CC BY
23
КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
З. М. Жанкалова
ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ У БОЛЬНЫХ С АЛКОГОЛЬНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ПЕЧЕНИ
Кафедра интернатуры по терапии Казахского Национального медицинского университета им. С. Д. Асфендиярова (Алматы)
В настоящее время большое внимание уделяется исследованиям регуляторной функции эритроцитарных мембран, отражающей возникновение и развитие патологических изменений во внутренних органах [9]. Эритроциты находятся в среде с более высокой концентрацией кислорода, чем большинство клеток, и потенциально более подвержены повреждающему действию окислителей, чем другие клетки. Потребление кислорода эритроцитами очень низкое и связано преимущественно с окислением гемоглобина в метгемоглобин. Аутоокисление гемоглобина в метгемоглобин приводит к образованию супероксидного иона (О2-) [5]. Показано, что действие свободных радикалов кислорода стимулирует гемолиз [11, 12]. Спектры спин-меченых эритроцитов выявили, что жидкостность мембран не изменяется в течение гемолиза, вызванного свободными радикалами [1].
Повышение осмотической резистентности эритроцитов, возрастание вязкости их мембран, коррелирующие с тяжестью патологического процесса, отмечаются при заболеваниях печени [1, 7]. Это может быть следствием разнообразных нарушений метаболизма клетки, в основе которых лежит широкий спектр биохимических процессов.
На основе физико-химических и биологических исследований патологических состояний биологических мембран разрабатываются способы лечения и профилактики заболеваний, создаются высокоэффективные лекарственные препараты.
Прямое токсическое действие этанола и продуктов его метаболизма ведет к повреждению мембран печеночных клеток, нарушению ультраструктуры митохондрий, снижению обеспечения кислородом и производства энергии, необходимой для нормальной жизнедеятельности клетки. Проявлением алкогольной болезни печени является стеатоз, гепатит и цирроз печени.
Цель исследования - изучение некоторых показателей перекисного окисления липидов у больных с алкогольной болезнью печени.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследованы 40 больных (32 мужчины и 8 женщин) с алкогольной болезнью печени в возрасте от 38 до 68 лет. Средний возраст составил 52±5,24 г. Алкогольную болезнь печени диагностировали по общепринятым критериям: клиническим, анамнестическим (в том числе опросник CAGE, определению биохимических, эндоскопи-
ческих, УЗИ методов исследования. Стаж употребления алкоголя составил в основной группе больных от 2 до 17 лет. Злоупотреблением алкоголя считался прием более 60 мл/сут этанола для мужчин и более 40 мл/сут для женщин. Обследованные не имели алкогольной зависимости и поведенческих проявлений злоупотребления алкоголем. Контрольную группу составили 25 мужчин и 5 женщин того же возраста с заболеваниями печени, но не употребляющие алкоголь.
Методика ыделения эритроцитов заключалась в следующем: кровь центрифугировали 10 мин при 1000 д. Плазму и лейкоциты удаляли, а эритроциты дважды промывали средой инкубации (СИ), содержащей 150 мМ NaCl, 5мМ Nа2НРО4 (рН-7,4). Полученную суспензию эритроцитов использовали для проведения исследований.
Осмотическую резистентность эритроцитов определяли по степени гемолиза эритроцитов в гипотонических растворах NaCl (0,35-0,9 г/100 мл). Оптическую плотность регистрировали при длине волны 540 нм. Уровень гемолиза клеток рассчитывали в процентах по отношению к 100% гемолизу, вызванному раствором Na2COз в концентрации 0,1г/100 мл.
Проницаемость эритроцитарных мембран (ПЭМ) определяли по методу [2]. Принцип метода определения ПЭМ - гемолиз в смесях изотонических растворов мочевины и хлористого натрия, обусловленный способностью мочевины быстро диффундировать через клеточную мембрану и, создавая гиперосмолярную концентрацию внутри эритроцита, вызывать его набухание с последующим гемолизом.
Суспензию эритроцитов добавляли в среду, содержащую растворы мочевины (18 г/л) и №С1 (0,9 г/100 мл) в различном соотношении (65:35; 60:40; 55:45; 50:50; 45:55; 40:60). 100% гемолиз вызывали, помещая суспензию эритроцитов в раствор Na2CO3 в концентрации 0,1г/100 мл. После 3-минутной инкубации пробы центрифугировали при 1000 д 10 мин и определяли оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 540 нм. Уровень гемолиза клеток рассчитывали в процентах по отношению к 100% гемолизу, вызванному раствором Na2CO3.
Интенсивность перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ) с использованием 1М раствора Н2О2 определяли по методу А. А. Покровского, А. А. Абраровой [6] в модификации [3]. Для получения полного гемолиза использовали раствор додецилсульфата натрия в концентрации 8 г/100мл. Все пробы инкубировали в течение 2 ч при 37°С, затем центрифугировали при 1000 д 10 мин. Оптическую плотность супернатанта измеряли при длине волны 540 нм.
Активность каталазы эритроцитов определяли по методу [4, 8]. Реакция запускается добавлением к гемолизату эритроцитов 1 мм раствора перекиси водорода. Реакцию останавливали через 10 мин добавлением 1мл 4% раствора молибдата аммония. Оптическую плотность рас-
твора регистрировали при длине волны 410 нм. Активность каталазы рассчитывали в процентах по количеству разрушенной перекиси водорода
Результаты статистически обрабатывали с использованием программы Microsoft Excel, рассчитывая среднюю арифметическую параметра, среднее квадратическое отклонение, ошибку средней арифметической. С учетом критерия Фишера - Стьюдента зарегистрированные изменения показателей считали достоверными при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследована осмотическая резистентность мембран эритроцитов контрольной группы с группой больных до и после лечения (рис. 1). До лечения с уменьшением концентрации NaCl наблюдалось повышение уровня гемолиза эритроцитов. Этот же показатель после лечения был значительно ниже, хотя и остался выше значений контрольной группы. И только при концентрации растворов NaCl, близких к 0,5 г/100 мл или равных физиологическому раствору (0,9 г/100), различий гемолиза между эритроцитами контрольной группы и двух исследуемых групп практически не отмечалось.
0,35 0,4 0,45
- Контроль —И— До лечения
0,5 0,9
— После лечении
По оси абсцисс - концентрация №0 (г/100 мл);
по оси ординат - величина гемолиза (%) Рис. 1. Изменение осмотический резистентности мембран эритроцитов
Определена проницаемость эритроци-тарных мембран исследуемых и контрольной
групп (рис. 2).
%
100 т
80 -60 -40 -20 -
45/55 □ Контроль
40/60 ■ До лечения
35/65 □ После лечении
По оси абсцисс - концентрации №С1/мочевина (%);
По оси ординат - величина гемолиза (%) Рис. 2. Изменение проницаемости эритроцитарных мембран в контрольной группе и в группах до и после лечения
С увеличением концентрации мочевины и уменьшением концентрации №С! повышается проницаемость мембран эритроцитов как контрольной, так и исследуемых групп. При этом уровень гемолиза эритроцитов больных до лечения значительно выше при всех исследованных концентрациях мочевины, после лечения наблюдается снижение проницаемости мембран и уменьшение выхода гемоглобина из эритроцитов.
При высоких концентрациях мочевины гемолиз в смесях изотонических растворов мочевины и №С1 обусловлен способностью мочевины проникать через клеточную мембрану и создавать внутри эритроцитов гиперосмолярную среду, что в свою очередь приводит к набуханию эритроцитов, нарушению целостности клеточной мембраны и выходу гемоглобина из эритроцитов. Следовательно, повышение содержания мочевины в среде инкубации увеличивает степень гемолиза эритроцитов. Сравнение гемолиза эритроцитов до и после лечения показало, что уровень гемолиза эритроцитов выше до лечения, следовательно - выше проницаемость мембран. Таким образом, можно заключить, что после лечения больных алкогольной болезнью печени повышается резистентность мембран эритроцитов и снижается проницаемость эритроцитарных мембран.
Определение устойчивости эритроцитов к действию перекиси водорода выявило, что с возрастанием концентрации перекиси водорода увеличивается гемолиз эритроцитов (рис. 3). Эритроциты контрольной и группы больных после лечения более устойчивы к гемолизу по сравнению с эритроцитами группы больных до лечения. %
80
□ Контроль
] До лечения □ После лечении
По оси абсцисс - концентрации Н2О2 (мМ); по оси ординат - величина гемолиза (%) Рис. 3. Изменение перекисного гемолиза эритроцитарных мембран в контрольной группе и в группе до и после лечения
Перекись водорода относится к активным формам кислорода, в организме Н2О2 разрушается каталазой. Каталаза широко распространена в организме человека, причем наибольшее количество фермента обнаружено в эритроцитах, печени и почках [1]. Функцией фермента является предотвращение накопления перекиси водорода, оказывающей повреждающее действие на клеточные компоненты (рис. 4).
Активность каталазы оценивали по количеству разрушенной перекиси водорода в раство-
0
0
□ Контроль ЕИ До лечения □ После лечении
По оси ординат - активность каталазы (%) Рис. 4. Изменение активности каталазы эритроцитов в контрольной группе и в группе до и после лечения
ре и выражали в процентах. Активность каталазы эритроцитов у больных до лечения составляла 28,73±0,36%, в контрольной группе -70,31±0,42% (р<0,01). После лечения активность каталазы эритроцитов повысилась до (67,17±0,32%; р<0,01).
Таким образом, после лечения у больных алкогольной болезнью печени повышается резистентность мембран эритроцитов и снижается проницаемость эритроцитарных мембран. Определение устойчивости эритроцитов к действию перекиси водорода выявило, что эритроциты контрольной и группы больных после лечения более устойчивы к гемолизу по сравнению с эритроцитами группы больных до лечения.
Так как каталаза является одним из ключевых ферментов антиоксидантной защиты организма, результаты позволяют предположить, что снижение активности фермента при алкогольной болезни печени является следствием интенсификации перекисного окисления мембранных липи-дов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блюгер А. Ф. Значение изменения мембран эритроцитов в патогенезе вирусного гепатита /А. Ф. Блюгер, З. З. Крупников //Изв. АН Латв. ССР. -1985. - №6, - С. 85-89.
2. Колмаков В. Н. Значение определения проницаемости эритроцитарных мембран (ПЭМ) в диагностике хронических заболеваний печени /В. Н. Колмаков, В. Г. Радченко //Терапевт. арх. -
1982. - T.54, №2. - С. 59 - 62.
3. Корригирующее влияние индоламинов на состояние мембран эритроцитов при действии ионов кадмия /Т. Н. Мирошина, М. К. Мурзахме-това, Р. С. Утегалиева и др. //Вестн. КазНУ им. Аль-Фараби. Серия биолоия. - 2002. - №3. - С. 80 - 86.
4. Метод определения активности каталазы / М. А. Королюк, Л. И. Иванова, И. Г. Майорова, В. Е. Токарев //Лаб. дело. - 1988. - №1. - С. 16 -18.
5. Основы биохимии Уайт А. , Хендлер Ф. , Смит Э. и др. - М.: Мир, 1981. - 726 с.
6. Покровский А. А. К вопросу o перекисной резистентности эритроцитов /А. А. Покровский, Абрарова А. А. //Вопр. питания. - 1964. - №16. -С. 44 - 49.
7. Сафин И. А. Определение активности и степени некробиотических процессов при хронических гепатитах и циррозах печени /И. А. Са-фин, Р. С. Мингазов //Физико-химические исследования в медицине. - Уфа, 1985. - С. 39 - 40.
8. Чевари С. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте /С. Чевари, Т. Андял, Я. Штренгер //Лаб. дело. - 1991, №10. - С. 9 - 13.
9. Электроповерхностные свойства эритроцитов при заболеваниях гепатобилиарной системы /И. А. Сафин, Р. С. Мингазов, Р. М. Баширова, Э. И. Магдеев //«Физиология и биохимия клетки при действии экстремальных факторов»: Межвуз. сб.Алма-Ата, 1988, - С. 21 - 30.
10. Young S. Antioxidants in health and disease / S. Young, J. V. Woodside //J. Clin Pathol. - 2001. -V. 54, №3. - P. 176 - 186.
11. Free radical chain oxidation and hemolysis of erythrocytes by molecular oxygen and their inhibition by vitamin E /Y. Yamamoto, E. Niki, Y. Kamiya et al. // J. Nutr. Sci Vitaminol. - 1986. - V. 32, №5. - Р. 475 - 479.
12. Mechanism of free radical-induced hemolysis of human erythrocytes. II. Hemolysis by lipid-soluble radical initiator /Y. Sato, S. Kanazawa, K. Sato, Y. Suzuki //Biol. Pharm. Bull. - 1998. - V. 21, №3. - Р. 250 - 256.
Поступила 02.05.08.
Z. M. Zhankalova
INDICES OF LIPID PEROXIDАTION IN PATIENTS WITH ALCOHOL DISEASES OF LIVER
In this article author described some significant peroxide of lipids which changed in patients with alcohol disease of liver. Author notes the dynamics of changes following the therapy.
З. М. Жаццалова
АЛКОГОЛЬ БАУЫР АУРУЫ БАР НАУКАСТАРДАРЫ МАЙЛАРДЫЦ СУТЕКТ1К ТОТЫРУЫНЬЩ К6РСЕТК1ШТЕР1
Алкогольдк бауыр ауру наукастарындары майлардьщ сутектк тотыруыныч ^6ip eзгермелi керсет-кiштерi сипатталран, жYргiзiлген емнщ нэтижесшде олардыч eзгеруi байкалды.
