CC BY
42
УДК 579.6
ПОИСК ГЕНОВ, ОТВЕСТВЕННЫХ ЗА БИОСИНТЕЗ ТОКСИНОВ ГУАНИДИНОВОГО РЯДА В БАКТЕРИЯХ BACILLUS SP 1839 И PSEUDOALTEROMONAS SP 2138
© 2016 Е.А. Горобец1, Т.Ю. Магарламов2, Д.И. Мельникова1, В.Г. Кузнецов1, А.Е. Власенко1
1 Школа биомедицины Дальневосточного федерального университета, г. Владивосток 2 Национальный научный центр морской биологии ДВО РАН, г. Владивосток
Статья поступила в редакцию 07.11.2016
В работе проведен биоинформационный анализ 32 открытых рамок считывания (ОРС) в плазмиде pNe-1, влияющей на синтез ТТХ в бактерии Aeromonas sp., выделенной из рыбы фугу. Также проведен поиск генов, локализованных в pNe-1, в плазмидной ДНК ТТХ-продуцирующих штаммов Bacillus sp. 1839, Pseudoalteromonas sp. 2138 и в общей бактериальной ДНК из рыбы-фугу Takifugu sp. В плазмиде pNe-1 были выявлены ОРС с высокой степенью консервативности, кодирующие аминокислотные последовательности «hypothetical proteins», вероятно участвующие в синтезе ТТХ и его аналогов. Эти ОРС могут быть рекомендованы для генетических исследований биосинтеза гуаниди-новых токсинов.
Ключевые слова: бактерии-продуценты, гуанидиновые токсины, тетродотоксин, анальгетики, анестетики, нейротоксины, плазмида pNe-1
Интенсивный рост антропогенной нагрузки приводит к увеличению выброса промышленных, сельскохозяйственных, строительных, транспортных и бытовых отходов, загрязняющих окружающую среду. На фоне неблагоприятной экологической обстановки наблюдается устойчивая динамика роста острых респираторных, иммунных и аллергических заболеваний, сердечнососудистых патологий, а также онкологических заболеваний. Одним из симптомов этих болезней является боль. Боль является глобальной проблемой здравоохранения [1]. Было подсчитано, что диагноз «хронический болевой синдром» выявлен у 20% взрослого населения Земли и существенно ухудшает качество их жизни и условия труда. Становится очевидным необходимость в поиске и разработке новых лекарственных агентов анальгетического (анастетического) действия.
Наибольший интерес в поиске новых анестетиков представляют низкомолекулярные ней-ротоксины. Одним из таких токсинов бактериального происхождения являются гуанидиновые токсины - тетродотоксин (ТТХ) и его аналоги.
Горобец Екатерина Алексеевна, лаборант-исследователь лаборатории биомедицинских клеточных технологий. E-mail: gorobets.katrin@gmail.ru Магарламов Тимур Юсифович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории фармакологии. E-mail: biotimur@yandex.ru Мельникова Дарья Игоревна, младший научный сотрудник лаборатории биомедицинских клеточных технологий. E-mail: dashkamelnikova93@gmail.com Кузнецов Василий Геннадиевич, лаборант-исследователь лаборатории биомедицинских клеточных технологий. E-mail: vas9i-kz@mail.ru Власенко Анна Евгеньевна, младший научный сотрудник лаборатории биомедицинских клеточных технологий. E-mail: vlasenko.ae.93@gmail.com
Благодаря своей уникальной структуре ТТХ-подобные токсины блокируют межмембранные токи в возбудимых тканях (мышечных и нервных), не нарушая гомеостаз окружающих тканей. Наиболее перспективным направлением применения ТТХ и его аналогов в терапевтической практике является купирование болей. Эти токсины могут использоваться в качестве анальгетиков общего или местного действия. Так, в Канаде на основе ТТХ и сакситоксина было создано лекарство-прототип для лечения болевого синдрома у больных с тяжелыми формами рака, оказывающее анальгетический эффект в течение 14 дней с момента приема [2]. Использование ТТХ-подобных токсинов в местной анестезии, представляет большой интерес, так как в отличие от других анестетиков, гуанидиновые токсины блокирует рефлекторные сокращения только в возбудимых тканях, не вызывает миокардиаль-ную депрессию, а также не пересекает гематоэн-цефалический барьер, что снижает риск развития судорог или повреждений центральной нервной системы [3]. Также есть попытки введения гуани-диновых токсинов в медицинскую практику в качестве препаратов для снятия абстинентного синдрома у наркотически зависимых пациентов [2].
Использование ТТХ-подобных токсинов в медицинской практике не представляется возможным из-за высокой стоимости производства токсинов. На сегодняшний день единственным сырьем для производства гуанидиновых ткоси-нов является рыба-фугу: из 1 тонны рыбы получают 1 грамм ТТХ. Отсутствие биотехнологического производства ТТХ и его аналогов связно с недостатком знаний о путях его биосинтеза в живых организмах. ТТХ и все его аналоги обладают необычной структурой, что является
результатом сложных биосинтетических реакций. Для расшифровки биосинтетических путей в бактериях все большую популярность приобретают молекулярно-генетические методы, направленные на поиск генных кластеров ответственных за биосинтез токсинов у бактерий.
Впервые ТТХ-подобные токсины были обнаружены в рыбе-фугу, относящейся к семейству Tetraodontidae, а позже и в других организмах, принадлежащих к разным таксономическим группам [4]. Причем в большинстве токсин-содержащих организмов были найдены токсин-продуцирующие бактерии родов: Acinetobacter sp., Aeromonas sp., Bacillus sp., Roseobacter sp., Shewanella sp., Tenacibaculum sp., Vibrio sp. и др [5]. Учитывая, что столь филогенетически удаленные группы бактерий могут производить ТТХ-подобные токсины, можно предположить, что бактерии-продуценты могли освоить один и тот же путь биосинтеза токсина посредством горизонтального переноса генов, как это было показано для сакситоксина [6]. Так, бактерия Aeromonas sp., выделенная из рыбы фугу Takifugu obscurus, способна продуцировать ТТХ и его аналоги, а их продукция прямо зависит от количества копий плазмиды pNe-1 [7]. Данный факт говорит о том, что среди белок-кодирующих последовательностей pNe-1 есть как минимум один ген-регулятор продукции токсинов. Полное сек-венирование последовательности pNE-1 позволило идентифицировать 60 открытых рамок считывания (ОРС), кодирующих белки, причем 36 ОРС кодируют белки с неизвестными функциями [7]. Кроме того, в составе pNE-1 были идентифицированы последовательности мобильных генетических элементов секреторной системы 4 типа, ответственной за конъюгацию плазмид у грамм-положительных бактерий и транспозазы IS426 [4]. Исходя из данного факта, можно предположить, что эта плазмида попала в Aeromonas в результате горизонтального переноса генов [7].
Цель работы: провести биоинформационный анализ 36 ОРС в плазмиде pNe-1 из ТТХ-продуцирующего штамма Aeromonas sp. Проверить наличие генов, локализованных в плазмиде pNe-1, в плазмидной ДНК токсин-продуцирующего штаммов Bacillus sp. 1839, Pseudo-alteromonas sp. 2138 и в общей бактериальной ДНК из рыбы-фугу Takifugu sp..
Методика исследований. Штаммы, продуцирующие ТТХ-подобные токсины, Bacillus sp. 1839 (близкий к B. asahii) и Pseudoalteromonas sp. 2138 (близкий к P. tetraodonis IAM 14160), были взяты из коллекции морских гетеротрофных микроорганизмов ИБМ ДВО РАН им. А.В Жирмунского. Для культивирования бактерий использовали питательную среду Йошимицу-Кимура следующего состава: пептон (5,0 г), дрожжевой экстракт (2,0 г), глюкоза (1 г), К2НРО4 (0,2 г), MgSO4х7H2O (0,1 г), агар (12,0 г), дистиллированная вода (500 мл), и морская вода (500 мл);
рН среды 7,5-7,8. Для выделения ДНК бактерий культивировали в течение 7 сут в 5 мл среды. Для детекции ТТХ бактерий культивировали в 500 мл среды в течение 14 сут Pseudoalteromonas sp. 2138 и 30 сут Bacillus sp. 1839. Бактерий центрифугировали в течение 7 мин, при 4С и скорости 4000g, надосадочную жидкость сливали, а осадок помещали в холодильник на -80оС для последующих экспериментов.
Рыба-фугу Takifugu sp. была выловлена в сентябре 2016 г. в заливе Восток залива Петра Великого Японского моря и помещена в аэрируемый аквариум со стерильной морской водой. Для отбора проб тканей рыба была обездвижена и анестезирована. Были взяты кусочки кожи, печени и желудка размеров 3 мм3. Материал промывали стерильной морской водой и лизировали в 200 мкл раствора Proteinase K в концентрации 10 мг/мл с Ear Buffer (100 mM Tris, 5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 0.2% SDS, pH 8,5) в соотношении 1:9 при температуре 55оС в течение 12 часов. Далее инактивировали Proteinase K в течение 5 мин при 95оС, а затем добавили 1,5 мл TE/RNase buffer следующего состава: 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8,0) и RNase A в концентрации 20мкг/мл. Хранили при -20С для последующего выделения ДНК.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в реакционных объемах 10 мкл, содержащих 1 мкл Taq-полимеразного буфера, 0,2 мкл 2,5 мМ MgCh, 0,8 мкл 2,5 mM дезоксинуклео-тидтрифосфатов, по 0,5 мкл раствора прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров в концентрации 10 пмоль/мкл (табл. 1), 1 мкл тотальной ДНК в концентрации 30 нг/мкл и 1U (единицы активности) в 0,2 мкл Taq-полимеразы. В качестве положительного контроля была составлена реакция с олигонуклеотидными праймерами B3/B4 на рибосомальные кластеры эубактерий. Негативным контролем служила реакция с оли-гонуклеотидными праймерами B3/B4, где матрицей являлась вода.
Термический цикл проводили в C1000 TouchTh Thermocycler (BioRad, США). Амплификация началась со стадии начальной денатурации при 95°С в течение 2 мин для ДНК, выделенной из тканей рыбы фугу, в течение 4 мин для бактериальных штаммов: Bacillus sp. 1839 и Pseudoalteromonas sp. 2138. Затем 33 цикла: денатурация при 95°С в течение 30 с, отжиг пары праймеров B1/B2 при температурах 60,8; 62,3 и 63°С, праймеров В3/В4 при 55°С и при 50, 52,6, 55,1°С для остальных праймеров в течение 30 с; элонгация при 72°С в течение 2 мин. Амплификация завершалась конечным этапом элонгации при 72°С в течение 5 мин. Далее 10 мкл ПЦР продукта смешивали с 4 мкл 6х загрузочного буфера (DNA Gel Loading Dye (6X) - Thermo Fisher Scientific) и разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле в ТАЕ-буфере 40 мин при 100В, затем 10 мин окрашивали бромистым этидием, промывали 3 раза по 7 мин дистиллированной
водой. Визуализацию и документирование гелей производили на системе ChemiDocTMTouch Imag-
Биоинформационный анализ. Анализ нуклеотидной последовательности и ОРС плаз-миды pNe-1, выделенной из ТТХ-продуцирую-щего штамма Aeromonas sp., производили при помощи программы ApE (A plasmid Editor). Поиск гомологичных нуклеотидных последовательностей ОРС в других бактериях и их выравнивание выполнили с использованием программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) и базы данных NCBI (ссылка на интернет ресурс). Дизайн прай-меров составлялся на 10 ОРС, потенциально кодирующих белки с неизвестными функциями, плазмиды pNe-1 с использованием программы OligoCalc (Oligonucleotide Properties Calculator).
Бактериальный осадок, объемом около 2 мл, разбавляли 0,1% водным раствором уксусной кислоты до конечного объема 20 мл. Разрушение клеток проводили на ультразвуковом гомогенизаторе Sonopuls HD 2070 (Bandelin, Германия), в течение 3-х ч, с частотой 20 kHz, амплитудой 212 мкм, рабочим циклом 0,8 с и интервалом 0,2 с. Время обработки ультразвуком для бактерий Bacillus sp. 1839 составило 3 ч, а для Pseudo-alteromonas sp. 2138 - 30 мин. Полученный гомо-генат центрифугировали при 13000g в течение 30 мин, супернатант отбирали и затем упаривали в вакуумном испарителе Centrivap Concentrator 2310905 (Labconco, Germany) при 500С. Получившийся после упаривания осадок растворяли в 2
ing System (BioRad, США).
мл водного раствора 0,1% уксусной кислоты. Раствор затем фильтровали с помощью 3кДа фильтров Microcon Ultarcel YM-3 (Millipore, США). Для удаления белковой фракции раствор нагревали до 85оС в течении 20 мин, затем коагулированные белки осаждали, а супернатант хранили при -80оС для дальнейших исследований.
Детекция и определение концентрации токсинов гуанидинового ряда. Клетки мышиной нейробластомы Neuro-2a (ATCC, CCL131) были взяты из коллекции культур университета Лозанны, Швейцария. Культивация велась в среде Игла в модификации Дюльбекко DMEM (Gibco) содержащей 4,5г/л D-глюкозы; глютамин, пиру-ват и антибиотики - 1000 U/ml пенициллина и 10 mg/ml стрептомицина (Sigma, США), дополненной 10% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота FBS (Sigma, США). Культура клеток содержалась в СО2-инкубаторе при 37oC, 5% CO2 и 80% важности. Пассирование клеток проводилось по достижению 80% конфлюэнтности раз в 2 дня.
Для проведения эксперимента клетки 2-х дневной культуры собирали из культурального флакона с помощью 0,25% раствора трипсина на фосфатном буфере (PBS) pH 7,4 и ресуспендиро-вали в культуральной среде (DMEM + 5% FBS) до плотности 4 х 105 клеток/мл. Посев клеток производили в 96-луночный планшет (Greiner Bio-One, Германия) по 50 мкл суспензии в каждую лунку,
Таблица 1. Праймеры, подобранные на консервативную последовательностьплазмиды pNE-1
Код Нуклеотидная последовательность праймера Участок в ДНК, на которую подобраны олигонуклеотидные праймеры
B1 5'-tctctttcatgctgcggttcagc-3' позиция 2252-2400 в плазмиде р№-1 (праймеры взяты из статьи) -прямой
B2 5'-gacaaggctcgg agacacgca- 3' позиция 2252-2400 в плазмиде р№-1 (праймеры взяты из статьи)- обратный
B3 5'-gccagcagccgcggtaa-3' на рибосомальные кластеры эубактерий - прямой
B4 5'ggactaccagggtatctaat- 3' на рибосомальные кластеры эубактерий - обратный
B7 5 '-gtactttgataattttggaata-3' на гипотетический белок 2 (или на открытую рамку) прямой
B8 5'- aaacatctagaattactact-3' на гипотетический белок 2 (или на открытую рамку) обратный
B9 5 '-aagcttgacctttccctga-3' на гипотетический белок 8 (или на открытую рамку) прямой
B10 5'-gttcatggtacttcaagatg-3' на гипотетический белок 8 (или на открытую рамку) обратный
B11 5'-atcagcatggtgtaataa-3' на гипотетический белок 5 (или на открытую рамку) прямой
B12 5'-gctattcctgttaaagaa-3' на гипотетический белок 5 (или на открытую рамку) обратный
B13 5 '-ggcgctttagctgaaaaat-3' на гипотетический белок 10 (или на открытую рамку) прямой
B14 5 '-aagtgattcggtttattagc-3' на гипотетический белок 10 (или на открытую рамку) обратный
B15 5 '-atcttgcacgctgatattgg-3' на гипотетический белок 24 (или на открытую рамку) прямой
B16 5'-atacttccaccaccatatac-3' на гипотетический белок 24(или на открытую рамку) обратный
B17 5'gaaaaaaatcttaaaaagaaaa-3' на гипотетический белок 28 (или на открытую рамку) прямой
B18 5 '-attcgtctaaaacaaaatta-3' на гипотетический белок 28(или на открытую рамку) обратный
B19 5 '-agaagtatttacattgtttgat-3' на гипотетический белок 30 (или на открытую рамку) прямой
B20 5'-ccaccaatatcctcataaa-3' на гипотетический белок 30 (или на открытую рамку) обратный
B21 5'-tatttaaaagag gatctagag-3' на гипотетический белок 32 (или на открытую рамку) прямой
B22 5'-atttaaatgtgcatatctagtt-3' на гипотетический белок 32 (или на открытую рамку) обратный
B23 5 '-caaaagaaagcaagtttacaagg-3' на гипотетический белок 31 (или на открытую рамку) прямой
B24 5'-tatttgatccgctttataatgatg-3' на гипотетический белок 31(или на открытую рамку) обратный
B25 5'-ttacataggtactaaaaaaag-3' на гипотетический белок 35 (или на открытую рамку) прямой
B26 5'-cataaataatgtgtggatt-3' на гипотетический белок 35 (или на открытую рамку) обратный
итоговое содержание клеток в каждой лунке составляло 2Х104. Клетки преинкубировали 24 ч в СО2-инкубаторе при 37оС и 5% СО2. После 24 ч преинкубации в каждую лунку добавили по 100 мкл тестовых и контрольных растворов и инкубировали 24 ч в СО2-инкубаторе при 37оС и 5% СО2. Для приготовления тестовых растворов использовали среду DMEM с 5% FBS, содержащую различные разведения экстрактов Bacillus sp. 1839, и Pseudoalteromonas sp. 2138, а так же 133цМ вератридина (Sigma, США) в ДМСО и 0,4 мМ водного раствора уабаина (Sigma, США). Оценку жизнеспособности клеток проводили с помощью красителя МТТ (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue) (Sigma, США). Раствор красителя 5мг/мл в PBS pH 7,4 стерилизовали фильтрованием через 0.22 мкм фильтр (Millipore, США) и добавляли по 15 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета. После инкубации в течение 4-х ч при 37оС и 5% СО2, образовавшиеся кристаллы формазана растворили добавлением 150 мкл изопропанола c 0,04М HCl, и перемешивали на шейкере (Biosan PST-60HL4, Латвия) при 37оС и 450 rpm в течение 10 мин. Измерение поглощения растворенного красителя, для каждой лунки, проводили на спектрофотометре ELx800uv (Bio-Tek Instruments Inc., США) при длине волны 595нм с референсной длинной волны 630 нм.
Результаты и их обсуждения. Согласно одной из гипотез, подтвержденной многочисленными исследованиями, первичными продуцентами ТТХ-подобными токсинами в морских экосистемах являются микроорганизмы. В качестве токсин-продуцирующих микроорганизмов были выбраны штаммы бактерий, относящиеся к разным систематическим группам: Firmicutes (штамм Bacillus sp. 1839) и Proteobacteria (штамм Pseudoalteromonas sp. 2138). Способность штамма Bacillus sp. 1839 продуцировать токсин была подтверждена иммуноцитохимическими методами с использованием антител против ТТХ [8]. Для штамма Pseudoalteromonas sp. 2138 способность к
продукции ТТХ не была проверена, но было показано 100% сходство по рРНК со штаммом, продуцирующим ТТХ и его аналоги, Pseudoalteromonas tetraodonis IAM 14160 (не опубликованные данные). Для подтверждения способности продуцировать токсин штаммами Bacillus sp. 1839 и Pseudoalteromonas sp. 2138 был использован метод биотестирования на культуре клеток нейробластомы. Этот метод обладает высокой чувствительностью, определяет весь спектр ТТХ-подобных токсинов (ТТХ, сакситок-син, гуанотоксины I-IV и т.д.) и детектирует не только сам факт наличия токсинов, но и оценивает его концентрацию. Нами показано, что экстракты Bacillus sp. 1839 оказывали сильный токсический эффект на культуру клеток, эквивалентный концентрации чистого ТТХ - 28 нг. Так показатель оптической плотности в контроле в среднем составил 0,451 ОП (рис. 1А). При добавлении к культуре клеток ТТХ в концентрации от 2 нг/мл до 32 нг/мл показатель оптической плотности изменялся в диапазоне от 0,5 до 0,595 ОП. При добавлении к культуре клеток экстракта Bacillus sp. 1839 в разбавлении 1 к 50, оптическая плотность составила 0,585 ОП, что соответствует диапазону показателей оптической плотности для ТТХ в концентрации 16-32 нг/мл. Экстракты Pseudoalteromonas sp. 2138 оказывали токсичный эффект на культуру клеток, эквивалентный 1.8 нг ТТХ. При этом оптическая плотность в контроле в среднем составила 0,578 ОП (рис. 1Б). При добавлении к культуре клеток ТТХ в концентрации от 2 нг/мл до 8 нг/мл показатель оптической плотности изменялся в диапазоне от 0,655 до 0,621 ОП. При добавлении к культуре клеток экстракта Pseudoalteomonas sp. 2138 в разбавлении 1 к 50, оптическая плотность составила 0,615 ОП. Проведенные эксперименты доказывают способность коллекционных штаммов Bacillus sp. 1839 и Pseudoalteromonas sp. 2138 продуцировать ТТХ, а значит и правомочность их использования в качестве модельных объектов для поиска генетических основ биосинтеза ТТХ.
Рис. 1. Концентрация ТТХ-подобных токсинов в экстракте Bacillus sp. 1839 (А)
и Pseudoalteomonas sp. 2138 (Б)
В настоящее время выявлено около 30 родов бактерий из разных систематических групп, способных продуцировать ТТХ и его аналоги. Существует гипотеза, что столь широкое распространение продуцентов токсинов гуанидинового ряда в филогинетически далёких систематических
группах микроорганизмов связано с горизонтальным переносом генов. Известно, что горизонтальный перенос генов в бактериях осуществляется посредством плазмид. Исследователи Джинг и Лю [7] показали зависимость количества ТТХ, синтезируемого бактерией Aeromonas sp, от
числа копий плазмиды pNE-1, т.е. как минимум один ген плазмиды pNE-1, влияет на синтез токсина. Возможно, благодаря горизонтальному переносу генов плазмида pNE-1 присутствует и в других ТТХ-продуцирующих бактериях, в том числе и Bacillus sp. 1839 и Pseudoalteromonas sp. 2138. Предварительные исследования показали, что оба исследуемых штамма Bacillus sp. 1839 и Pseudoalteromonas sp. 2138 содержали плазмид-ную ДНК (не опубликованные данные). На консервативный участок плазмиды pNE-1 были получены олигонуклеотидные праймеры B1/B2 (см. табл. 1). Однако ПЦР анализ не выявил наличие консервативных участков, соответствующих плазмиде pNE-1, в тотальной ДНК Bacillus sp. 1839 и Pseudoalteromonas sp. 2138.
Нами был проведен поиск плазмиды pNE-1 в ассоциативной микрофлоре рыбы-фугу, виды которой являются «богатым поставщиком» ток-син-синтезирующих бактерий [9]. С помощью ПЦР анализа был проведен скрининг микрофлоры из разных органов Takifugu sp. на наличие плазмиды pNE-1. ПЦР анализ не выявил наличие плазмиды pNE-1 в микрофлоре Takifugu sp. Отсутствие плазмиды в исследованных бактериальных образцах может быть связано с мутациями в составе консервативных участков, что сделало невозможным выявление плазмиды pNE-1, при
помощи разработанных олигонуклеотидных праймеров (В1/В2, В7-В26). Для окончательного ответа о распространении плазмиды рЖ-1 среди продуцентов ТТХ и его аналогов необходимо провести полный сиквенс плазмидной ДНК в токсин-продуцирующих бактериях.
Плазмида рЖ-1 содержит 36 ОРС, кодирующих аминокислотные последовательности, которые фигурируют в базах данных как
«белки с неопределенной функцией». Вероятно, один или несколько генов этой плазмиды могут принимать участие в биосинтезе ТТХ-подобных токсинов. При сравнении ОРС из рЖ-1 с бактериальными нуклеотидными последовательностями из баз данных было обнаружено 10 последовательностей, с 60% уровнем гомологии в составе последовательности ДНК и выше, а в составе аминокислотной последовательности -более 90% (табл. 2). Все эти участки ДНК с высокой степенью гомологии были локализованы только в плазмидной ДНК бактерий. Наличие таких консервативных последовательностей в плазмидах разных видов бактерий говорит о важности этих генов в жизнедеятельности клетки. Можно предположить, что один или несколько белков, кодируемых этими консервативными ОРС, могут играть роль в синтезе токсинов гуа-нидинового ряда.
Таблица 2. Гомология ОРС плазмиды pNE-1 с базой данных BLAST
Организм OP C2 OP C5 OP C8 OP C10 OP C24 OP C28 OP C30 OP C31 OP C32 OP C35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Bacillus thuringiensis serovar indiana strain HD521 plasmid pBTHD521-4, complete sequence 66 53 70 58 38 56 57 87 87
Bacillus thuringiensis strain Bc601 plasmid pBTBC5, complete sequence 79 53 70 58 38 56 59 87 87 -
Bacillus thuringiensis strain YWC2-8 plasmid pYWC2-8-3, complete sequence 79 - 70 58 38 56 59 87 87 -
Bacillus thuringiensis strain YC-10 plasmid pYC20, complete sequence 79 - 70 58 38 56 59 87 87
Bacillus thuringiensis serovar morrisoni strain BGSC 4AA1 plasmid pBMB76 79 70 58 38 56 59 87 87
Bacillus thuringiensis serovar kurstaki strain HD 1 plasmid unnamed3 79 70 58 38 56 59 87 87
Bacillus thuringiensis serovar galleriae strain HD-29 plasmid pBMB126 66 70 58 44 56 57 87 87
Bacillus thuringiensis serovar kurstaki str. YBT-1520 plasmid pBMB95 79 70 58 38 56 59 87 34
Bacillus thuringiensis serovar kurstaki str. HD-1 plasmid pBMB95 79 70 58 38 56 59 87 87
Bacillus thuringiensis serovar kurstaki str. YBT-1520 plasmid pBMB94 79 70 58 38 56 59 87 34
Bacillus thuringiensis serovar thuringiensis str. IS5056 plasmid pIS56-107 79 70 58 38 56 59 87 87
Bacillus thuringiensis serovar kurstaki str. HD73 plasmid pHT77 79 70 58 38 56 59 87 87
Bacillus thuringiensis serovar chinensis CT-43 plasmid pCT127 79 63 58 38 56 59 87 87
Bacillus thuringiensis CT43 plasmid pBMB0558 53 44 58 38 59 87 87
Bacillus cereus H3081.97 plasmid pH308197_73 79 63 58 44 56 59 87 87
Bacillus thuringiensis HD1002 plasmid 7 85
Bacillus thuringiensis HD-789 plasmid pBTHD789-6 85
Bacillus thuringiensis strain 4Q2 plasmid pTX14-2 ~ 85
Bacillus thuringiensis serovar israelensis strain AM65-52 plasmid pAM65-52-8-7K 85
Bacillus thuringiensis strain Al Hakam plasmid pBTZ 6 64
Bacillus mycoides strain 219298 plasmid 64
Bacillus thuringiensis strain HS18-1 plasmid pHS18-7 56
Примечание: 1,2,3 - праймеры B1/B2; 4,5,6 - праймеры B7/B8; 7,8,9 - праймеры B9/B10; 10,11,12 - праймеры B11/B12; 13,14,15 - праймеры B13/B14; 16,17,18 - праймеры B15/B16; 19,20,21 - праймеры B17/B18; 22,23,24 -праймеры B19/B20; 25,26,27 - праймеры B21/B22; 28,29,30 - праймеры B23/B24; 31,32,33 - праймеры B25/B26; К - - негативный контроль; К+ - положительный контроль, Ст. - синтетические маркеры молекулярного веса
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ст 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ст 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Ст 28 29 30 31 32 33 К- К+Ст А
III!
I_I_I I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 Cr 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Ст 25 26 27 28 29 30 31 32 33 К- К+ О Б
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ст 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Ст 25 26 27 28 29 30 31 32 33 К- К-Ст
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ст 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Ст 25 26 27 28 29 30 31 32 33 K+ К- Ст Г
B
■
12 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 Or 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Ст 25 26 27 28 29 30 31 32 33 К* К- Ст д"
.11 1 HIT IX.CJXO ТЧ1 1 ri l f jt t ГТ1 « r » 1 j i n > « т
Рис. 2. Электрофорез ПЦР фрагментов ДНК рыбы-фугу Takifugu sp. (А - печень, Б - кожа, В - кишечник), Bacillus sp.1839 (Г) и Pseudoalteromonas sp. 2138 (Д)
В текущей работе был осуществлен ПЦР анализ на предмет наличия 10 консервативных плазмидных ОРС в Bacillus sp. 1839, Pseudo- ' alteromonas sp. 2138 и в общей бактериальной ДНК из рыбы-фугу Takifugu sp. С использованием 2. программы OligoCalc были разработаны олиго-нуклеотидные праймеры, специфичные к наиболее консервативным участкам, исходя из допущения, что данные участки будут консервативны 3. в бактериях рода Bacillus и Pseudoalteromonas (табл. 1, рис. 2). Ни один из подобранных прай-меров не выявил ОРС из плазмиды pNE-1 в ис- ^ следованных образцах тотальной и плазмидной . ДНК бактерий. Отрицательный результат работы, возможно, связан с вырожденностью генетического кода, т.е. наличие в ДНК нуклеотидных за- 5. мен, не влияющих на структуру белка. Продолжением работы станет подбор праймеров с учетом вырожденности кода 10 консервативных ОРС плазмиды pNE-1 и поиск «hypothetical proteins» в Bacillus sp. 1839 и Pseudoalteromonas sp. 2138.
Выводы: из 36 ОРС содержащиеся в плаз-миде pNE-1, 10 обладают высокой степенью кон- 7. сервативности. Эти консервативные ОРС, кодирующие «белки с неустановленной функцией», могут быть рекомендованы в дальнейшем для 8. поиска генетических основ синтеза токсина.
Исследование выполнено при поддержке ДВФУ, проект №14-08-06-19 и и программой фундаментальных научных исследований «Дальний Восток» №15-I-3- 9. 036.
6.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
Nieto, F.R. Tetrodotoxin (TTX) as a therapeutic agent for pain / F.R. Nieto, E.J. Cobos, M.Á Tejada et al. // Mar Drugs. 2012. No10(2). P. 281-305. Lago, J. Tetrodotoxin, an Extremely Potent Marine Neurotoxin: Distribution, Toxicity, Origin and Therapeutical Uses / J. Lago, L. P. Rodríguez, L. Blanco et al. // Mar. Drugs. 2015. No 13. P. 6384-6406. Verde, C.B. Tetrodotoxin-Bupivacaine-Epinephrine Combinations for Prolonged Local Anesthesia / C.B. Berde, U. Athiraman, B. Yahalom et al. // Mar. Drugs. 2011. No 9. P. 2717-2728.
Goessweiner-Mohr, N. Conjugative type IV secretion systems in Gram-positive bacteria / N. Goessweiner-Mohr, K. Arends, W. Keller, E. Grohmann // Plasmid. 2013. V. 70(3). P. 289-302.
Chau, R. Diversity and biosynthetic potential of culturable microbes associated with toxic marine animals / R. Chau, J.A. Kalaitzis, S.A Wood, B.A Neilan // Mar. Drugs. 2013. No 11. P. 2695-2712. Kellmann, R. Identification of a saxitoxinbiosynthesis gene with a history of frequent horizontal gene transfers / R. Kellmann, T.K. Michali, B.A. Nielan // J. Mol. Evol. 2008. V. 67. P. 526-538.
Liu, J. Production level of tetrodotoxin in Aeromonas is associated with the copy number of a plasmid / J. Liu, F. Wei, Y. Lu et al. // Toxicon. 2015. V. 101. P. 27-34. Magarlamov, T.Y. Tetrodotoxin-producing Bacillus sp. from the ribbon worm (Nemertea) Cephalothrix simula (Iwata, 1952) / T.Y. Magarlamov, I. Beleneva, A. Chernyshev, A Kuhlevsky// Toxicon. 2014. V.85. P. 46-51. Chau, R. On the origins and biosynthesis of tetrodotoxin / R. Chau, J.A. Kalaitzis, B.A. Neilan // Aquatic Toxicology. 2011. V. 104. P. 61-72.
SEARCH OF THE GENES RESPONSIBLE FOR BIOSYNTHESIS OF GUANIDINE TOXINS IN BACTERIA OF BACILLUS SP 1839 AND PSEUDOALTEROMONAS SP 2138
© 2016 E.A. Gorobets1, T.Yu. Magarlamov2, D.I. Melnikova1, V.G. Kuznetsov1, A.E. Vlasenko1
1 School of Biomedicine of Far Eastern Federal University, Vladivostok 2 National Scientific Center of Marine Biology FEB RAS, Vladivostok
In the current research the bioinformatic analysis of 32 open reading frames (ORF) in the plasmid pNe-1, involved in TTX synthesis in bacteria Aeromonas sp. isolated from puffer fish, was performed. The search of genes from pNe-1 in plasmid DNA of TTX-producing strains Bacillus sp. 1839, Pseudoalteromonas sp. 2138 and a total bacterial DNA from puffer fish Takifugu sp. was also carried out. ORFs with the high level of conservation were identified. These ORFs encode amino acid sequences identified to «hypothetical proteins», which can be involved in TTX and its analogs synthesis. The obtained results can be recommended for genetic studies of the guanidine toxins biosynthesis.
Key words: bacteria-producers, guanidine toxins, tetrodotoxin, analgesics, anesthetics, neurotoxins, plasmid pNe-1
Ekaterina Gorobets, Laboratory Research Assistant at the Laboratory of Biomedical Cells Technologies. E-mail: gorobets.katrin@gmail.ru; Timur Magarlamov, Candidate of Biology, Senior Research Fellow at the Pharmacology Laboratory. E-mail: biotimur@yandex.ru; Dariya Melnikova, Minor Research Fellow at the Laboratory of Biomedical Cells Technologies. Email: dashkamelnikova93@gmail.com; Vasiliy Kuznetsov, Laboratory Research Assistant at the Laboratory of Biomedical Cells Technologies. E-mail: vas9i-kz@mail.ru; Anna Vlasenko, Minor Research Fellow at the Laboratory of Biomedical Cells Technologies. E-mail: vlasenko.ae.93@gmail.com
