CC BY
110РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА К ДЕЙСТВИЮ СОЛЯНОЙ КИСЛОТЫ И ГИПОХЛОРИТА НАТРИЯ ПОСЛЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО стресса in VITRO
HUMAN ERYTHROCYTE RESISTANCE TO HYDROCHLORIC ACID AND HYPOCHLORITE ACTION AFTER OXIDATIVE STRESS IN VITRO
А. А. Мищенко, К. В Засухина., С. В. Витязева
A. A. Mischenko, K. V. Zasuchina, S. V. Vityazeva
Перекисное окисление липидов клеточных мембран является одним из факторов старения, появления патологий на уровне организма, изменения физиологии клеток. В работе исследовано влияние перекисного окисления, индуцируемого 24-часовой инкубацией эритроцитов с перекисью водорода в присутствии и отсутствии витамина С, на ряд характеристик мембраны: гемолитическую устойчивость к соляной кислоте, окислителю гипохлориту и скорость работы анионного обменника. Полученные данные показывают ускорение скорости окислительного гемолиза опосредованного анионным транспортом переноса Н+ после инкубации эритроцитов с перекисью. Данные демонстрируют неоднозначность ответа клеток на витамин С в присутствии перекиси водорода.
Lipid peroxidation in cellular membranes leads to the ageing, pathologies of an organism appearance and cell physiology changes. We investigated in this paper the peroxidation influence induced 24 -hour incubation of erythrocytes with hydrogen peroxide at presence and absence of vitamin C. The some membrane characteristics was investigated: hemolytic action of hydrochloric acid and an oxidizer hypochlorite and anion exchanger speed. obtained data shows the acceleration of hemolytic oxidizing speed and anion exchanger mediated H+ — transport after red blood cells incubation with peroxide. The results showed the ambiguity of the cells answers on vitamin C and hydrogen peroxide.
Ключевые слова: эритроцит, перекисное окисление, гемолиз, транспорт Н+.
Keywords: erythrocyte, peroxidation, hemolysis, H+-transport.
введение
Перекисное окисление липидов в клетках является естественным процессом, который может быть вызван как внешними, так и внутренними факторами. Протекающие по свободно-радикальному механизму реакции перекисного окисления вызывают в первую очередь повреждение остатков жирных кислот липидов мембраны, содержащих двойные связи: от СН2-группы отнимается электрон, липид превращается в свободный радикал [5]. итогом реакций может быть появление в мембране клетки гидрофильных зон, увеличение проницаемости мембраны и набухание/
разрушение клеток и органелл. С перекисным окислением липидов связывают такие заболевания, как дистрофия мышц, болезнь паркинсона, атеросклероз, развитие опухолей. при активации перекисного окисления в мембране эритроцита происходит снижение светорассеивания суспензии этих клеток и изменение их формы [4].
в экспериментах перекисное окисление липидов можно инициировать добавлением к суспензии клеток перекиси водорода. Данное вещество постоянно образуется и в самом организме, например при активации гранулоцитов, участвуя при этом в уничтожении патогенной микрофлоры [13]. формирование перекиси может происходить также под влиянием лекарственных препаратов [14].
Для оценки состояния мембраны эритроцитов можно использовать тест на устойчивость клеток к действию гемолитиков (гемолиз) и оценку ион-транспорти-рующих систем мембраны. классическим вариантом гемолиза можно назвать кислотный, при котором возникают повреждения мембраны, запускается сферуляция и последующее разрушение эритроцитов [1]. Чувствительным методом, отражающим структурные и химические изменения эритроцитов, является окислительный гемолиз под влиянием гипохлорита натрия (ГхН). последний способ позволяет оценить, в частности, устойчивость эритроцитов к окислительному стрессу [4].
при исследованиях ион-транспортирующих систем получены данные [7] по изменению функционального состояния Са-зависимых калиевых каналов при действии активных форм кислорода и свободных радикалов на эритроцит. вместе с тем основным типом ионного транспорта этой клетки является анионный обмен, опосредующий формирование трансмембранной разности потенциалов, перенос углекислого газа кровью, транспорт протонов и гидроксил-ионов [12], в связи с чем этот транспорт был выбран объектом наших исследований.
Оптимальное функционирование эритроцитов возможно лишь при поддержании содержащегося в них гемоглобина в нативном состоянии. Одним из важных факторов защиты гемоглобина от окисления является восстановление мет-гемоглобина в гемоглобин в присутствии аскорбиновой кислоты [3]. показано также, что при хранении эритроцитарной взвеси витамин С снижает количество образующихся в результате перекисного окисления карбонильных, сульфги-дрильных групп белков и тиобарбитурат-реактивных субстанций липидов [18]. С другой стороны витамин С может вступать в реакцию с кислородом, вызывая в таком случае формирование Афк [10]. при таком двойственном действии неясно, какой эффект окажет вещество на функции анионообменника и гемолитическую устойчивость эритроцитов при окислительном стрессе.
целью данной работы было исследование активности анионного транспорта и устойчивости эритроцитов к действию кислоты и гипохлорита после 24-часовой инкубации с перекисью водорода в присутствии и отсутствии аскорбиновой кислоты.
Объекты и методы исследований
Объектом исследований являлась донорская кровь независимо от пола и группы, полученная на республиканской станции переливания крови. каждая проба крови делилась на 3 инкубируемые в присутствии антибактериальных и антимикотических препаратов части:
1. Контроль.
2. К пробе добавляли 100 мкМ перекиси Н2О2.
3. к пробе добавляли 100 мкм перекиси и 100 мкм аскорбиновой кислоты.
приготовленные варианты крови инкубировались в течение 24 часов при тер-
мостатировании (температура 37 °С), дальнейшие манипуляции — анализ эритроцитов на кислотную, окислительную устойчивость и измерение активности анионного транспорта — осуществлялись при комнатной температуре 20—23 °С.
кислотный гемолиз проводили по методу терскова и Гительзона [6] на фотоколориметре кфк-2. Окислительный гемолиз проводили по методу [4] в забуфе-ренном трис-HCl до рН 7.4 изотоническом растворе NaCl. полученные данные откладывались в виде зависимости оптической плотности суспензии от времени гемолиза.
измерения скорости анионного обмена вели по методу [11] в растворе 300 мм сахарозы. к 15 мл раствора добавляли 500 мкл плотного осадка отмытых трижды 0.9 % раствором NaCl, pH 7.4, эритроцитов. критерием скорости анионного обмена была скорость изменения рН такой суспензии, оцениваемая ионометрическим преобразователем и-500.
результаты обрабатывали методом парных сравнений, достоверность различий оценивали по критерию вилкоксона.
Результаты исследований
Гемолиз эритроцитов соляной кислотой. Средние значения изменений оптической плотности в ходе кислотного лизиса эритроцитов представлены на рис. 1.
Для контроля характерны следующие показатели кислотного гемолиза (n = 10): время начала — 126 с, скорость гемолиза на интервале 120—300 с — 0.37% клеток/с, время окончания гемолиза — около 420 с. полученные данные соответствуют литературным (трикуленко и др., 1996).
рис. 1. кислотный гемолиз эритроцитов человека Ось абсцисс — время, с; ось ординат — оптическая плотность суспензии эритроцитов
24-часовая инкубация с перекисью не сказывается на параметрах кислотного гемолиза: время начала составило 118 с, средняя скорость — 0.39 % за 1 с, время окончания — 404 с. также не повлияла на гемолиз предварительная инкубация эритроцитов с перекисью и аскорбиновой кислотой (n = 10, p > 0.05).
рис. 2. Окислительный гемолиз эритроцитов гипохлоритом
Ось абсцисс — время, с; ось ординат — оптическая плотность эритроцитарной суспензии
Гемолиз эритроцитов гипохлоритом натрия. иные результаты получены при гемолизе эритроцитов гипохлоритом (рис. 2).
в контроле время начала гемолиза составило 98 с (n = 10). в экспериментах с действием перекиси водорода в присутствии и отсутствии аскорбата данный показатель не изменился (n = 10, p > 0.05).
время окончания гемолиза составило в контроле 592 с. после 24-часовой инкубации со 100 мкм Н2О2 обнаружено достоверное уменьшение данного показателя на 8 % (p < 0.05). в экспериментах с совместным действием Н2О2 и аскорбата показатель уменьшился на 7 % (p < 0.05). разницы в действии перекиси в сравнении с действием перекись+аскорбат не выявлено (p > 0.05).
Скорость окислительного гемолиза после 24-часовой инкубации с перекисью водорода достоверно снижалась в среднем на 23 % (n = 10, p < 0.05). в экспериментах с совместным действием перекиси и аскорбиновой кислоты также обнаружено достовер -ное уменьшение скорости окислительного гемолиза, но на меньшую величину — 11 % (p < 0.05). различия между экспериментами в присутствии перекиси и данными при действии перекись+аскорбат достоверны (p < 0.05).
Транспорт Н+ через мембрану эритроцита. На рис. 3 представлены графики изменений рН суспензии Cl-— содержащих эритроцитов в изотоническом растворе сахарозы в одной из серий экспериментов.
Существует общая закономерность таких изменений рН: после смешивания с эритроцитами величина рН в течение 60—80 с снижается (первая фаза), затем начи-
Рис. 3. Изменения рН после смешивания С1--содержащих эритроцитов с изотоническим раствором сахарозы
Протокол эксперимента № 1. Ось абсцисс — время, с; ось ординат — величина рН суспензии
нает медленно повышаться (вторая фаза). такие изменения согласуются с результатами [11], полученными при инкубации эритроцитов в изотоническом растворе Na2SO4. В ходе эксперимента нагруженные С1- эритроциты помещаются в среду без С1-, что приводит к выходу этих ионов из клеток, сдвигу мембранного потенциала и понижению рН. Таким образом, изменения рН в первой фазе связано в основном с движением хлорида по градиенту электрохимического потенциала во внеклеточную среду.
По полученным данным рассчитаны величины изменений рН за 40 с инкубации. На рис. 4 представлены данные в виде абсолютной разности между опытными и контрольными значениями.
рис. 4. разность между величинами изменения рН за 40 с между пробами По оси абсцисс — номер эксперимента; по оси ординат — абсолютная величина разности, ед. рН
В контроле среднее изменение рН в течение 40 с составило 0.53 ед. рН. Инкубация эритроцитов с перекисью вызвала повышение скорости переноса Н+ из эритроцита до 0.65 ед. рН в среднем (p < 0.05). Средняя скорость транспорта Н+ изменяется на 40 %, с 6.12-10-3 мкМ/лх до 8.54-10-3 мкМ/лх. В присутствии аскорбата в 7-ми экспериментах из 10-ти получено повышение скорости переноса Н, в 3-х — снижение. Соответственно, при сравнении между экспериментами с перекисью и экспериментами перкись+аскорбат в 4-х экспериментах показано повышение показателя, в 6-ти — снижение.
Обсуждение результатов
В ходе проделанной работы проведено исследование влияния индуцированного перекисного окисления липидов в присутствии и отсутствии аскорбата на некоторые показатели состояния мембраны эритроцитов человека.
Первичной реакцией при действии перекиси является реакция образования радикала ОН*: О2*+Н2О2-О2+Н2О+ОН*. Процесс протекает с участием супероксид-
генерирующих систем и сопровождается появлением чрезвычайно активного радикала ОН* [9].
Исследования Na/H-обмена и активности Na, К-АТФазы при стимуляции перекисного окисления липидов бутилгидропероксидом [17] показали разную направленность сдвигов в скоростях работы этих транспортеров: если активность Na/H-обмена повышалась, то скорость работы №,К-АТФазы снижалась. В исследованиях [7] при стимуляции перекисного окисления активируются К(Са) — каналы. Такие изменения транспорта связывают с изменением жидкостных свойств мембраны, в особенности липидов, непосредственно контактирующих с транспортерами. В наших экспериментах проведены измерения скорость анионного транспорта через белок полосы 3 и показано ускорение переноса Н+ под влиянием 24-часовой Н2О2-инкубации. В присутствии витамина С получены различные варианты ответа на перекись: примерно в половине проб показано повышение, в других — понижение скорости переноса Н+. Мы связываем такую неоднозначность ответа с активностью аскорбиновой кислоты как анти- так и прооксиданта одновременно.
В роли антиоксиданта вещество, окисляясь, превращается в радикал аскорбата, содержащий неспаренный электрон в та-системе, следовательно, малоактивный по сравнению с другими радикалами [16]. В роли прооксиданта аскорбат редуцирует Fe3+ и Cu3+ до Fe2+ и Cu2+, что, в свою очередь способствует реакции Fe2++^02 ---Ре3++ОН_+НО* [8]. Возможно, присутствие аскорбата в наших экспериментах приводит к функционированию системы эритроцит — среда в триггерном режиме, в результате чего ответ на один стимул может быть реализован принципиально разными путями.
Согласно данным [15], перекись водорода, добавленная к эритроцитам, быстро разрушается ферментом каталазой. Данная реакция имеет важное значение для поддержания нативного состояния гемоглобина эритроцитов. Однако способность антиоксидантной системы к нейтрализации эндогенных активных форм кислорода не безграничны. Это проявляется в снижении деформируемости мембраны по-
сле действия окислителей на эритроцит. В наших экспериментах действие перекиси в течение 24-часовой инкубации с эритроцитами проявляется в виде снижения резистентности эритроцитов к последующему окислительному гемолизу гипохлоритом. при этом аскорбиновая кислота уменьшает степень Н2О2-индуцированных сдвигов параметров гемолиза, что указывает на ее защитное действие при окислительном стрессе.
в то же время кислотный гемолиз, в отличие от окислительного, оказался малочувствительным инструментом оценки состояния эритроцитарной мембраны при окислительном индуцированном перекисью стрессе, так как параметры этого гемолиза практически не изменились после 24-часовой инкубации перекиси с эритроцитами. Одним из ключевых событий при кислотном гемолизе считается агрегация мембранных белков [2]. исходя из этого можно сделать заключение об отсутствии влияния перекиси на потенциальную способность мембранных белков к НСЕиндуцируемой агрегации.
* * *
1. Артюхов в. Г., Наквасина м. А., резван С. Г. и др. практикум по биофизике. воронеж: вгу, 2001. 224 c.
2. иванов и. т., Бенов л. и. агрегация денатурированных мембранных белков — начальный этап кислотного гемолиза // Биофизика. 1991. № 5. С. 839—844.
3. казюлин а. Н. аскорбиновая кислота // фармацевтичекий вестник. 2002. № 12. C. 17—19.
4. мухамадияров R А. Сравнительное исследование влияния липосом с различными антиоксидантами на степень гемолиза и форму эритроцита при гипохлори-тиндуцированном перекисном гемолизе // вестник тгпУ. 2012. № 8. С. 179—186.
5. Северин Е. С. Биохимия: учебник для вузов. м.: ГЭОтАр-медиа, 2004. 779 с.
6. трикуленко А. в., пинишко У. в., панкевич Г. л. кинетика кислотного лизиса эритроцитов в присутствии лигандов некоторых интегральных белков плазматической мембраны // Биофизика. 1996. № 6. С. 1275—1277.
7. трубачева О. А., петрова и. в. влияние перекиси водорода на Са-зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов человека в условиях сжатия клеток // фундаментальные исследования. 2013. № 3. С. 382—385.
8. Buettner G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocophedrol, and ascorbate // Arch. biochem. Biophys. 1993. № 300. R 535—543.
9. Buettner G. г., Jurkiewicz B. a. Catalytic metals, ascorbate and free radicals: combination to avoid // radiat. res. 1996. №. 145. R 532—541.
10. Espey G. M. Ascorbate in pharmakologc concentrations selectively generates ascorbate radical and hydrogen peroxide in extracellular fluid in vivo // Biochemistry. 2007. №. 104. p. 8749—8754.
11. Jennings M. L. proton fluxes associated with erythrocyte membrane anion exchange // J. membr. Biol. 1976. v. 28. R 187—205.
12. Jennings M. L. Evidence for a second binding transport site for chloride in erythrocyte anion transporter AE modified at glutamate // J. Biophys. 2005. v. 68. R 2681—2691.
13. mcCarty M. F., Contreras F. Increasing superoxide production and the labile iron in tumor cells may sensitize them to extracellular ascorbate // front. Oncol. 2014. № 4. R 118—123.
14. McDonagh E. M. Pathway oxidative stress regulatory pathway // Pharmacogenetics and genomics. 2013. № 15. p. 52—54.
15. mohandy J. G., Nagababu E., Joseph M. R. Red blood cell oxidative stress impairs oxygen delivery and induces red blood cell afing // Front. physiol. 2013. № 5. R69—74.
16. Niki E. vitamin C as an antioxidant // World rev. Nutr. 1991. № 64. R 1—30.
17. Sing p., rizvi S. I. modulation effect of curcumin on erythrocyte ion-transporter activity // intern. J. of cell biology. 2015. 8 p.
18. vani г., Soumya г., Carl H. et al. prospects of vitamin C as an additive in plasma of stored blood // Adv. in hematology. 2015. № 18/3. R 1—7.
