектором децеллюляризированную печень измельчали с помощью скальпеля и ножниц до образования частиц размером от 0,5 до 4 мм . Полученные фрагменты матрикса разделяли на порции массой 5—10 г и замораживали, погружая в жидкий азот (t = -196°С) на 10 мин . Замороженные фрагменты децеллюляризированного матрикса быстро механически измельчали в фарфоровой ступке до порошкообразной консистенции на льду Для удаления из полученной массы частиц размером более 600 мкм использовали сито с квадратными ячейками размером 200x200 мкм (40 mesh) . Затем отделяли частицы размером менее 200 мкм, продавливая материал через сито с размером ячеек 130x130 мкм (60 mesh) Полученную мелкодисперсную фракцию размораживали ресуспендированием (погружением) в 30—70 мл раствора PBS при комнатной температуре в течение 3—5 мин . Общая масса матрикса с размером частиц 200—600 мкм, выделенных из одной печени крысы, составляла ~ 0,8 г .
Для сохранения нативных свойств мелкоди-сперстного матрикса проводили лиофилизацию: матрикс массой до 10 г . замораживали в сублимационной камере в течение 8 ч . при температуре -35°С, затем высушивали в вакууме под давлением 2—10 Па и температуре нагрева не выше 35°С в течение 2 сут . Образцы матрикса стерилизовали у-облучением в дозе 15 кГр . Стерильный децел-люляризированный порошкообразный матрикс сохраняли до 6 мес . при t = 4—6°С для дальнейшей рецеллюляризации клетками
На рис . 2 представлен мелкодисперсный матрикс печени после лиофилизации в сублимационной камере, подготовленный к рецеллюляризации
Размер пор децеллюляризованного нативного матрикса печени крысы, изготовленного в виде сухого порошка, варьировал от 50 до 100 мкм . Суммарная пористость полученного матрикса не превышала 80% . Указанные характеристики полученного нами мелкодисперстного децеллюляризированного натив-ного матрикса печени признаны наиболее адекватными для культивирования гепатоцитов в биоинженерных конструкциях [12].
Методы изучения свойств мелкодисперсных
нативных матриксов из ДЦП
Для доказательства сохранения гепатотропных свойств мелкодисперсных матриксов, полученных из децеллюляризированной печени, было проведено заселение матриксов четырьмя различными типами клеток: аллогенными клетками печени, клетками линии человеческой гепатомы — HepG2, аллогенными мультипотентными мезенхимальными стромальны-ми клетками костного мозга (ММСК КМ) и аллогенными клетками почечного эпителия. Оценку гепатотропных свойств матриксов осуществляли путём сравнения адгезии и жизнеспособности указанных типов клеток при культивировании их на порошкообразных (мелкодисперсных) матриксах, изготовленных из ДЦП . В качестве контролей использовали Цитодекс-3 (контроль универсального матрикса), представляющий собой мелкодисперсный полимер — серфадекс, покрытый коллагеном (Farmacia, Швеция), и культуральный пластик (Corning Costar, США) .
Рис. 2. Мелкодисперсный лиофилизированный матрикс, изготовленный из децеллюляризированной печени
Методы получения клеток и заселения ими
матриксов
Аллогенные клетки печени получали из отмытой от крови печени крыс неперфузионным методом, который включал механическое измельчение печени на холоде с последующей обработкой полученных фрагментов 0,05% раствором коллагеназы iV типа (invitrogen/Gibco Великобритания) [13].
Суммарный выход клеток печени из целого органа составлял 2,5—4,0х108 . Клеточная суспензия содержала гепатоциты и непаренхиматозные клетки печени, которые выявляли методом световой микроскопии . Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполняли
После отмывки PBS суспензию выделенных клеток печени центрифугировали, ресуспензировали в питательной среде DMEM/F-12 (ПанЭко, Россия), содержащей 10% FCS (invitrogen/Gibco, Великобритания), 50 мкг/мл гентамицина (invitrogen/Gibco, Великобритания) и специфические добавки (перечень добавок приведен ниже), а затем использовали для культивирования на исследуемых матриксах . Жизнеспособность выделенных клеток печени по окрашиванию трипановым синим достигала 72—80% .
Клетки почечного эпителия получали из почек эмбрионов крыс также неперфузионным методом путём механического измельчения почки на холоде с последующей обработкой полученных фрагментов 0,25% раствором трипсина (ПанЭко, Россия) [14].
ММСК из костного мозга крыс выделяли по общепринятой методике [15]. Клетки HepG2 были предоставлены Институтом канцерогенеза (Москва).
Заселение клетками частиц матрикса из ДЦП и матрикса Цитодекс-3 (размеры частиц 250—350 мкм) проводили по отработанной нами методике [13]: 250 мкл влажного децеллюляризированного матрикса, содержащего 3,5—3,8х1012 частиц, смешивали с 1мл суспензии одного из четырех видов клеток (1х10в кл/мл), помещали в стерильные чашки Петри (d = 35мм, Greiner, Германия) и заливали питательной средой DMEM/F-12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 мкг/мл гентамицина и специфические добавки . Общий объём суспензии составлял 3,0 мл
При культивирования разных видов клеток использовали следующие добавки:
— клетки печени: 20 мкг/мл EGF (Epidermal growth factor, invitrogen/Gibco, Великобритания), 20 mM HEPES (Sigma, США), 40 мкг/мл HGF (Hepatocyte growth factor, ProSpec, Израиль), 0,08 МЕ/мл инсулин (Хумулин NPH, Швейцария), 10-9 M дексамета-зон (Виал, Россия), 1 mM этаноламин (Sigma, США)
— клетки HepG2: 20 мМ Hepes;
— клетки почечного эпителия: 20 мкг/мл EGF, 20 mM HEPES, 0,08 МЕ/мл инсулин, 10-9 M декса-метазон, 1 mM этаноламин;
— ММСК костного мозга: 20 нг/мл bFGF (Basic fibroblast growth factor, ProSpec, Израиль), 0,08 МЕ/мл инсулин, 10-9 M дексаметазон, 1 mM этаноламин .
Клетки на матриксе из ДЦП и Цитодексе-3 (5 повторов для каждого типа клеток) выдерживали в СО2-инкубаторе при стандартных условиях в течение 5 сут без замены питательной среды, после чего изучали их адгезию и жизнеспособность
Кроме того, перечисленные виды клеток без ма-триксов высевали на культуральный пластик и инкубировали в тех же условиях (контроль адгезии).
Методы исследования
Функциональную оценку гепатотропной активности мелкодисперсных матриксов проводили методом Mossman (МТТ-тест) [16].
Мтт-тест основан на колориметрическом определении активности митохондриального дыхания клеток, благодаря способности дегидро-геназ живых клеток восстанавливать неокрашенную форму 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромида (МТТ-реагент) с образованием кристаллов формазана фиолетового цвета, растворимых в ДМСО .
Мтт-тест проводили после 5 сут раздельной инкубации четырёх видов клеток в одинаковой концентрации на исследуемом и контрольном матрик-сах Для точной оценки количества клеток, прикрепившихся к гранулам матрикса, содержимое каждой чашки аккуратно ресуспензировали, центрифугировали при 1000 об/мин . в течение 5 мин . , к осадку добавляли 0,8 мл питательной среды и переносили в 24-луночный планшет, исключая, таким образом, из измерения клетки, прикрепившиеся к пластику чашек . В каждую лунку добавляли по 200 мкл МТТ-реагента и инкубировали в течение 4 ч . при 37°С, что приводило к образованию нерастворимых в воде фиолетовых кристаллов . Далее среду удаляли, вносили по 250 мкл ДМСО для растворения кристаллов, и полученный окрашенный раствор переносили в 96-лу-ночный планшет Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (Picon incorporated company, Униплан, Россия) при длине волны 540 нм .
Для гистологического исследования образцы ма-трикса из ДЦП фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, дегидратировали и заключали в парафин по стандартной методике Срезы из образцов фиксированных тканей окрашивали гематоксилином и эозином, для выявления соединительно-тканного остова внеклеточного матрикса — по Маллори Отдельно готовили срезы из образцов фиксированных тканей для фазово-контрастной микроскопии на микроскопе Carl Zeiss Axiovert 25 (Jena, Германия) с камерой Axio Cam HRC (Carl Zeiss, Германия) Для сканирующей электронной микроскопии образцы матрикса из ДЦП фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида в 0,1 М какодилатном буфере (Merck, Германия) в течение 2 ч . После промывки образцы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, высушивали в течение ночи в термостате и напыляли золотом толщиной 20 нм в атмосфере аргона при ионном токе 6 мА и давлении 0,1 мм рт . ст . с использованием прибора ion Coater iB-3 (Eiko Engineering Muto, Япония). Исследования проводили на сканирующем электронном микроскопе Camscan-S2 (Cambridge instruments, Великобритания) Разрешение микроскопа 10 нм, рабочее напряжение 20 кВ Изображения получали с помощью программного обеспечения Merco Capture (SMA) .
Статистический анализ
Статистическую обработку количественных результатов МТТ-теста осуществляли методами вариационной статистики на компьютере с использованием специального статистического пакета Biostat . Достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали по t-критерию Стьюдента;
различия считали статистически значимыми при р<0,05 (статистический пакет, рекомендованный ВОЗ ЕрПпЬ 5 . 0).
Результаты и обсуждение
Децеллюляризованные мелкодисперсные ма-триксы не должны содержать клеток, но должны сохранять тканеспецифические свойства . В процессе проведённой нами децеллюляризации ткань печени утрачивала присущий ей тёмно-красный цвет (рис . 1А) и приобретала молочно-белую окраску (рис . 1Б), которая характерна для всех децеллюля-ризированных тканей [17].
Окраска гематоксилином и эозином срезов ин-тактной (рис . 3А) и децеллюляризированной ткани печени (рис. 3Б), позволила путем сравнительного анализа установить сохранность пространственной микроструктуры этой ткани после децеллюляриза-ции и отсутствие в ней клеток. Из рис . 3Б видно также, что волокна внеклеточного матрикса местами содержат более окрашенные эозинофильные (белковые) включения, которые, вероятно, и должны предопределять наличие гепатотропных свойств изготовленного нативного матрикса .
Исследование срезов ткани ДЦП методом фазо-во-контрастной микроскопии показало, что внеклеточный матрикс, состоящий преимущественно из волокон коллагена, после децеллюляризации сохраняет свой структурный остов (рис . 3Б) .
С помощью метода сканирующей электронной микроскопии удалось также обнаружить, что после децеллюляризации печени на волокнах внеклеточного матрикса присутствуют глыбчатые образования, которые, по-видимому, являются именно теми белковыми молекулами, которые, как мы полагаем, должны предопределять специфические свойства нативных мелкодисперсных матриксов (рис. 4) .
Между тем, выявление целостности структурного остова децеллюляризированных тканей и скопление конгломератов белковых молекул на волокнистых структурах матрикса ещё не доказывало сохранности адгезивных свойств матриксов и самое главное сохранности их тканеспецифических свойств
Культивирование клеток НерС2, клеток печени, почек и ММСК костного мозга на 3 различных типах матриксов — культуральном пластике, Цитодексе-3 (контроль матрикса) и мелкодисперсных фрагментах ДЦП — показало, что клетки различных фенотипов прикреплялись ко всем используемым матриксам после 5 сут . культивирования (рис . 5—7). Такой результат культивирования клеток на матриксах позволяет заключить, что мелкодисперсные матрик-сы из ДЦП после процедуры децеллюляризации не утрачивают свои адгезивные свойства Однако было отмечено, что из-за большей кривизны поверхности матрикса из ДЦП по сравнению с Цитодексом-3 клетки на них не распластываются и, таким образом, сохраняют свою полярность, необходимую для выполнения специализированных функций .
Рис. 3. Микроструктура ткани печени крысы до (А) и после (Б и В) децеллюляризации . Окраска: А, Б — гематоксилин и эозин; В — фазовый контраст . Ув . : А х100; Б, В х200
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
59
Рис. 5. Адгезия клеток линии HepGг к различным типам матриксов: А — к культуральному пластику; Б — к гранулам Цитодекса-3;
В — к фрагментам ДЦП; стрелками обозначены прикрепившиеся не распластанные клетки . А — микроскопия по Номарскому;
Б — прямая просвечивающая микроскопия с окрашиванием трипановым синим; В — прямая просвечивающая микроскопия . Ув .х200
Рис. 6. Адгезия ММСК костного мозга к различным типам матриксов: А — к культуральному пластику, Б — к гранулам Цитодекса-3,
В — к фрагментам ДЦП; стрелками обозначены прикрепившиеся не распластанные клетки . А, Б — микроскопия по Номарскому; В — прямая просвечивающая микроскопия . Ув .: А, Б х200; В х100
Рис. 7. Адгезия клеток печени крысы к различным типам матриксов: А — к культуральному пластику; Б — к гранулам Цитодекса-3;
В — к фрагментам ДЦП; стрелками обозначены прикрепившиеся не распластанные клетки . А — фазово-контрастная микроскопия, Б — микроскопия по Номарскому,
В — прямая просвечивающая микроскопия с окрашиванием трипановым синим . Ув .: А, Б х200; В х100
Для выявления сохранности гепатотропных свойств матрикса из ДЦП крысы была проведена количественная оценка результатов МТТ-теста на 5 сут . раздельного культивирования четырёх видов
клеток: клеток линии Нер32 клеток печени, клеток почечного эпителия и ММСК КМ от аллогенных доноров, засеянных в одинаковой дозе (1х106 клеток) на матрикс из ДЦП и Цитодекс-3 (рис . 8) .
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
11
Без клеток HepG2 Почечный ММСК КМ Клетки
Рис. 8. Результаты МТТ-теста после раздельного культивирования различных видов клеток (HepG2, почечный эпителий, ММСК костного мозга, клетки печени) на матриксе Цитодекс-3 (1) и на фрагментах мелкодисперсного матрикса из ДЦП (2) в течение 5 сут . ;
* — различия статистически значимы при сравнении с результатами культивирования печеночных клеток на матриксе Цитодекс-3, р<0,05
На диаграмме видно, что частицы матрикса из ДЦП, так же, как и частицы Цитодекса-3, биосовместимы и адгезивны для различных видов клеток . Однако матрикс из ДЦП в отличие от Цитодекса-3 проявлял также свою тканевую принадлежность, которая становилась очевидной при культивировании на них гепатоспецифических клеток (НерОг и клеток аллогенной печени), жизнеспособность которых при адгезии на матриксе из ДЦП значительно выше, чем у ММСК костного мозга и клеток почечного эпителия . Мы полагаем, что полученные результаты нельзя объяснить только тем, что мелкодисперсный матрикс из ДЦП сохраняет основные типы молекул нативного внеклеточного матрикса, такие как фи-бриллообразующие белки — коллаген i и iii типов, эластин и гликопротеины — фибронектин, ламинин и др . [4], которые обеспечивают прочность и эла-
стичность тканей, но и тем, что мелкодисперсный матрикс из ДЦП сохраняет свою гепатоспецифиче-скую структуру, которая индуцирует динамическую взаимосвязь (тропизм) матрикса именно с клетками печени Кроме того, можно предположить, что имплантация в поврежденную печень матриксов из ДЦП с адгезированными на них клетками печени будет создавать условия для индукции синтеза и обновления привнесенными жизнеспособными ге-патоцитарными клетками гепатотропных матриксных белков [18], которые будут способствовать усилению клеточно-матриксного взаимодействия и интеграции имплантированных клеточно-матриксных ассоциатов тканью печени реципиента при трансплантации их в поврежденную печень
Заключение
Результаты проведённого нами исследования свидетельствуют о том, что мелкодисперсный ма-трикс из ДЦП, изготовленный по разработанной нами технологии, сохраняет гепатотропность и выраженную адгезивность для клеток, особенно клеток гепатоцитарного фенотипа. Эти результаты позволяют предположить, что мелкодисперсный матрикс из ДЦП может служить в качестве предпочтительной основы для изготовления имплантируемых и длительно функционирующих клеточно-инженерных конструкций вспомогательной печени, которые могут быть использованы при коррекции и лечении печёночной недостаточности
Благодарности
Данная работа проводилась при финансовой поддержке Минздрава России в рамках государственных заданий по темам «Разработка и экспериментальное исследование тканеспецифических ма-триксов для биомедицинских клеточных продуктов» (№ гос. регистрации 115102010014) и «Создание и экспериментальное исследование тканеинженерной конструкции печени с использованием аппаратного комплекса «биостанция-биореактор» (№ гос. регистрации 115102010016).
1 ■ 2
ЛИТЕРАТУРА:
1. Онищенко Н .А ., Гулай Ю . С ., Шагидулин М . Ю . и соавт . Разработка имплантируемых клеточно-инженерных конструкций вспомогательной печени для лечения печёночной недостаточности . Гены и клетки 2015; Х(1): 6-17 .
2 . Karina H . , Nakayama В . S ., Batchelder C . A . et al . Decellularized Rhesus Monkey Kidney as a Three-Dimensional Scaffold for Renal Tissue Engineering . Tissue Engineering 2010 Part A; 16: 2207-16 .
3 . Ott H . C ., Matthiesen T . S . , Goh S . K . et al . Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart . Nat . Med . 2008; 14(2): 213-21.
4 . Сотниченко А. С ., Губарева Е . В ., Гилевич И . В . и соавт . Де-целлюляризированный матрикс сердца крысы как основа создания тканеинженерного сердца . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; 8(3): 86-94 .
5 Petersen T H , Calle E A , Colehour M В et al Matrix composition and mechanics of decellularized lung scaffolds Cells Tissues Organs 2012; 195(3): 222-31.
6 . Baptista P . M ., Siddiqui M . M . , Lozier G . et al . The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid . Hepatology 2011; 53(2): 604-17 .
7 . Barakat O ., Abbasi S ., Rodriguez G . et al . Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ . J . Surg . Res . 2012; 173(1): 11-25 .
8 . Baptista P . M ., Vyas D . , Moran E . et al . Human liver bioengineering using a whole liver decellularized bioscaffold Methods Mol . Biol . 2013; 1001: 289-98 .
9 . Yagi H ., Fukumitsu K. , Fukuda K . et al . Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach . Cell Transplant . 2013; 22(2): 231-42 .
10 . Uygun B . E ., Soto-Gutierrez A ., Yagi H . et al . Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix . Nat . Med . 2010; 16(7): 814-20 .
11. Готье С . В ., Онищенко Н .А ., Крашенинников М . Е . и соавт . Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа . Патент РФ на изобр . №2539918 . 21 января 2015 .
12 . Li Y . S ., Haran H . J ., Hsieh D . K . et al . Cells and materials for liver tissue engineering . Cell transpl . 2013; 22(4): 685-700 .
13 . Шагидулин М . Ю . , Онищенко Н .А ., Крашенинников М . Е . и др Выживание клеток печени, иммобилизированных на 3-D матриксах, при моделировании печеночной недостаточности . Вестник трансплантологии и искусственных органов 2011; XIIK3): 59-66
14 . Qi W ., Johnson D .W ., Vesey D .A . et al . Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney Nephrology (Carlton) 2007; 12(2): 155-9 .
15 . Шумаков В . И ., Онищенко Н .А., редакторы . Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций Москва: Лавр; 2009
16 Mosmann T Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays J Immunol . Methods 1983; 65: 55-63 .
17 . Atala A., Yoo J .J . Decellularisation for whole organ bioengineering Biomed . Mater. 2013; 8(1): 104-6 .
18 . Воронкина И . В . Внеклеточный матрикс и его роль в регуляции клеточных функций В: Пинаев Г П , Богданова М С , редакторы Методы культивирования клеток СПб: Изд Политехнического университета; 2008 . с . 72-83 .
Поступила: 29.04.2015
