CC BY
15MEDICAL SCIENCES
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ТКАНЕВОЙ РЕАКЦИИ НА ПОДКОЖНУЮ ИМПЛАНТАЦИЮ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗИРОВАННЫХ СЕРДЕЦ И ДИАФРАГМ
Сотниченко А.С.,
Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, заведующий лабораторией Мелконян К.И.,
Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, заведующий лабораторией Веревкин А.А.
Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, Научный сотрудник
MORPHOLOGICAL ASSESSMENT OF TISSUE RESPONSE TO SUBCUTANEOUS IMPLANTATION OF DECELLULARIZED HEARTS AND DIAPHRAGMS
Sotnichenko A.,
Kuban State Medical University, Krasnodar, Head of laboratory Melkonyan K., Kuban State Medical University, Krasnodar, Head of laboratory Verevkin A. Kuban State Medical University, Krasnodar, Reseacher
АННОТАЦИЯ
На основании данных морфологического анализа произведена гистологическая оценка тканевой реакции крысы на подкожную имплантацию децеллюляризированных матриксов сердца. Изучен качественный клеточный состав воспалительного инфильтрата с оценкой динамики изменения количества макрофагов, Т- и В-лимфоцитов на 7 и 14 сутки после начала эксперимента. Показано, что реакция на имплантацию зависит не только от качества децеллюляризации и эффективности удаления молекул-антигенов, но и исходной гистологической структуры, а также качества предимплантационной подготовки образца.
ABSTRACT
Based on the morphological analysis, a histological evaluation of rat tissue response to subcutaneous implantation of the decellularized matrices of rat hearts was performed. The qualitative cellular composition of the inflammatory infiltrate was studied with an assessment of the dynamic changes in the macrophages, T- and B-lym-phocytes amount on days 7 and 14 after the beginning of the experiment. It is shown that the tissue response to implantation depends not only on the quality of decellularization and the efficiency of antigen molecules removal, but also on the initial histological architectonics and quality of preimplantation preparation of the sample.
Ключевые слова: децеллюляризация, биологические каркасы, тканевая инженерия, крысы.
Keywords: decellularization, biological scaffolds, tissue engineering, rats.
В настоящее время существенно возросло количество работ, посвященных децеллюляризации различных органов и тканей. Существует большое количество методик и способов получения децел-люляризированных матриксов, основанных как на физических, химических, так и на ферментативных воздействиях на интересующий орган. В результате в получаемой конструкции, как правило, не содержатся сохранные клетки и продукты их распада и в значительной степени сохраняется сложная геометрия органа, в том числе относительно нетронутая сосудистая сеть [1,2].
Методика получения децеллюляризирован-ного матрикса играет большую роль в последующей реакции тканей реципиента на имплантацию
тканеинженерной конструкции. Недаром исследователи продолжают тестировать все новые и новые протоколы децеллюляризации. Необходимо найти тонкую грань между необходимостью полного удаления молекул-антигенов и сохранением качественного состава белков внеклеточного матрикса (ВКМ) органа.
Одним из этапов изучения качества децеллю-ляризации органов является подкожная имплантация каркасов. Данная процедура помогает определить in vivo - насколько эффективно удалены кле-точно-ассоциированные белки, а также то, какой вклад они вносят в ответ тканей на имплантацию. Также можно уточнить местную реакцию тканей на применявшиеся в ходе децеллюляризиции агрессивные химические вещества, которые, возможно,
адгезировали к молекулам белков ВКМ [3,4].
Цель настоящей работы - сравнительное изучение биосовместимости, биодеградации, местной тканевой реакции на имплантацию децеллюляризи-рованных внеклеточных матриксов сердца крысы.
Методика исследования
Работа выполнена на 10 крысах - самцах линии Вистар весом 210±40 г на базе лаборатории фундаментальных исследований в области регенеративной медицины Кубанского государственного медицинского университета (Краснодар) при соблюдении надлежащих этических норм, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1972 г.) и «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986) после одобрения протокола исследования локальным этическим комитетом (протокол № 21/1). Процедура эксплантации органо-комплексов выполнялась после интраперитонеаль-ного введения летальной дозы барбитуратов (150 мг/кг).
Децеллюляризацию сердца и диафрагмы крысы выполняли по модифицированному протоколу детергент-энзиматическим методом с использованием дезоксихолата натрия и ДНКазы [5]. Нами предварительно были получены ацеллюляр-ные матриксы, не содержащие неповрежденных клеток и клеточных ядер, и состоящие из белков внеклеточного матрикса - коллагенов I и IV типов, ламинина, эластина, фибронектина. Из них были подготовлены импланты размером 0,5*1 см, которые перед оперативным вмешательством стерилизовали погружением в 10% раствор этанола на 15 минут с последующей трехкратной отмывкой стерильным фосфатным буферным раствором.
Животных, вовлеченных в основной эксперимент, наркотизировали растворами золетила (6 мг/кг, Zoletil 100, Италия) и ксилазина (0,5 мл/кг, Rometar, «Spofa», Прага). Под кожу в межлопаточной области были помещены образцы исследуемых каркасов. Крысы были разделены на 3 группы (имплантация децеллюляризированного матрикса легкого - 1 группа, имплантация децеллюляризиро-ванного матрикса диафрагмы - 2 группа, имплантация децеллюляризированного матрикса сердца - 3 группа) и выводились из эксперимента введением летальной дозы барбитуратов (150 мг/кг) на 7 и 14 сутки после начала эксперимента. Имплант вместе с окружающими тканями выделяли хирургически, полученные образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине, дегидратировали с последующим заключением в парафин при помощи гистопроцес-сора Leica TP1020 (Германия) по стандартной методике. Заливку в парафин выполняли на модульной установке EG1150H (Leica, Германия). Для общегистологической оценки препаратов при помощи ротационного микротома RM2235 (Leica, Германия) получали парафиновые срезы толщиной 4 мкм на высоко адгезивных стеклах с последующей депара-
финизацией, гидратацией, окрашиванием гематоксилином и эозином (Sigma-Aldrich, США). Далее производили качественную оценку состава клеточного инфильтрата вокруг имплантата при помощи иммуногистохимического анализа. Для этого срезы депарафинизировали и гидратировали, блокировали эндогенную пероксидазную активность 3% раствором пероксида водорода в течение 10 мин, демаскировали антигены в цитратном буферном растворе (ab 64236, Abcam, США) на водяной бане в течение 40 мин. Реакции проводили со следующими первичными антителами: anti-CD3 (ab16669, Abcam, США), anti-CD8 (ab33786, Abcam, США), anti-CD20 (ab85809, Abcam, США). Препараты дополнительно докрашивались гематоксилином Майера в течение 10 секунд. Нами была выбрана система детекции c использованием набора Rabbit specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC Kit (ab 64261, Abcam, США). Для морфологического обнаружения активированных провоспали-тельных макрофагов проводили иммуногистохими-ческую реакцию с антителами к Маннозному рецептору макрофагов (ab64693, Abcam, США). В данном случае мы использовали флуоресцентную систему детекции со вторичным антителом Goat polyclonal Secondary Antybody to Rabbit IgG-H&L (Alexa Fluor® 488, ab 150081, Abcam, США) в концентрации 1:500. Изучение микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus СХ 41 (Япония). Подсчет количества клеток, имевших положительную реакцию с антителами к исследуемым рецепторам, проводился на срезах в 4-5 полях зрения при увеличении х400 ручным методом.
Результаты и обсуждение
В группе по имплантации ацеллюлярного матрикса диафрагмы через 7 суток матрикс сохранял пористую структуру. Вокруг каркасов формировалась соединительнотканная капсула из грануляционной ткани, толщиной до 900 мкм, происходило врастание тяжей фибробластов внутрь импланта. Клеточная воспалительная реакция была значительно выражена, в инфильтрате присутствовали как мононуклеарные клетки (Т, В - лимфоциты, макрофаги), так и сег-ментоядерные лейкоциты, в том числе и эозино-фильные. В тканях, окружающих капсулу, была значительно выражена отечность, обнаруживали полнокровные сосуды, преимущественно вокруг области имплантации. На 14 сутки произошло заметное снижение отечности тканей, уплотнение и деградация ВКМ диафрагмы, резорбция его макрофагами и прорастание новообразованными сосудами с развитием в них явлений продуктивного капиллярита. Выраженность воспалительной клеточной реакции как внутри образца, так и в окружающих тканях заметно снизилась за счет уменьшения количества активированных макрофагов и Т-лимфоцитов. Содержание В-лимфоци-тов в инфильтрате так же как и в случае с имплантацией децеллюляризированных легких явных изменений не претерпело. (Рис 1).
Рисунок 1. Имплантация децеллюляризированного матрикса диафрагмы. А-Г- 7 суток после имплантации. Д-З - 14 суток после имплантации. А, Д- окрашивание гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD3 рецептору Т-лимфоцитов - Б, Е; СD 20рецептору В-лимфоцитов - В, Ж; маннозному рецептору макрофагов - Г,З. Увеличение: А,Дх100;
Г, З х 200, Б,В,Е,Ж ч 400.
Морфологический анализ образцов после имплантации децеллюляризированного матрикса сердца выявил развитие выраженной воспалительной реакции в месте операции. Имплант на 7 сутки был полностью окружен зоной демаркационного воспаления толщиной до 2 мм, состоящей из сег-ментоядерных лейкоцитов, В и Т-лимфоцитов, про-воспалительно активированных макрофагов. Пролиферации фибробластов и образования соединительнотканной капсулы вокруг импланта
обнаружено не было. К 14 суткам зона имплантации была также обильно васкуляризирована (обнаруживали до 5-6 сосудов в поле зрения при увеличении 400х) и окружена плотной капсулой из фиброзной ткани с небольшим количеством сосудов. На фоне незначительного снижения сохранения числа Т-лимфоцитов (на 38%) и активированных макрофагов (на 42%) инфильтрате внутри и вокруг импланта на треть возрастало количество В-лимфоцитов. (Рис 2).
Рисунок 2. Имплантация децеллюляризированного матрикса сердца. А-Г- 7 суток после имплантации. Д-З - 14 суток после имплантации. А, Д- окрашивание гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическая реакция с антителами к СБ3 рецептору Т-лимфоцитов - Б, Е; СБ 20рецептору В-лимфоцитов - В, Ж; маннозному рецептору макрофагов - Г,З. Увеличение: А,Дх100;
Г, З х 200, Б,В,Е,Ж ч 400.
Полученные результаты позволяют рассматривать методику подкожной имплантации децеллю-ляризированных матриксов как важный этап in vivo оценки реакции тканевого ответа организма-реципиента в ответ на имплантацию тканеинженерных конструкций.
Имплантация ВКМ мышечных органов, таких как диафрагма и сердце привела к выраженной мак-рофагальной резорбции матриксов и воспалительному ответу тканей. Также прослеживалась тенденция к увеличению содержания В-лимфоцитов, появлению эозинофилов в инфильтрате, при снижении количества макрофагов и Т-лимфоцитов. Мы связываем данные отличия с более плотной структурой и, как следствие, худшей отмывкой матрикса от детергентов и энзимов, а также благоприятными условиями для развития бактериальной контаминации. Таким образом, тканевая реакция на
имплантацию зависит не только от качества децел-люляризации и эффективности удаления молекул-антигенов, но и качества предимплантационной подготовки образца.
Работа выполнена при поддержке Государственного задания Министерства образования и науки РФ (проект № 6.5882.2017/БЧ)
Литература
1 Gilbert T. W., Sellaro T. L., Badylak S. F. De-cellularization of tissues and organs // Biomaterials. 2006. Т. 27. №. 19. С. 3675-3683.
2. He M., Callanan A. Comparison of methods for whole-organ decellularization in tissue engineering of bioartificial organs // Tissue Engineering Part B: Reviews. 2012. Т. 19. №. 3. С. 194-208.
3. Шехтер А. Б., Гуллер А.Е., Истранов Л.П., Истранова Е.В., Бутнару Д.В., Винаров А.З., Захар-кина О.Л., Курков А.В., Кантимеров Д.Ф.,. Антонов Е.Н., Марисов Л.В., Глыбочко П.В. Морфология коллагеновых матриксов для тканевой инженерии (биосовместимость, биодеградация, тканевая реакция) // Архив патологии. 2015. Т. 77. №. 6. С. 29-38.
4. Keane T. J. Londono R., Turner N.J. Badylak S.F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response // Biomaterials. 2012. T. 33. №. 6. C. 1771-1781.
5. Gilbert T. W. Strategies for tissue and organ decellularization //Journal of cellular biochemistry. 2012. T. 113. №. 7. C. 2217-2222
ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ОБОСТРЕНИЙ ХРОНИЧЕСКОГО АПИКАЛЬНОГО ПЕРИОДОНТИТА
У ВОЕННОСЛУЖАЩИХ
Гулюк А.Г.
проф. Одесский Национальный медицинский университет
Шмидт П.А.
Украинская военно-медицинская академия
EXCERATIONS OF CHRONIC APICAL PERIODONTITISP ROGNOSIS AMONG MILITARY
PERSONNEL
Guliuk A.,
prof., MD
Department of Surgical Dentistry, Odessa National Medical University, Odessa
Schmidt P.
Ukrainian Military Medical Academy, Kyiv
АННОТАЦИЯ
Актуальной проблемой стоматологии является диагностика заболеваний тканей пародонта, что может явиться причиной не своевременного проведения леченияпреждевременной потери зубов, вторичной адентии, приводят к нарушению речи, жевательной функции и, кроме того, несут риск развития патологических процессов не только в тканей и органов ротовой полости, а также общие соматические нарушения из-за наличия одонтогенных очагов инфекции.
Состояние хронического пародонтита среди военнослужащих Вооруженных Сил Украины остается крайне актуальным. В данной статье диагноз был рассмотрен в связи с использованием иммунологических исследований периферической крови больных военнослужащих ВС Украины с хроническим периодонтитом, а также его осложнениями. Проведено изучение особенностей иммунологических показателей периферической крови.
ABSTRACT
One of the urgent problems of dentistry is the diagnosis of periodontal tissue diseases, that may be the cause of untimely treatment, which will lead to premature loss of teeth, secondary adentia, impaired speech, chewing function and, in addition, it involves the risk of developing pathological processes not only in the tissues and organs of the oral cavity, but also general somatic disorders due to the presence of odontogenic foci of infection.
The state of chronic periodontitis among the military personnel of the Armed Forces of Ukraine remains extremely topical. This article discusses the issues of the development of non-invasive methods for predicting exacerbations of chronic apical periodontitis among conscripts of the Ministry of Defense of Ukraine.
Ключевые слова: периодонтит, периостит, прогнозирование хронического периодонтита.
Keywords: periodontitis, periostitis, predicting chronic periodontitis.
Постановка проблемы: Заболевания перио-донта поражают около 20,0-50,0 % населения планеты [1]. По локализации чаще всего встречается апикальный периодонтит (15,0-20,0 % всех случаев обращения пациентов к стоматологу по поводу патологии периодонта), а его хроническая форма занимает лидирующую позицию и составляет от 58,2 до 87,9 % [2].
Анализ последних исследований: Среди военнослужащих в возрасте 18-30 лет хроническим периодонтитом страдают 66,4% [3]. С данной патологией связаны такие факторы риска, как курение, плохая гигиена полости рта, возраст, наследственность и стресс. Результаты обследования подтверждают негативное влияние последствий военно-
профессиональных факторов на стрессовый иммунодефицит [4]. При этом, снижение клеточной реактивности, впрочем, как и повышение, определяет атипичное и затяжное течение заболевания [5]. Эти расстройства обычно хронические; иными словами, они развиваются в течение длительного периода времени, и пациент остается в неведении об их присутствии, потому что у них нет серьезных симптомов. Следует помнить, однако, что, если периодонтит может развиваться без помех, пациент не только потеряет зубы, но также может испытать системные эффекты [6].
В последние годы в медицине актуальным направлением является изучение возможности использования альтернативных биологических жидкостей с целью ранней диагностики заболеваний.
