CC BY
33
Велегжанинов И.О.1, Шадрин Д.М.1, Пылина Я.И.2, Пыстина А.В.3, Шосталь О.А.1, Белых Е.С.1, Канева А.В.3, Ермакова О.В.4 ©
1К.б.н.; 2аспирант; 4д.б.н., доцент; Институт биологии Коми НЦ Уральского отделения РАН.
3Студент. Сыктывкарский Государственный Университет
ПОИСК МЕХАНИЗМОВ ФОРМИРОВАНИЯ НЕЛИНЕЙНОСТИ КРИВОЙ ДОЗА-ЭФФЕКТ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА НОРМАЛЬНЫЕ ФИБРОБЛАСТЫ ЧЕЛОВЕКА
Аннотация
С помощью количественного ПЦР в реальном времени с этапом обратной транскрипции проанализирован уровень экспрессии 22 хорошо-индуцируемых генов стресс-ответа, через 4 часа после воздействия у-излучения в дозах 1, 3, 5, 9, 12, 15, 2O, 5O, 1OO и 2OO сГр на нормальные фибробласты лёгких человека. Получены новые доказательства качественного характера отличий реакции клеток на воздействие ионизирующего излучения в малых и высоких дозах. Представленные данные помогут объяснить механизмы радиационного гормезиса и гиперрадиочувствительности, изучение которых является одной из основных задач современной радиобиологии.
Ключевые слова: ионизирующее излучение, малые дозы, фибробласты, экспрессия генов. Keywords: ionizing radiation, low doses, fibroblasts, genes expression.
Введение. Несмотря на существенный прогресс в экспериментальной и теоретической биофизике [1-7], эффекты малых доз ионизирующего излучения и токсических агентов на живые системы до сих пор находятся в центре внимания биофизиков, радиобиологов и токсикологов. Актуальность изучения данной проблемы определяется тем, что живые организмы постоянно сталкиваются именно со слабыми стрессовыми воздействиями. Однако стохастичность и слабая выраженность эффектов не позволяют получить понятной законченной картины о закономерностях реакции клеток и организма на воздействие стрессовых факторов низкой интенсивности. Не смотря на это, исследователи не оставляют попыток найти универсальное объяснение возникновения нелинейности на кривых доза-эффект по параметрам повреждения ДНК и риска онкологии в области малых доз [8; 9]. В то же время, имеются данные о специфических изменениях экспрессии генов в ответ на облучение в малых дозах, не проявляющихся при облучении в более высоких [10-12], что свидетельствует в пользу существования качественных отличий реакции клеток на облучение в малых и высоких дозах. Мы поставили перед собой цель получить дополнительные данные, которые помогут разобраться в механизмах формирования нелинейности кривых доза-эффект при воздействии ионизирующего излучения в сверхмалых дозах путём анализа экспрессии генов стресс-ответа, при облучении нормальных фибробластов человека в дозах 1, 3, 5, 9, 12, 15, 20, 50, 100 и 200 сГр.
Результаты и обсуждение. В подавляющем большинстве исследований изменений экспрессии генов в ответ на облучение в малых дозах, анализ производят с помощью гибридизационных микрочипов высокой плотности, позволяющих быстро получить данные о широком профиле экспрессии. Недостатком данного подхода является низкая чувствительность и воспроизводимость, при этом кажется наиболее вероятным, что изменения, происходящие в ответ на слабые воздействия должны быть малыми. В то же время, наиболее чувствительный и надёжный метод анализа экспрессии генов -количественный ПЦР с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) позволяет оценить лишь экспрессию отдельных генов и является достаточно дорогим. В связи с этим, на основе анализа литературы мы выбрали 22 наиболее индуцируемых ионизирующим излучением
© Велегжанинов И.О., Шадрин Д.М., Пылина Я.И., Пыстина А.В., Шосталь О.А., Белых Е.С., Канева А.В., Ермакова О.В., 2013 г.
гена, задействованных в различных системах сресс-ответа клетки, и выполнили эксперимент в 8 независимых биологических повторностях для увеличения чувствительности анализа и достоверности результата.
Таблица 1
Относительная экспрессия генов стресс-ответа в клетках ФЛЭЧ-104 через 4 часа после облучения в дозах от 10 мГр до 2 Гр (значения относительно контроля)
10 мГр 30 мГр 50 мГр 90 мГр 120 мГр 150 мГр 200 мГр 500 мГр 1 Гр 2 Гр
APEX1 0,92±0,13 0,95±0,15 0,95±0,15 0,83±0,11 1,00±0,13 0,90±0,06 0,99±0,09 0,93±0,09 1,00±0,15 0,96±0,13
ЛТГ3 1,57±0,40* 1,13±0,21 1,08±0,21 1,12±0,15 1,08±0,15 1,18±0,12 1,00±0,07 1,53±0,14* 1,76±0,26* 2,13±0,25*
BAX 0,96±0,11 0,89±0,07 0,92±0,08 0,94±0,08 0,96±0,09 0,94±0,08 0,99±0,07 1,00±0,08 1,05±0,15 1,02±0,10
BBC3 1,03±0,24 0,93±0,17 0,94±0,16 0,95±0,27 0,84±0,12 0,93±0,12 1,14±0,23 0,79±0,07 0,82±0,08 1,31±0,16
CCNE1 0,87±0,09 1,00±0,08 1,01±0,10 0,96±0,08 0,95±0,09 0,91±0,06 0,90±0,07 0,95±0,05 0,78±0,13 0,83±0,07
ССШ1 0,82±0,06* 0,88±0,09 0,91±0,07 0,90±0,06 1,02±0,09 0,91±0,07 1,00±0,07 1,05±0,08 0,92±0,15 1,06±0,07
ССМв2 0,87±0,05* 0,98±0,11 1,08±0,12 1,00±0,15 0,86±0,07 0,94±0,10 0,96±0,07 0,97±0,12 0,88±0,16 0,96±0,13
CDKN1A 1,01±0,14 1,13±0,12 1,05±0,14 0,96±0,08 1,10±0,15 1,11±0,11 1,17±0,13 1,36±0,09* 1,53±0,26 2,12±0,18*
c-FOS 1,31±0,22 0,87±0,15 1,00±0,17 0,86±0,11 0,79±0,13 0,94±0,14 0,86±0,16 1,24±0,38 1,29±0,37 1,48±0,20
DDB2 1,08±0,16 0,80±0,13 0,91±0,09 1,00±0,06 1,14±0,11 0,89±0,11 1,04±0,14 1,21±0,08 1,13±0,18 1,38±0,07*
DUSP1 1,30±0,29 1,05±0,16 1,21±0,19 0,96±0,14 1,10±0,13 1,07±0,08 0,96±0,10 1,18±0,16 1,84±0,43 1,58±0,32
EGR1 1,92±1,04 0,91±0,24 0,89±0,17 0,96±0,15 0,98±0,16 1,05±0,22 0,90±0,12 1,03±0,13 1,90±0,88 1,75±0,65
GADD45 A 1,06±0,09 1,11±0,22 1,01±0,13 0,98±0,11 1,06±0,07 1,02±0,12 1,05±0,07 1,16±0,17 1,27±0,13 1,31±0,04*
GSR 1,14±0,13 1,02±0,10 1,06±0,09 0,99±0,08 1,14±0,20 1,00±0,13 1,17±0,18 1,14±0,16 1,04±0,19 1,19±0,25
IER5 1,28±0,23 1,20±0,10 1,07±0,20 0,90±0,06 1,37±0,24 1,09±0,13 1,25±0,22 1,23±0,13 1,36±0,26 1,38±0,19
MDM2 0,95±0,09 0,95±0,13 0,92±0,14 0,99±0,07 1,14±0,11 1,11±0,13 1,10±0,07 1,34±0,14* 1,44±0,23 1,69±0,09*
PBP74 1,11±0,17 1,07±0,10 1,18±0,17 1,20±0,13 1,04±0,09 1,12±0,11 0,95±0,10 1,23±0,06 1,13±0,17 1,01±0,07
PCNA 0,92±0,13 0,90±0,12 0,93±0,16 0,81±0,12 1,00±0,16 0,90±0,11 0,93±0,11 0,94±0,04 0,90±0,18 1,10±0,16
RAD52 1,09±0,23 1,06±0,11 1,07±0,23 1,10±0,15 1,30±0,29 1,03±0,12 1,23±0,22 1,11±0,17 1,03±0,20 1,22±0,20
TNFSF10 1,20±0,18 0,98±0,20 1,48±0,36 0,97±0,16 1,16±0,18 0,89±0,09 1,02±0,15 1,25±0,18 1,13±0,22 1,45±0,26*
ТХЫ 0,37±0,16* 0,48±0,10* 0,74±0,27 0,86±0,25 0,64±0,08* 0,87±0,20 1,04±0,31 1,03±0,27 1,10±0,32 1,09±0,35
XPC 1,05±0,13 1,07±0,12 1,05±0,12 1,01±0,04 1,18±0,11 1,09±0,08 1,16±0,14 1,17±0,08* 1,28±0,16 1,57±0,15*
* - различия с контролем достоверны при р < 0.05 (Критерий Уилкоксона).
В результате проведённых исследований было показано, что количество мРНК генов p21, MDM2, GADD45A, XPC, DDB2 и TNFSF10 статистически значимо изменялось только в ответ на облучение в дозах свыше 0.5 Гр, тогда как экспрессия гена ATF3 возрастала как в ответ на большие дозы, так и после облучения в дозе 1 сГр. Самые интересные изменения экспрессии были обнаружены по генам регуляции клеточного цикла: циклинам 01 (CCNG1) и 02 (CCNG2), а также гену детоксификации свободных радикалов и внутриклеточного сигналинга тиоредоксину (TXN). Количество мРНК этих генов статистически значимо снижалось в ответ на облучение в малых дозах (1 сГр для CCNG1 и CCNG2 и 1, 3 и 12 сГр для TXN) и оставалось неизменным при облучении в более высоких (табл.1).
Таким образом, нами были обнаружены новые доказательства качественных отличий реакции клеток на воздействие малых доз ионизирующего излучения. Кроме того, полученные данные указывают как минимум на 4 гена (CCNG1, CCNG2, TXN, ATF3) которые в дальнейших исследованиях помогут более глубоко понять механизмы специфических эффектов малых доз ионизирующего излучения, таких как гормезис, адаптивный ответ и гиперрадиочувствительность.
Работа частично поддержана молодёжным научным грантом УрО РАН №13-4-НП-180 и грантом президиума РАН «МКБ» № 12П-4-1021.
Литература
1 К.Н. Белослудцев, С.А. Гармаш, Н.В. Белослудцева и др. - Исследование механизмов цитотоксического действия уранилнитрата // Биофизика. - 2012. - Т.57. - №5. - С. 789-795.
2 А.Б. Гапеев, Л.И. Фахранурова, С.И. Паскевич и др. -Уменьшение уровня химически индуцированных повреждений днк в лейкоцитах крови крыс за счет использования стратегии «полезное солнце» // Технологии живых систем. - 2012. - Т. 9. - №6. - С. 16-25.
3 А.И. Мирошников и др. - Образование перекиси водорода в электрохимически активированных растворах и ее биологическая роль // Вода: химия и экология. - 2008. - № 3. - С.31-35.
4 С.В. Гудков и др.- Образование активных форм кислорода в воде под действием видимого и инфракрасного излучений в полосах поглощения молекулярного кислорода // Биофизика. - 2012.
- Т.57. - №1. - С. 5-13.
5 S.V. Gudkov, V.I. Bruskov, A.V. Chernikov et al. - Oxygen-dependent auto-oscillations of water luminescence triggered by the 1264 nm radiation // J. Phys. Chem. B. - 2011. - V.115. - №23. - С. 7693-7698.
6 Н.Р. Асадуллина, С.В. Гудков, В.И. Брусков - Кофеин модифицирует эффекты рентгеновского излучения при воздействии на мышей после облучения, проявляя радиозащитные свойства // Доклады Академии наук. - 2012. - Т.442. - №3. - С. 22-25.
7 Asadullina N.R., Usacheva A.M., Smirnova V.S., Gudkov S.V. - Antioxidative and radiation modulating properties of guanosine-5'- monophosphate // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids.
- 2010. - V.29. - С. 786-799.
8 M. Pollycove, L. E. Feinendegen-Radiationinduced versus endogenous DNA damage: possible effect of inducible protective responses in mitigating endogenous damage // BELLE newsletter - 2003. -V.11. - P.2-22.
9 L.E. Feinendegen - Evidence for beneficial low level radiation effects and radiation hormesis // Br. J. Radiol. - 2005. - V.78. - P.3-7.
10 N. Franco, J. Lamartine, V. Frouin, et al. - Low-dose exposure to gamma rays induces specific gene regulations in normal human keratinocytes // Radiat Res. - 2005. - V.163. - P.623-635.
11 L.H. Ding, M. Shingyoji, F. Chen et al. - Gene expression profiles of normal human fibroblasts after exposure to ionizing radiation: a comparative study of low and high doses // Radiat Res. - 2005. -V.164. - P.17-26.
12 I. Nosel, A. Vaurijoux, J.F. Barquinero, G. Gruel - Characterization of gene expression profiles at low and very low doses of ionizing radiation // DNA Repair (Amst). - 2013. - V.12. - P.508-517.
