CC BY
68
УДК: 636.018: 636.4: 575.162
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Б-ПЕТЛИ МИТОХОНДРИАЛЬНОй ДНК У СВИНЕЙ ПОРОД КРУПНАЯ БЕЛАЯ И ЛАНДРАС, РАЗВОДИМЫХ В РОССИИ
H.A. AKOПЯH, аспирант, младший научный сотрудник (e-mail: norkan8888@mail.ru)
O.B. KOCТЮHИHA, кандидат биологических наук, рук. отдела
H.A. ЗИHOBЬЕBA, доктор биологических наук, академик PAH, директор
Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.K. Эрнста, п. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация
Резюме. ДHK-маркеры - удобный инструмент в исследованиях по реконструкции происхождения пород домашних животных, в частности, свиней. Подтвержденное на молекулярном уровне синтетическое происхождение отечественных пород свиней ограничивает информативность ядерных ДHK-маркеров в исследовании их демографической истории. Aнализ последовательности митохондриальной ДHK( мтДHK), имеющей материнский характер наследования, служит эффективным способом оценки исторического происхождения пород. Цель исследования - разработка тест-системы анализа последовательности фрагмента D-петли мтДHKи создание на ее основе серии референтных гаплотипов мтДHK свиней пород крупная белая и ландрас, чаще всего принимавших участие в формировании отечественного генофонда. Исследованная выборка представлена 50 гол. свиней крупной белой породы и 20 гол. породы ландрас различного происхождения. Подобранные олигонуклеотидные праймеры позволили амплифицировать фрагмент D-петли длиной TT0 пар нуклеотидов, пригодный для секвенирования. Секвени-рование и последующий анализ полученных последовательностей выявил наличие 26различных гаплотипов свиней, в том числе 18 - у крупной белой породы и 8 - у породы ландрас. В суммарной выборке двух пород обнаружено 86 вариабельных сайтов. Большинство мутаций представлено транзициями. Соотношение транзиций к трансверсиям согласно теста Hasegawa-Kishino-Yano, модель(+I), составило R=3,84, среднее гаплотипическое разнообразие - h=0,0213±0,012T. Aна-лиз дендограммы, построенной на основании полиморфизма фрагмента D-петли мтДHK, показал отсутствие четкой кластеризации по породному принципу. Вероятно, это обусловлено наличием общих предков и имевшим место обменом генами между породами. Предложенная тест-система позволяет секвенировать фрагмент D-петли мтДHK свиней длиной TT0 пар нуклеотидов. С применением разработанной системы создана база референтных гаплотипов мтДHK пород крупная белая и ландрас, которая будет использована в дальнейших исследованиях для реконструкции демографической истории свиней отечественной селекции.
Ключевые слова: Sus scrofa domestica L., D-петля, митохон-дриальная ДHK, полиморфизм, генетическое разнообразие. Для цитирования: Aкопян H.A., ^стюнина О.В., Зиновьева H.A. Исследование последовательности D-петли митохондриальной MHK у свиней пород крупная белая и ландрас, разводимых в России // Достижения науки и техники AПK. 2016. Т. 30. № T. С. 93-95.
В течение XX века в России посредством улучшения местных малопродуктивных свиней культурными породами (главным образом, крупной белой и ландрас) создан генофонд, адаптированный к условиям разведения в различных регионах страны. Животные отечественной селекции служили неотъемлемым элементом технологии промышленного производства свинины до 70-80-х годов прошлого века. В последние 30-40 лет этот уникальный генофонд практически полностью утерян. Следует отметить, что вытеснение шло, главным об-
разом, посредством поглотительного скрещивания с хряками-производителями более продуктивных культурных пород. Синтетическое происхождение местных пород свиней недавно подтверждено результатами полногеномного SNP-анализа [1]. Нельзя также исключать возможное участие в формировании их аллелофонда кабана [2]. Учитывая, что гаплоидная митохондриальная ДНК (мтДНК), которую несут митохондрии в цитоплазме клеток, имеет материнский характер наследования, в региональных популяциях свиней сейчас могут сегрегировать гаплотипы мтДНК, ведущие свое происхождение от местных животных. В этой связи их исследование позволит получить более точные данные об историческом происхождении отечественных пород.
В изучении биоразнообразия свиней используют различные типы ДНК-маркеров [3]. ДНК митохондрий эволюционирует в 5-10 раз быстрее ядерной, при этом различные участки ее генома изменяются с разной скоростью [4]. Это позволяет считать мтДНК наиболее подходящим маркером для исследований микро- и макроэволюционных процессов. Наиболее информативным регионом мтДНК для изучения материнской наследственности в силу высокой вариабельности служит контролирующая область или D-петля. Ее размер у свиней варьирует от 1254 до 1314 пар оснований в зависимости от числа полиморфных тандемных повторов 5'-CGTGCGTACA-3' [5]. У животных крупной белой породы доказано наличие как европейских, так и азиатских гаплотипов мтДНК [6]. Показана возможность результативного использования мтДНК при выяснении происхождения локальной иберийской породы, включая определение степени интрогрессии диких свиней [7], а также при исследовании аллелофонда тибетских свиней [8]. При этом следует отметить, что в подавляющем большинстве исследований использовали фрагменты мтДНК размером 300-450 пар оснований, что может ограничивать ее информативность как маркера.
Исходя из изложенного, цель исследования - разработка тест-системы анализа фрагмента D-петли, позволяющей получать сиквенс большей длины, и создание на ее основе серии референтных гаплотипов мтДНК свиней пород крупная белая и ландрас, чаще всего принимавших участие в формировании отечественного генофонда.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Объектом исследований служили свиньи пород крупная белая (n=50) и ландрас (n=20) различных предприятий: ОАО «Знаменский СГЦ» (Орловская область), ООО «ПХ Лазаревское» (Тульская область), ООО «СГЦ» (Воронежская область), АПК «Промагро» (Белгородская область).
Выделение ДНК проводили из проб ткани с использованием набора DNA 1 -Step Tissue & Cells Nexttec™ (Nexttec Biotechnologie, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Для амплификации фрагмента гипервариабельной области D-петли мтДНК Sus scrofa domestica L. мы подобрали праймеры в наиболее консервативных участках: mt-DNA1 (5' - TCG TAT GCA AAC CAA AAC GC -3', позиции 15363-15382, NCBI Accession No. AJ002189) и
Таблица 1. Матрица учета транзиций и транверсий, рассчитанная по мо дели Tamura-Nei
От / до Нуклеотид 1
A T/U C G
Нуклеотид 2 ooU> 6,09 6,09 13,631 8,40 20,881 6,50 5,10 16,381 5,10 7,26 3,24 3,24
Каждая ячейка отражает частоту замены (транзиции или трансверсии) нуклеотида 1 на
нуклеотид 2; 'частота транзиций
mt-DNA2 (5' - ACT CAT GCT CTG CAC CCT ATA ACG CCT -3', позиции 115-134), фланкирующие фрагмент длиной 770 пар нуклеотидов. Постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляли в стандартной реакционной смеси [9] в конечном объеме 25 мкл с использованием в качестве матрицы 50-100 нг геномной ДНК. После начальной денатурации при 95 0С в течение 5 мин выполняли 39 циклов амплификации в следующем температурно-временном режиме: 95 0С - 20 с, 60 0С - 20 с, 72 0С - 1 мин 30 с. По окончании выполняли элонгацию при 72 0С в течение 5 мин. Продукты ПЦР визуализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый димидий, до конечной концентрации 30 нг/мл. Специфические продукты ПЦР вырезали из геля и элюировали с использованием набора Cleanup Standard (ООО «Евроген», Россия) согласно рекомендациям изготовителя. Услуги по секвенированию очищенных фрагментов оказывала компания ООО «Евро-ген» (Россия). Для обработки результатов использовали программное обеспечение STATISTICA 1.3, MEGA 6.0 [10], Ugene 1.19.0 [11], DNASP 6.2 [12], ARLEQUIN 3.11 [13], PopArt 1.7 [14, 15] и TCS1.21 [16].
Редактирование и выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы MEGA 6.0 и Ugene 1.19.0, используя метод множественного выравнивания (MSA, multiple sequence alignment). Полученные сиквенсы в формате FASTA сравнивали с референтной последовательностью свиней крупной белой породы (NCBI Accession No. AJ002189). Нуклео-тидные позиции полиморфных сайтов, число вариабельных сайтов (S), среднее число попарных различий между гаплотипами (Pi) определяли в программе MEGA 6.0 и DNASP 6.2. Расчеты нуклеотидного (п) и гаплотипи-ческого разнообразия (h), а также оценку соответствия характера нуклеотидных замен гипотезе нейтральности в обследованных популяциях с помощью Tajima-теста D [17] проводили с помощью программы ARLEQUIN 3.11.
Для описания мутационного процесса (F^-тест) была принята модель нуклеотидной эволюции Tamura-Nei [18]. Статистические тесты на нейтральность и значения отклонений оценивали с использованием 1000 реплик в ARLEQUIN 3.11.
Филогенетическая реконструкция для фрагмента D-петли выполнена в Mega 6.0 с использованием алгоритма максимального правдоподобия (ML) на основе модели Hasegawa-Kishino-Yano (+I) с учетом транзиций и трансверсий независимо от положения нуклеотида [19].
результаты и обсуждение. Согласно модели Tamura-Nei, последовательность D-петли в изученной выборке домашних свиней характеризуется следующим нуклеотидным составом: A=29,10%, T/U=31,05%, C=24,35%, G=15,50%.
В суммарной выборке двух пород выявлено 86 вариабельных сайтов. Большинство мутаций было представлено транзициями (табл. 1). Соотношение транзиций к трансверсиям в выборке согласно теста Hasegawa-Kishino-Yano [19] модель (+I) составило R=3,84. Изменчивость митохондриальных маркеров характеризуется двумя основными параметрами: нуклеотидным разнообразием (п), учитывающим дивергенцию между отдельными особями в популяции на основе различий в нуклеотидных последовательностях сик-венсов, независимо от общего количества гаплотипов, и гаплотипическим разнообразием (h), оценивающим Таблица 2. Показатели молекулярного разнообразия исследованной выборки S. scrofa domestica L.
Группа Показатель
S Pi 1 п 1 h D
Крупная белая 35 0,49 0,011 0,011 -0,013
Ландрас 51 0,069 0,018 0,021 -0,59
Выборка в целом 58 0,85 0,012 0,018 -1,098
S - число вариабельных сайтов в исследуемом фрагменте мтДНК; Pi - среднее число парных различий между гаплотипами; п - нуклеотидное разнообразие (среднее число парных различий Pi, деленное на число сравниваемых пар); h - гаплотипическое разнообразие; D - коэффициент теста нейтральности Tajima
количество и частоту различных гаплотипов выбранного маркера, независимо от различий по количеству отличающихся сайтов. У свиней породы ландрас отмечен более высокий уровень изменчивости, чем у животных крупной белой породы (табл. 2). Среднее значение 1п (разнообразие гаплотипов) составило 0,018±0,0127. В совокупности это может указывать на то, что исследованная выборка первоначально сформирована из особей, объединенных общим происхождением. Высокий уровень нуклеотидного и гаплотипического разнообразия возможно свидетельствует о существо-
рисунок. Филогенетическое взаимоотношение между 26 гаплотипами D-петли свиней: Н1-Н18 - породы крупная белая; Н19-Н26 - породы ландрас.
вании горизонтального потока генов между этой и неродственными ей популяциями, вследствие практикуемого в разведении культурных пород свиней приема «освежения» крови.
Анализ дендограммы, построенной на основании полиморфизма генов D-петли мтДНК (см. рисунок), показал отсутствие четкой кластеризации по породному принципу. Вероятно, это обусловлено обменом генами между разными породами, как на видовом, так и на внутривидовом уровнях. Об этом свидетельствует высокая нуклеотидная и гаплотипическая изменчивость.
выводы. В результате проведенных исследований предложена тест-система, позволяющая получить последовательность фрагмента D-петли мтДНК свиней длиной 770 пар нуклеотидов. Исследование свиней пород крупная белая и ландрас, разводимых в России, показало наличие 26 различных гаплотипов, в том числе 18 - у свиней крупной белой породы и 8 - у свиней породы ландрас. Полученные гаплотипы будут использованы в качестве референтных в исследованиях по реконструкции демографической истории отечественных пород свиней.
Литература.
1. TraspovA., Deng W., Kostyunina O., Ji J., Shatokhin K. Population structure and genome characterization of local pig breeds in Russia, Belorussia, Kazakhstan and Ukraine // Genetics Selection Evolution. 2016. V. 48. Pp. 16.
2. Полиморфизм генов, ассоциированных с локусами количественных признаков, в европейской и азиатской популяциях кабанов, обитающих на территории России/ Н.А. Зиновьева, О.В. Костюнина, А.В. Экономов, М.С. Шевнина, И.А. Домский, Е.А. Гладырь, Г. Брем// Сельскохозяйственная биология. 2013. № 2. C. 77-82.
3. Зиновьева Н.А. Молекулярно-генетические методы и их использование в свиноводстве //Достижения науки и техники АПК. 2008. № 10. C. 34-36.
4. Lynch M. The origins of genome architecture. Sunderland, MA: Sinauer Associates, 2007. Pp. 194.
5. The Origin of the Domestic Pig: Independent Domestication and Subsequent Introgression / E. Giuffra, J. Kijas, V. Amarger, O. Carlborg, J. Jeon, L. Andersson // Genetics. 2000. № 4. Pp. 1785-1791.
6. Grossi S., Lui J., Garcia J., Meirelles F. Genetic diversity in wild(Sus scrofa scrofa) and domestic (Sus scrofa domestica) pigs and their hybrids based on polymorphism of a fragment of the D-loop region in the mitochondrial DNA // Genet. Mol. Res. 2006. № 5. Pp. 564.
7. Alves E., Fernández A., Fernández-Rodríguez A., Pérez-Montarelo D. Identification of mitochondrial markers for genetic traceability of European wild boars and Iberian and Duroc pigs //Animal. 2009. № 3. Pp. 1216-1223.
8. Mitochondrial DNA D-Loop Diversity of Tibetan Pig Populations / J. Ting, Z. Shengguo, W. Chuan, D. Gariba, A. Liping, Yuan C. // PHILIPP AGRIC SCIENTIST. 2009. V. 92. № 4. Pp. 362-369.
9. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / Н.А. Зиновьева, А.Н. Попов, Л.К. Эрнст, Н.С. Марзанов, В.В. Бочкарев, Н.И. Стрекозов, Г. Брем. Дубровицы: ВИЖ, 1998. 47с.
10. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 / K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, S. Kumar // Molecular Biology and Evolution. 2013. № 30. Pp. 2725-2729.
11. Unipro UGENE: an open-source bioinformatics toolkit. URL: http://ugene.unipro.ru (дата обращения: 07.03.2016).
12. Rozas J., Rozas R. Dnasp, Dna Sequence Polymorphism: An Interactive Program For Estimating Population Genetics Parameters From Dna Sequence Data// Comput. Applic. Biosci. 1995. № 11. P. 621-625. URL: http://www. ub.edu/dnasp/(дата обращения: 07.03.2016).
13. Schneider S., Roessli D., Excoffier L. Arlequin version 2.000: a software for population genetics data analysis. User manual, ver 2.000. Geneva: University of Geneva, Genetics and Biometry Lab, Dept. of Anthropology, 2000. 111 p.
14. Evolution of Campylobacter species in New Zealand / N. French, S. Yu, P. Biggs, B. Holland, P. Fearnhead, B. Binney, A. Fox, D. Grove-White, J. Leigh, W. Miller, P. Muellner, P. Carter// Campylobacter Ecology and Evolution. 2014. Pp. 221-240.
15. Bandelt H., Forster P., Rohl A. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies // Molecular Biology and Evolution. 1999. № 16. Pp. 37-48.
16. TCS: Estimating gene genealogies / M. Clement, Q. Snell, P. Walker, D. Posada, K. Crandall//Parallel and Distributed Processing Symposium, International Proceedings. 2002. № 2. Pp. 184.
17. Tajima F. Statistical methods to test for nucleotide mutation hypothesis by DNA polymorphism // Genetics. 1989. № 123. Pp. 585-595.
18. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Molecular Biology and Evolution. 1993. № 10. Pp. 512-526.
19. Hasegawa M., Kishino H., Yano T. Dating the human-ape split by a molecular clock of mitochondrial DNA //Journal of Molecular Evolution. 1985. № 22. Pp. 160-174.
study of d-loop sequence of mtdna of large white and landrace breeds of pigs
BRED IN RuSSIA
N.A. Akopyan, O.V. Kostyunina, N.A. Zinovieva
L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol 'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation
Summary. DNA markers are a convenient tool in studies for reconstruction of origin of domestic animals, in particular pigs. Synthetic origin of domestic pig breeds, confirmed at the molecular level, limits the power of nuclear DNA markers in the study of their demographic history. The analysis of the sequence of the mitochondrial DNA (mtDNA), which is characterized by maternal heritability, is an effective way to reconstruct the historical origin of breeds. The aim of the study was to develop the test system to analyze the sequence of the mtDNA displacement loop (D-loop) and to apply their to create a series of reference mtDNA haplotypes of the Large White and Landrace pig breeds, which are were mainly used in formation of domestic pig gene pool. In total, 50 Large White and 20 Landrace pigs, which were bred in the different breeding farms, were used for analysis. We selected oligonucleotide primers, which were able to amplify 770 bp of D-loop fragment intended for sequencing. Sequence analysis revealed the presence of 26 different haplotypes, including 18 haplotypes in Large White pigs and 8 ones in Landrace. Eighty-six variable sites were detected in total for two breeds. The most mutations were represented as transitions. The ratio of transitions to transversions according Hasegawa-Kishino-Yano test, model (+I), were R = 3.84. The average haplotype variability (h) in the total sample amounted to 0.0213 ± 0.0127. The analysis of dendrogram, which was built on the base of the sequence of mtDNA D-loop fragment, indicated the absence of clear clustering by breed principal. Most probably, it was due to the presence of a common ancestor and the gene exchange between breeds. Thus, we suggested the test system that allows producing the 770 bp fragment of the mtDNA D-loop sequence. Applying the developed test system we created the series of reference haplotypes of Large White and Landrace breeds, which will be used in further research for reconstruction of the demographic history of the indigenous pig breeds. Keywords: Sus scrofa domestica L., D-loop, mitochondrial DNA, polymorphism, genetic diversity.
Author Details: N.A. Akopyan (e-mail: parlenare@gmail.com), post-graduate student, junior research fellow; O.V. Kostjunina, Cand. Sc. (Biol.), head of division; N.A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), member of the RAS, director.
For citation: Akopyan N.A., Kostyunina O.V., Zinovieva N.A. Study of D-Loop Sequence of mtDNA of Large White and Landrace Breeds of Pigs Bred in Russia. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2016. Vol. 30. No 7. Pp. 93-95 (in Russ.).
