CC BY
23МЕДИЦИНА. ПРИКЛАДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ
Поиск мутационной подписи активных форм кислорода в мтДНК: анализ экспериментальных данных
Ван Лейден Никита Сергеевич,
магистрант, Институт живых систем, Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта E-mail: nik1992_26@bk.ru
Патлай Наталия Игоревна,
аспирант, Институт живых систем, Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта E-mail: nataliyapatlay@gmail.com
Патлай Игорь Иванович,
заведующий отделением рентгенохирургических методов диагностики и лечения, ГБУЗ «Областная клиническая больница Калининградской области» E-mail: ipatlay@mail.ru
Активные формы кислорода (АФК) способны повреждать ми-тохондриальную ДНК (мтДНК), вызывая разного рода мутации. Имеются подтвержденные мутационные подписи в ядерной ДНК (яДНК) для АФК, в отличие от мтДНК, для которой специфические мутации точно не установлены. В мутационном спектре АФК в мтДНК преобладают транзиции, что имеет сходство со спектром раковых клеток. Митохондриальный геном характеризуется консервативностью, а для разных групп мутагенов используются общие правила мутирования. Процентное увеличение мутаций в мтДНК С>А и G>T можно рассматривать как специфическую мутационную подпись АФК. Мутация G>A не имеет характерной подписи для АФК в мтДНК, в отличие от яДНК, что может быть связано с условиями эксперимента.
Ключевые слова: митохондриальная ДНК, активные формы кислорода, мутационный спектр, мутационные подписи, мито-хондриальный геном.
е
CJ
см со
Введение
Митохондрии выполняют множество функций внутри эукариотических клеток. К ним относят синтез молекул АТФ, участие в клеточной сигнализации, синтез белковых кофакторов, которые используются в процессах метаболизма клетки. Митохондрии имеют свой генетический материал - мтДНК, которая кодирует 13 субъединиц белков, участвующих в процессах окислительного фосфорилирования, а также в работе транспортных и рибосомальных РНК [1]. Несмотря на то, что 99% белков кодируется яДНК, целостность митохондрий важна для осуществления митохондриальных функций. Нарушение данных функций может быть связано с мутациями в структуре мтДНК, ее фрагментацией и другими факторами. Предыдущие исследования показали, что мтДНК является одной из главных мишеней для генотоксического воздействия со стороны химических и физических факторов [2]. Другие исследования указывают на то, что некоторые мутации более распространены, чем другие [3]. Так, например, мутации, связанные с заменами цитози-на на тимин (С>Т) и аденина на гуанин (А^) происходят заметно чаще, чем другие. Характерные мутации, вызываемые теми или иными факторами, называются мутационными подписями. Так, был установлен ряд мутационных подписей для некоторых мутагенов. [4].
Активные формы кислорода являются корот-коживущими молекулами, к которым относят такие молекулы как: 02-, Н202 и •ОН, впервые обнаруженные в скелетных мышцах и описанные как свободные радикалы [5]. Большинство АФК образуются эндогенно как побочные продукты мито-хондриального окислительного фосфорилирова-ния или могут быть образованы как промежуточные продукты оксидоредуктаз. Атомы кислорода подвержены образованию радикалов, так как содержат два неспаренных электрона на внешнем электронном уровне [6]. Восстановление кислорода при помощи электронов ведет к образованию АФК. В другом случае, АФК могут быть образованы под действием экзогенного стресса, например при помощи ионизирующего излучения, химиоте-рапевтических препаратов и других внешних факторов. Установлено, что мтДНК в большей степени подвержена окислительным повреждениям, чем яДНК. На это указывают обнаруженные модификации оснований, в частности 8-гидроксидезокси-
гуанозина, которые могут приводить к точечным мутациям из-за неправильного спаривания [7].
Для АФК был установлен мутагенный характер воздействия на яДНК, однако в настоящий момент остается открытым вопрос, имеют ли АФК специфическую мутационную подпись в мтДНК. На данный момент отсутствуют исследования, которые бы сравнивали мутационный спектр АФК с разными классами мутагенов. Ответ на данный вопрос мог бы позволить взглянуть по-новому на эволюцию митохондриального генома. Было показано существенное увеличение количество мутаций C>A во время действия окислительного стресса [8]. В другом исследовании сообщалось, что мутации G>T и G>A могут быть следствием окислительного повреждения ДНК активными формами кислорода [9]. В нашем исследовании мы предполагали найти специфическую подпись для АФК в отношении мтДНК, сопоставив различия мутационных спектров мутагенов из разных классов.
Материалы и методы
В качестве исходных данных были использованы результаты работы Kucab J.E. et al. [10], связанные с установлением мутационных подписей некоторых химических и физических факторов. В ходе исследования проводилось полигеномное секвенирова-ние плюрипотентных стволовых клеток человека, которые были подвергнуты воздействую 79 известных и предполагаемых мутагенов.
Все мутагены были разделены на следующие категории: алкилирующие агенты, альдегиды, ароматические амины, гетероциклические амины, активные формы кислорода, ингибиторы репари-рующие ферменты, соли металлов, медицинские препараты, нитрозамины, нитрополициклические ароматические углеводороды, полициклические ароматические углеводороды, радиация. АФК были представлены: пероксинитритом (концентрация 30 мкМ), пероксидом водорода (концентрация 24,5 мкМ) и броматом калия в концентрациях 260 и 875 мкМ.
Клетки культивировались и проходили обработку мутагенами на планшетах с добавлением Vitronectin XF (Corning) с концентрацией 10-15 мл/ мг в среде TeSR-E8 (GIBCO) при 37оС в 5% атмосфере СО2 за исключением клеток, которые культивировались с добавлением S9 для запуска ми-тохондриальной активности. АФК использовались без добавления S9. Среда подвергалась замене ежедневно, а культуры пассировали при 80% кон-флюэнтности примерно каждые 3-4 дня. Для каждого мутагена предварительно были подобраны такие условия (концентрация, сила излучения), которые приводили к 40-60% цитотоксичности, а в некоторых случаях и к 80%.
Клетки подвергали воздействию мутагенов в течение 8 и 24 часов, после промывая раствором PBS. Клетки, обработанные пероксидом водорода и подвергшиеся гамма-излучению, были отобраны
через 2 и 4 часа после начала обработки. После этого клетки культивировали в течение 7 дней для их восстановления и размножения. Для изоляции клеток на субклоны, обработанные популяции диссоциировали на суспензии отдельных клеток и высеивали на 96-луночные планшеты. Далее среду меняли ежедневно на протяжении 7-10 дней, до тех пор, пока не были созданы новые клоны. После этого 6 клонов пассировали от каждого образца в 6-лучноные планшеты. Для проверки того, что субклоны возникали из одной и той же клетки, использовали систему IncuCyte.
Далее были количественно определены двухце-почечные ДНК с использованием высокочувствительных систем Biotium Accuclear Ultra и Mosquito LV. В планшетные ридеры Bravo WS и BMG FLUOstar Omega были отобраны по 200 нг/120 мл исследуемых жидкостей. Далее с использованием прибора Covaris LE220 происходило разрезание двухцепочечной ДНК на участки размером 450 пар оснований. Образцы были также очищены с использованием Agencourt AMPure XP SPRI, библиотеки были созданы в системе NEB Ultra II. Далее проводили ПЦР в автоматической системе Agilent Bravo WS, которая включала в себя 6 стандартных циклов. Полученные результаты сначала были объединены в эквимолярных количествах, а затем нормализованы до 2,8 нМ.
Объединенные образцы загружали на платформу секвенирования Illumina в формате Х10 с длинной прогона 150 РЕ. Для выравнивания использовали геном человека GRCh37/hg19. Системы CaVEMan, Pindel и BRASS были использованы для определения соматических мутаций в субклонах, в качестве фильтра использовали VAF R 0.2. Общие мутации были удалены для определения только de novo мутаций, возникших после обработки мутагенами.
Исходные данные представляли собой архив, доступ к которому был получен сотрудниками лаборатории Центра функциональной мито-хондриальной геномики БФУ им. Канта. Архив данных находится на сайте Европейского Геномного Архива (EGA; https://ega-archive.org/studies/ EGAS00001002060). Исходные данные были загружены на кластер EPFI (Лозанна, Швейцария). Набор данных был представлен 2658 файлами, размер которых составил 11,5 ТБ. Загруженный архив состоял из файлов с расширениями.сгат ^cram.md5., содержащих контрольные суммы, и файлов с расширением^т, содержащих мито-хондриальные последовательности субклонов, извлеченных в результате полигеномного выравнивания.
После первичной обработки данных был создан новый архив, содержащий выровненные последовательностей мтДНК с мутацииями, а также файл-таблица, имеющая информацию о соотнесении файлов по идентификационному номеру с определенным мутагеном и его субклоном. При помощи языков программирования R в среде R-Studio 8.15. (R-Tools Technology, Канада)
сз о
о Л о
о сз о в
и Python в среде PyCharm 2020.1 (JetBrains s.r.o., Чехия) данные были идентифицированы по каждому мутагену и условиям. Также было подсчитано количество одиночных замен для каждого мутагена, для того чтобы сопоставить различия мутационного спектра АФК с другими мутагенами. Для решения проблемы с субклонами, для которых использовался один и тот же мутаген, мы суммировали полученные результаты при помощи дедупликации. Для этого был создан список мутагенов в недублированном виде при помощи преобразования данных во множество, в котором удаляются повторяющиеся данные.
Статистическая обработка данных была проведена при помощи программы GraphPad PRISM 8 (GraphPad, США). Анализ данных был проведен
на основе гипотезы нормальности распределения, для которого использовался тест ANOVA. Для оценки статистической достоверности исследуемых данных был использован непараметрический критерий для ненормально распределенных данных для сравнения средних значений каждого результата с остальными. Статистически значимыми различиями считали при р<0,05.
Результаты
На основании полученных данных по количеству замен в мтДНК после ее обработки различными мутагенами, была построена общая таблица, показывающая процентное распределение мутаций для разных классов мутагенов (рис. 1).
Рис. 1. Процентное распределение замен в мтДНК после ее обработки различными мутагенами. По вертикали: классы мутагенов, по горизонтали: процентное содержание мутаций
в
CJ
см со
Исходя из данной таблицы, нами были выделены 5 наиболее часто встречаемых мутаций, вызванных АФК: А^, С>Т, Т>С, G>A, А>С. При этом мутации А^, С>Т, Т>С, G>A являются тран-зициями, а мутации А>С - трансверсиями. Также, предположительно, G>A является мутационной подписью АФК. В нашем анализе наблюдается
преобладание транзиций в мутационном спектре, что согласуется со многими исследованиями. Так, например, установлено, что в раковых клетках из разных тканей в мутационном спектре имеется больше транзиции, а не трансверсий [11,12].
Далее мы сравнили количество замен в наиболее часто встречающихся мутациях у разных клас-
сов мутагенов, чтобы понять, есть ли статистическое различие между ними. Для проверки мутационной подписи АФК, мы провели сравнительный анализ замен, которые часто встречаются в мтДНК (А^, С>Т, Т>С, G>A, А>С). В результате статистическая значимость составила р>0,05, что может свидетельствовать о том, что митохондриальный геном характеризуется стабильностью, а для мутагенов разных групп используются общие правила мутирования, что подтверждается другими исследованиями, связанными с воздействием АФК на мтДНК [13,14].
Как упоминалось ранее, предыдущие исследования смогли установить возможные подписи АФК. Ими являются мутации из С>А, G>A и G>T. Предварительный анализ по каждой мутации по отдельности не дал необходимого результата (р>0,05). Поэтому нами были сложены процентные показатели данных мутаций в разных комбинациях: С>А+ G>A, С>A+G>T, G>A+ G>T и комбинация из всех трех замен. Во всех комбинациях, кроме С>A+G>T (рис. 2), отсутствовала статистическая значимость.
Рис. 2. Процентное распределение мутаций С>А и G>T в мтДНК субклонов, подверженных воздействию мутагенов разных классов. По вертикали: классы мутагенов, по горизонтали: процентное содержание мутаций.
Статистическая значимость: * - р<0,05, ** - р<0,01
Из полученных данных следует, что АФК действительно демонстрируют специфическую мутационную подпись в комбинации двух мутаций: С>А и G>T. Статистическая значимость установлена для алкилирующих агентов, гетероциклических аминов, солей металлов, медицинских препаратов, нитрополициклических ароматических углеводородов (все р<0,05), а также с высокой долей достоверности для альдегидов (р<0,01). Таким образом, данные замены, возникающие в мтДНК в результате действия окислительного стресса при помощи АФК, могут быть опознаны и их можно отличить от мутаций, вызванных другими мутагенами. Мы не увидели различий для ароматических аминов, ингибиторов репарирующих ферментов, нитрозаминов, полициклических ароматических углеводородов и радиации (все р>0,05). Причиной может являться сходство мутационного спектра данных групп мутагенов, либо это может указывать на то, что прямо или опосредованно действие данных групп мутагенов ведет к выработке АФК, как это было показано для солнечной радиации [15], соединений мышьяка [16], азатио-прина [17] и других мутагенов.
Мы предполагаем, что статистическая значимость отсутствовала для других мутационных ком-
бинаций ввиду того, что каждая мутация в отдельности имеет слабо выраженный эффект. Предполагаемая нами подпись АФК в заменах G>A не нашла подтверждения. Мы считаем, что это может быть связано с тем, что мутации, вызванные действием АФК, в большинстве случаев идут по пути трансверсий, а не транзиций, что может также являться мутационной подписью для АФК. С другой стороны, исследования, связанные с установлением зависимости между частотой тразиций и трансверсий у коротко- и долгоживущих млекопитающих выявили преобладание транзиций у долго-живущих млекопитающих [15]. Так, короткоживу-щие виды, за счет высокой скорости метаболизма и, как следствие, повышенной генерацией АФК, будут иметь склонность к трансверсиям С>А, G>T, но не к транзициям G>A. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что мутации С>А и G>T можно рассматривать как специфический мутационный маркер АФК для мтДНК.
Заключение
Цель данной работы состояла в нахождении и подтверждении мутационной подписи для АФК в мтДНК. В настоящий момент отсутствуют исследования,
> С
ф
о
сэ
о ©
Я
позволяющие определить мутаген по характерным мутациям, возникающим в мтДНК. Сравнительный анализ показал, что, несмотря на различия мутагенов, характер мутаций имеет общие сходства. В частности, нами показано преобладание в мутационном спектре транзиций A>G, C>T, T>C, G>A, А>С как для АФК, так и для других мутагенов. Это свидетельствует о консервативности митохондри-ального генома. Мутации, вызванные мутагенами, имеют общее сходство с мутациями в раковых клетках, где также показано преобладание транзиций, а не трансверсий [11, 12].
Нами было установлено, что трансверсии С>А, G>T могут являться мутационными подписями АФК для мтДНК. Мутация G>A не является мутационной подписью АФК, однако мы предполагаем, что увеличение времени воздействия АФК на мтДНК или увеличение концентрации АФК в эксперименте могло бы показать значимые различия для данной мутации.
Литература
1. Brown G. C. et al. Mitochondrial fission and fusion //Essays in biochemistry. - 2010. - Т. 47. -С. 85-98.
2. Roubicek D. A., de Souza-Pinto N.C. Mitochondria and mitochondrial DNA as relevant targets for environmental contaminants //Toxicology. -2017. - Т. 391. - С. 100-108.
3. Tuppen H. A. L. et al. Mitochondrial DNA mutations and human disease //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. - 2010. - Т. 1797. -№ . 2. - С. 113-128.
4. Federico A. et al. Mitochondria, oxidative stress and neurodegeneration //Journal of the neurological sciences. - 2012. - Т. 322. - № . 1-2. - С. 254262.
5. Commoner B., Townsend J., Pake G.E. Free radicals in biological materials //Nature. - 1954. -Т. 174.- № . 4432. - С. 689-691.
6. Vanin A.F. What is the mechanism of nitric oxide conversion into nitrosonium ions ensuring S-nitrosating processes in living organisms //Cell biochemistry and biophysics. - 2019. - Т. 77. -№ . 4. - С. 279-292.
7. Hsieh C. J. et al. Tissue-specific differences in mitochondrial DNA content in type 2 diabetes // Diabetes research and clinical practice. - 2011. -Т. 92. - № . 1. - С. 106-110.
8. Poetsch A.R. The genomics of oxidative DNA damage, repair, and resulting mutagenesis // Computational and structural biotechnology journal. - 2020. - Т. 18. - С. 207-219.
9. Salehi F. et al. Oxidative DNA damage induced by ROS-modulating agents with the ability to target DNA: A comparison of the biological characteristics
e of citrus pectin and apple pectin //Scientific M reports.-2018.-Т. 8.-№ .1.-С. 1-16. 5Ü 10. Kucab J. E. et al. A compendium of mutational ° signatures of environmental agents //Cell. -i 2019. - Т. 177. - № . 4. - С. 821-836. e16.
11. Larman T. C. et al. Spectrum of somatic mitochondrial mutations in five cancers // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2012. - T. 109. - № . 35. - C. 1408714091.
12. Brandon M., Baldi P., Wallace D.C. Mitochondrial mutations in cancer //Oncogene. - 2006. - T. 25. -№ . 34.- C. 4647-4662.
13. Lagouge M., Larsson N.G. The role of mitochondrial DNA mutations and free radicals in disease and ageing //Journal of internal medicine. - 2013. -T. 273. - № . 6. - C. 529-543.
14. Savu O. et al. Stability of mitochondrial DNA against reactive oxygen species (ROS) generated in diabetes //Diabetes/metabolism research and reviews. - 2011. - T. 27. - № . 5. - C. 470-479.
15. Abdel Haliem E., Abdullah H., Al-Huqail A.A. Oxidative damage and mutagenic potency of fast neutron and UV-B radiation in pollen mother cells and seed yield of Vicia faba L //BioMed research international. - 2013. - T. 2013.
16. Hei T. K., Filipic M. Role of oxidative damage in the genotoxicity of arsenic //Free Radical Biology and Medicine. - 2004. - T. 37. - № . 5. - C. 574-581.
17. O'Donovan P. et al. Azathioprine and UVA light generate mutagenic oxidative DNA damage // Science. - 2005. - T. 309. - № . 5742. - C. 18711874.
18. Mikhaylova A. G. et al. Transition transversion ratio in mtDNA is higher in long-versus short-lived mammalians: effects of ROS and replication? // Biodiversity: Genomics and Evolution (BioGenEvo-2018). - 2018. - C. 29.
IDENTIFICATION OF THE MUTATION SIGNATURE OF REACTIVE OXYGEN SPECIES IN MTDNA: ANALYSIS OF EXPERIMENTAL DATA
Koptelov N.S., Patlay N.I., Patlay I.I.
Immanuel Kant Baltic Federal University; GBUZ "Regional Clinical Hospital of the Kaliningrad Region"
Reactive oxygen species (ROS) can damage mitochondrial DNA (mtDNA), causing different kinds of mutations. There are confirmed mutational signatures in nuclear DNA (nDNA) for ROS, in contrast to mtDNA, for which specific mutations have not been precisely identified. In the mutation spectrum of ROS in mtDNA transitions prevail, which is similar to the spectrum of cancer cells. The mitochondrial genome is characterized by conservatism, and general mutation rules are used for different groups of mutagens. The percentage increase in mutations in mtDNA C> A and G> T can be considered as a specific mutational signature of ROS. The G> A mutation does not have a specific signature for ROS in mtDNA, in contrast to nDNA, that may be related to the experimental conditions.
Keyworlds: mitochondrial DNA, reactive oxygen species, mutation spectrum, mutation signatures, mitochondrial genome.
References
1. Brown G. C. et al. Mitochondrial fission and fusion //Essays in biochemistry. - 2010. - T. 47. - C. 85-98.
2. Roubicek D. A., de Souza-Pinto N.C. Mitochondria and mitochondrial DNA as relevant targets for environmental contaminants //Toxicology. - 2017. - T. 391. - C. 100-108.
3. Tuppen H. A. L. et al. Mitochondrial DNA mutations and human disease //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. -2010. - T. 1797. - № . 2. - C. 113-128.
4. Federico A. et al. Mitochondria, oxidative stress and neurodegeneration //Journal of the neurological sciences. - 2012. -T. 322. - № . 1-2. - C. 254-262.
5. Commoner B., Townsend J., Pake G.E. Free radicals in biological materials //Nature. - 1954. - T. 174. - № . 4432. - C. 689-691.
6. Vanin A.F. What is the mechanism of nitric oxide conversion into nitrosonium ions ensuring S-nitrosating processes in living organisms //Cell biochemistry and biophysics. - 2019. - T. 77. -№ . 4. - C. 279-292.
7. Hsieh C. J. et al. Tissue-specific differences in mitochondrial DNA content in type 2 diabetes //Diabetes research and clinical practice. - 2011. - T. 92. - № . 1. - C. 106-110.
8. Poetsch A.R. The genomics of oxidative DNA damage, repair, and resulting mutagenesis //Computational and structural biotechnology journal. - 2020. - T. 18. - C. 207-219.
9. Salehi F. et al. Oxidative DNA damage induced by ROS-modu-lating agents with the ability to target DNA: A comparison of the biological characteristics of citrus pectin and apple pectin //Scientific reports. - 2018. - T. 8. - № . 1. - C. 1-16.
10. Kucab J. E. et al. A compendium of mutational signatures of environmental agents //Cell. - 2019. - T. 177. - № . 4. - C. 821836. e16.
11. Larman T. C. et al. Spectrum of somatic mitochondrial mutations in five cancers //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2012. - T. 109. - № . 35. - C. 14087-14091.
12. Brandon M., Baldi P., Wallace D.C. Mitochondrial mutations in cancer //Oncogene. - 2006. - T. 25. - № . 34. - C. 4647-4662.
13. Lagouge M., Larsson N.G. The role of mitochondrial DNA mutations and free radicals in disease and ageing //Journal of internal medicine. - 2013. - T. 273. - № . 6. - C. 529-543.
14. Savu O. et al. Stability of mitochondrial DNA against reactive oxygen species (ROS) generated in diabetes //Diabetes/metabolism research and reviews. - 2011. - T. 27. - № . 5. - C. 470479.
15. Abdel Haliem E., Abdullah H., Al-Huqail A.A. Oxidative damage and mutagenic potency of fast neutron and UV-B radiation in pollen mother cells and seed yield of Vicia faba L //BioMed research international. - 2013. - T. 2013.
16. Hei T. K., Filipic M. Role of oxidative damage in the genotox-icity of arsenic //Free Radical Biology and Medicine. - 2004. -T. 37. - № . 5. - C. 574-581.
17. O'Donovan P. et al. Azathioprine and UVA light generate mutagenic oxidative DNA damage //Science. - 2005. - T. 309. - № . 5742. - C. 1871-1874.
18. Mikhaylova A. G. et al. Transition transversion ratio in mtDNA is higher in long-versus short-lived mammalians: effects of ROS and replication? //Biodiversity: Genomics and Evolution (BioGe-nEvo-2018). - 2018. - C. 29.
