CC BY
82
УДК 612.017.1;617.7-001.5
ПОИСК НАДЕЖНЫХ И ИНФОРМАТИВНЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОМ УВЕИТЕ
© Дикинов З.Х.
Медицинский факультет Кабардино-Балкарского государственного университета им. Х.М. Бербекова, Нальчик
E-mail: za2008@mail.ru
Проникающие травмы глаза часто осложняются развитием увеита, который является одной из основных причин потери зрения. Актуальной задачей является поиск лабораторных маркеров, которые отражают выраженность воспалительного процесса в сосудистом тракте. Изучены частота выявления и динамика концентрации фактора некроза опухоли (ФНО), интерлейкина-1р (ИЛ-ip) и неоптерина в слезной жидкости 93 пациентов с острыми посттравматиче-скими увеитами различной локализации. Установлено, что неоптерин является наиболее надежным и информативным маркером внутриглазного воспаления. Несмотря на то, что средние уровни ФНО и ИЛ-ip коррелируют с выраженностью увеита, у многих больных концентрации этих цитокинов были ниже уровня детекции.
Ключевые слова: проникающая травма глаза, увеит, слезная жидкость, неоптерин, цитокины.
A SEARCH FOR RELIABLE AND INFORMATIVE MOLECULAR MARKERS OF INFLAMMATION
IN POST-TRAUMATIC UVEITIS Dikinov Z.H.
Medical Faculty of H.M.Berbekov Kabardino-Balkaria State University, Nalchik
Penetrating eye injuries are often complicated by the development of uveitis, which is a major cause of vision loss. An important task is to find molecular markers that reflect severity of the inflammatory process in the uveal tract. The incidence of identification for tumor necrosis factor (TNF), interleukin-ip (IL-1P) and neopterin and dynamic changes of their concentration in tear fluid have been studied in 93 patients with acute posttraumatic uveitis of different localization. Neopterin was found to be the most reliable and informative marker of intraocular inflammation. Despite the fact that the average levels of TNF and IL-ip correlated with the severity of uveitis, in many patients the concentrations of these cytokines were below the detection level.
Keywords: penetrating eye injury, uveitis, tear fluid, neopterin, cytokines.
Прогресс в совершенствовании методов микрохирургии глаза определяет достаточно высокую эффективность лечения больных с проникающими травмами этого органа (ПТГ). Вместе с тем ранения глаза характеризуются частым развитием увеита, связанного либо с прямым заносом инфекции внутрь глазного яблока, либо с аутоиммунными процессами вследствие нарушения гематоофтальмического барьера. Подчеркнем, что аутоиммунные реакции играют существенную роль в поражении сосудистой оболочки глаза и при инфекционном генезе посттравмати-ческого увеита. Воспаление увеального тракта в свою очередь является основной причиной субатрофии и атрофии глазного яблока и посттравма-тической энуклеации.
В этой связи актуальной задачей является поиск простых и наиболее информативных молекулярных маркеров, которые отражают выраженность внутриглазного воспаления, с целью своевременной и адекватной терапии развивающегося увеита.
На экспериментальных моделях и у больных увеитом установлен количественный и функциональный дисбаланс субпопуляций CD4+ клеток,
проявляющийся поляризацией дифференцировки посттимических Т-клеток-предшественников в направлении ^хелперов 1 типа (ГЫ) и снижением активности регуляторных ^клеток [7, 8, 13]. Это проявляется увеличением концентрации ряда провоспалительных цитокинов и хемокинов во внутриглазной жидкости, стекловидном теле, сыворотке и плазме крови. Одним из наиболее информативных показателей выраженности воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза является уровень интерферона-у (ИФН-у) во внутриглазной жидкости (при инфекционном и неинфекционном генезе заболевания) и в сыворотке крови (при неинфекционном увеите) [16]. В камерах глаза при некоторых воспалительных заболеваниях глаза также выявляются ИЛ-2, ИЛ-
6, ИЛ-10, ИЛ-12, ТФР-Р, ФНОа и фактор, ингибирующий миграцию макрофагов [15]. Однако прогностическая и диагностическая ценность определения уровня этих цитокинов при увеитах остается предметом дискуссии. Отчасти это связано с коротким периодом полужизни большинства цитокинов в указанных биологических жидкостях из-за быстрой биодеградации и связывания с клеточными и растворимыми рецепторами.
Сведения об уровне цитокинов в слезной жидкости (СЖ) при различных заболеваниях также весьма противоречивы. Более того, частота выявления разных цитокинов в слезной жидкости сильно варьирует, что ставит под сомнение возможность использования уровня этих веществ как критериев активности воспалительного процесса. В связи с этим поиск более стабильных, долгоживущих маркеров активации клеточного иммунитета представляется крайне востребованным.
Одним из таких маркеров является низкомолекулярный гетероциклический продукт моноцитов/макрофагов и некоторых других клеток - неоптерин. Его концентрация в биологических жидкостях отражает совместное действие основных провоспалительных цитокинов, генерируемых Th1-клетками (ИФН-у) и моноцитами/макрофагами (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа) [10].
Уровень неоптерина в различных биологических жидкостях (моче, сыворотке крови) успешно используется как маркер активности клеточного иммунитета при воспалительных заболеваниях отдельных органов и систем организма. Показано, что концентрация неоптерина в моче может служить критерием активности идиопатического увеоретинита [14]. Работ по исследованию уровня неоптерина в СЖ мало, а их данные не позволяют сделать вывода о диагностической ценности определения этой молекулы при увеите [12].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обследовано 120 пострадавших с ПТГ различной локализации, находившихся на стационарном лечении в глазном отделении Республиканской клинической больницы (КабардиноБалкарская Республика, г. Нальчик). Из этих больных для поиска эффективных маркеров воспаления сосудистой оболочки была отобрана группа из 93 человек (преимущественно мужчин) с острыми посттравматическими увеитами различной локализации в возрасте от 15 до 70 лет. У подавляющего числа больных травма носила бытовой или криминальный характер. У 46 человек острый посттравматический увеит осложнился внутриглазной инфекцией, у 47 - посттравмати-ческий период протекал без инфекционных осложнений.
Среди больных с неосложненным течением заболевания 61% пациентов поступили в 1-е сутки после травмы, 35% - на 2-3-е сутки, 4% - на 4е сутки. У 23 человек (48,6%) наблюдались роговичные ранения, у 24 (32,4%) - роговичносклеральные, у 14 (18,9%) - склеральные.
67% пациентов с осложненным течением госпитализированы в 1 -е сутки после ранения, 20% -
на 2-3-е сутки, 13% - на 4-е сутки. Роговичная локализация ПТГ отмечена у 11 человек (23,9%), роговично-склеральная - у 27 (58,7%), склеральная - у 7 (15,2%) и сквозная - у 1 (2,2%).
Степень тяжести ПТГ определяли, как описано в работе [9].
Активность воспалительного процесса при увеитах представляли в баллах, рассчитанных как общая сумма оценки основных проявлений воспалительного процесса: инъекция глазного яблока-0 (есть), 1 (нет); слезотечение - 0 (есть), 1 (нет); светобоязнь - 0 (есть), 1 (нет); цилиарные боли - 0 (есть), 1 (нет); роговица вне раны -
0 (прозрачная), 1 (отек эндотелия), 2 (десцеме-тит), 3 (преципитаты); гипотония - 0 (есть),
1 (нет); влага передней камеры - 0 (прозрачная), 1 (опалесцирующая), 2 (экссудат); радужка -0 (спокойная), 1 (отек), 2 (гиперемия, синехии); стекловидное тело - 0 ^покойное), 1 (экссудат).
Забор слезы проводили из нижнего конъюнктивального свода после предварительного стимулирования парами нашатырного спирта. Для исследования использовали неразведенную СЖ, образцы которой хранили при температуре -20°С, не допуская повторного размораживания/оттаивания образцов.
Определение молекулярных маркеров воспаления в СЖ проводили в 1 -3-е сутки после первичной хирургической обработки (ПХО) раны, затем на 8-10-е сутки, 14-16-е сутки, через 1 месяц и через 3 месяца.
Уровень ИЛ-1Р и ФНО в СЖ оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением тест-систем производства ООО «Протеиновый контур» (г. Санкт-Петербург).
Уровень неоптерина в СЖ определяли методом твердофазного ИФА, используя тест-системы Neopterin ELISA («IBL-HAMBURG», Германия).
Для выявления референсных значений исследуемых показателей изучены образцы СЖ у 40 здоровых студентов медицинского факультета КБГУ им. Х.М. Бербекова в возрасте от 17 до
25 лет (22,4±6,3 года), среди которых было 12 мужчин и 28 женщин.
Полученные данные обрабатывали согласно общепринятым методам статистической обработки [11] с помощью программы STATGRAF и представляли в виде средней ± стандартное отклонение. Характер распределения анализируемых параметров в выборках оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Меж-групповые сравнения проводили с помощью г-критерия Стьюдента для нормально распределенных показателей и непараметрических критериев Манна-Уитни и Вилкоксона для распределений, отличных от нормального. Различия считали
значимыми при р<0,05. Связь между нормально распределенными количественными показателями и ее направленность оценивали, используя коэффициент корреляции Пирсона. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена рассчитывали при анализе связи порядковых признаков и переменных с ненормальным распределением.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В группе больных с неосложненным течением ПТГ у 10 пациентов (13,52%) отмечена травма легкой степени, у 30 (40,54%) - средней тяжести, у 34 (45,9%) - тяжелой степени. У пациентов с осложненным течением ПТГ травм лёгкой степени не было, травмы средней тяжести выявлены у 12 больных (26 %), тяжелые - у 34 (74 %).
У большинства больных (89%) отмечалось резкое снижение зрения, что свидетельствовало о тяжести травмы и развитии осложнений. Внутриглазные инородные тела обнаружены у 62 больных (67%), повреждение хрусталика - у 60 (65%), выпадение и ущемление внутренних оболочек глаза - у 52 (56%), гифема различной степени выраженности - у 48 (52%), гемофтальм - у
26 (28%), отслойка сетчатки - у 6 (6,5%). У 35 (38%) пациентов при поступлении были обнаружены признаки раневой инфекции: инфильтрация краев раны, опалесценция влаги передней камеры, гипопион, экссудат на радужке и передней камере, стекловидном теле.
Всем больным с проникающими ранениями глаз в экстренном порядке при поступлении про-
водили ПХО под местной или общей анестезией. Повторные оперативные вмешательства в ранние сроки после ПХО выполнены 28 пациентам. Чаще всего это были операции по поводу набухающего хрусталика (16 пациентов), вымывание гипопиона и введение антибиотиков в переднюю камеру (8 пациентов), рассечение синехий или базальная иридэктомия (3 пациента), пломбировка склеры (1 пациент).
Воспалительный процесс в сосудистой оболочке достигал максимума к 7-10-м суткам после ПХО, хотя степень выраженности была различной в зависимости от характера течения пост-травматического периода. У пациентов с неосложненным течением активность воспалительного процесса была наиболее выражена на 78-е сутки наблюдения и составляла в среднем 6,17 балла. При осложненном течении острого пост-травматического увеита наиболее выраженные воспалительные признаки (в среднем 10,35 балла) проявлялись к 8-10-м суткам после ПХО.
В СЖ здоровых доноров концентрации ФНО и ИЛ-ір были выше уровня обнаружения (20 пг/мл) примерно в половине случаев (рис. 1). В первые дни после ПХО частота выявления этих цитокинов несколько увеличивалась, достигая максимума на 8-10-е сутки наблюдения. К этому сроку ФНО определялся в СЖ у 70 больных (75%), ИЛ-1Р - у 60 больных (65%). По мере стихания явлений посттравматического увеита частота определения ФНО и ИЛ-1Р в СЖ снижалась. Через 3 месяца после травмы ФНО выявлялся лишь у 47 пациентов (50%), ИЛ-1Р - у 33 больных (35%).
Рис. 1. Частота выявления цитокинов в слезной жидкости пациентов с посттравматическими увеитами.
Концентрация неоптерина в СЖ была выше уровня детекции не только у 100% обследованных больных в течение всего периода наблюдения, но и у всех здоровых доноров.
У больных с неосложненным течением ПТГ между уровнями ФНО, ИЛ-1Р и неоптерина в СЖ выявлена прямая корреляционная связь.
В первые 3 дня после ПХО наблюдалось умеренное повышение уровня провоспалительных цитокинов и неоптерина (табл. 1). Средняя концентрация ФНО превышала таковую у здоровых доноров в 1,8 раза, ИЛ-1Р - в 3 раза, неоптерина -в 2 раза. При этом математически подтвержденной разницы уровней ИЛ-1Р и ФНО у больных и здоровых доноров не обнаружено, что связано с высокими индивидуальными вариациями показателей, в частности с тем, что во многих случаях концентрация цитокинов была ниже уровня обнаружения.
К началу второй недели (8-10-е сутки) после ПХО отмечалось наиболее выраженное повышение концентрации провоспалительных цитокинов и неоптерина, что коррелировало с максимальными проявлениями воспаления в увеальном тракте. Это объясняется значительным нарушением проницаемости гематоофтальмического барьера, повреждением специализированных струк-
тур глаза, поступлением антигенов в кровь и срывом механизмов толерантности к забарьерным антигенам сосудистой оболочки глаза и хрусталика.
Достаточно высокий уровень изучаемых маркеров воспаления в СЖ сохранялся и через 1 месяц после получения травмы. К этому сроку от нормы достоверно не отличалась лишь концентрация ИЛ-1р.
Снижение концентраций ФНО и неоптерина до уровней, статистически не отличающихся от референсных значений, наблюдалось только через 3 месяца после ПТГ.
У больных с ПТГ, осложнившихся внутриглазной инфекцией, наблюдались в целом сходные закономерности изменения концентраций иммунологических маркеров воспаления СЖ.
Резкое повышение содержания острофазных цитокинов в СЖ наблюдалось с первых дней после травмы (табл. 2). Продукция ИЛ-1Р увеличилась в 4,8 раза, ФНО - в 5 раз, неоптерина - почти в 4 раза.
По крайней мере, отчасти это объясняется стимуляцией микроб-ассоциированными молекулярными паттернами моноцитов-макрофагов, проникающих в переднюю камеру из сосудов радужки.
Таблица 1
Изменения концентраций маркеров воспаления у больных с проникающими ранениями глаз при неосложненном течении ПТГ
Маркеры воспаления в СЖ Норма Уровень маркеров воспаления в разное время после ПХО по поводу ПТГ
1-3-е сутки 8-10-е сутки Через 1 месяц Через 3 месяца
ФНО (пг/мл) 80±82 144±115 421±287* 344±257* 129±144
ИЛ-1Р (пг/мл) 17±21 50±48 76±39* 41±52 24±33
Неоптерин (нг/мл) 0,81±0,42 1,64±0,53* 4,13±1,28* 3,18±1,01* 1,37±0,92
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с нормой
Таблица 2
Изменения концентраций маркеров воспаления у больных с проникающими ранениями глаз при осложненном течении ПТГ
Маркеры воспаления в СЖ Норма Уровень маркеров воспаления в разное время после ПХО по поводу ПТГ
1-3-е сутки 8-10-е сутки Через 1 месяц Через 3 месяца
ФНО (пг/мл) 80±82 407±239* 784±410* 548±381* 254±172*
ИЛ-1Р (пг/мл) 17±21 82±61* 103±65* 71±46* 35±41
Неоптерин (нг/мл) 0,81±0,42 3,04±1,09* 6,49±2,12* 4,53±1,88* 3,16±0,92*
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с нормой
При осложненном течении посттравматиче-ского увеита повышение иммунологических маркеров воспаления в СЖ было более стойким. Даже через 3 месяца после травмы на фоне проводимой традиционной терапии уровни ФНО и нео-птерина достоверно превосходили референсные значения. В это время средняя концентрация ИЛ-1Р была также вдвое выше нормы, но вариативность этого показателя и у здоровых доноров, и у пациентов с ПТГ делала это отличие недостоверным.
Более высокий процент определения неопте-рина в СЖ связан как с большей продолжительностью жизни данного цитокина, так и с более высокой инертностью его продукции иммуно-компетентными клеткам. Острофазные цитокины ИЛ-1 и ФНО, обладая коротким периодом жизни, не всегда адекватно отражают тяжесть воспалительного процесса, и частота их выявления значительно снижается в период стихания воспалительного процесса.
Данные настоящего исследования интересны не только с позиции выявления дополнительных лабораторных критериев активности воспалительного процесса в сосудистой оболочке. Установленное стойкое повышение провоспалитель-ных медиаторов в СЖ, особенно у больных с по-сттравматической инфекцией глазного яблока, говорит о целесообразности поиска эффективных средств коррекции этого звена патогенеза увеита [2, 3]. Обнадеживающий первый опыт применения аминофталгдразида в лечении увеита [4, 5], подкрепленный информацией о способности этого иммуномодулятора регулировать продукцию ИЛ-1 и ФНО [6], в свете представленных в настоящей работе данных говорят о том, что это лекарственное средство [1] может найти применение в качестве компонента комплексного лечения пост-травматического увеита.
Полученные результаты не позволяют судить, какие именно клетки являются продуцентами выявленных маркеров воспаления: либо это моноциты/макрофаги, участвующие в инфекционном и/или аутоиммунном воспаление непосредственно в увеальном тракте, либо это клетки, инфильтрирующие слезные железы и/или конъюнктиву. Так или иначе, уровень всех изученных молекул отражал динамику воспалительного процесса в сосудистой оболочке. Однако с учетом того, что у многих пациентов, впрочем, как и у здоровых доноров, концентрации ФНО и ИЛ-1 были ниже уровня обнаружения, гораздо более надежным и информативным маркером внутриглазного воспаления для каждого индивидуально взятого больного следует признать неоптерин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абидов М.Т., Калюжин О.В., Гришина Т.И. Новый отечественный иммуномодулирующий и противовоспалительный препарат // Военно-медицинский журнал. - 1999. - № 1. - С. 41-45.
2. Абидов М.Т., Калюжин О.В., Нелюбов М.В. Иммунотерапия острых и хронических воспалительных заболеваний // Tera Medica Nova. - 2001. - № 2. -С. 3-7.
3. Абидов М.Т., Баштаненко А.Ф., Нелюбов М.В., Шкалев М.В., Ковалевская Е.О., Калюжин О.В. Регуляция иммунных реакций в лечении хронических и острых воспалительных заболеваний // Якутский медицинский журнал. - 2004. - № 3 (7). -C. 58-60.
4. Аджави Ш.М., Волик Е.И., Аджави С.М. Современные методы лечения задних увеитов вирусной, хламидийной, токсоплазмозной этиологии // Кубанский научный медицинский вестник. - 2005. -№ 3-4. - С. 54-57.
5. Дикинов З.Х. Местная локальная иммунокоррекция в сочетании с оксигенобаротерапией в лечении острых гнойных заболеваний сосудистой оболочки глаз // International Journal on Immuno-rehabilitation. - 2003. - Т. 5, № 2. - C. 242.
6. Калюжин О.В., Абидов М.Т. Регуляция продукции интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли гала-витом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1999. - Т. 127 (Прил. 2). - С. 42-43.
7. Калюжин О.В., Дикинов З.Х., Евсегнеева И.В. Иммунные механизмы экспериментальных увеорети-нитов // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2011. - № 1. -С. 153-159.
8. Калюжин О.В., Дикинов З.Х., Евсегнеева И.В. Модели интраокулярного воспаления // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2011. -№ 2. - С. 14-19.
9. Поляк Б.Л. Повреждения органа зрения. - Л.: Медицина, 1972. - 415 с.
10. Свиридов Е.А., Телегина Т.А. Неоптерин и его восстановленные формы: биологическая роль и участие в клеточном иммунитете // Успехи биологической химии. - 2005. - Т. 45. - С. 355-390.
11. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2000. - 456 с.
12. Чернышева А.Д., Онищенко А.Л., Колбаско А.В., Суржикова Г.С. Значение неоптерина в этиологической диагностике эндогенных увеитов // Вестник офтальмологии. - 2011. - № 2. - С. 25-29
13. Caspi R.R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye // J. Clin. Invest. - 2010. - Vol. 120 (9). -P. 3073-3083.
14. Palmer H., Giovannoni G., Stanford M., Wallace G.R., Graham E.M. Urinary neopterin in idiopathic retinal vasculitis // Br J Ophthalmol. -2001; - Vol. 85 (1). -P. 30-33. doi: 10.1136/bjo.85.1.30
15. Sharma R.K., Rogojina A.T., Chalam K.V. Multiplex immunoassay analysis of biomarkers in clinically accessible quantities of human aqueous humor // Mol. Vis. - 2009. - Vol. 15. - P. 60-69.
16. Takase H., Sugita S., Taguchi C., Imai Y., Mochizuki M. Capacity of ocular infiltrating T helper type 1 cells of patients with non-infectious uveitis to produce
chemokines // Br. J. Ophthalmol. - 2006. - Vol. 90 (6). - P. 765-768.
