CC BY
35
ГИГИЕНА
УДК 678 : 575. 191
ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ЭФФЕКТОВ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВРЕДНЫХ ФАКТОРОВ НЕФТЕХИМИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ НА ОРГАНИЗМ РАБОЧИХ
О. В. Макарова, Л. К. Каримова, Г. Г. Гимранова, С. X. Чурмантаева, Т. В. Викторова
Институт биохимии и генетики УНЦ РАН (директор — докт. биол. наук, проф. В.А. Вахитов), г. Уфа, Институт медицины труда и экологии человека (директор —докт. мед. наук А.Б. Бакиров), г. Уфа
Возрастающий объем производства в нефтехимической промышленности ароматических углеводородов и их производных ведет к увеличению числа рабочих и служащих, имеющих профессиональный контакт с данными соединениями. Большинство из них, попадая в организм человека, не оказывает прямого биологического воздействия, а вначале подвергается различным превращениям. Доказано, что у человека существует генетический контроль метаболизма поступающих в организм ксенобиотиков, поэтому в зависимости от особенностей генома различные индивидуумы могут сохранять устойчивость или, наоборот, обнаруживать повышенную чувствительность к повреждающим агентам [8].
Биотрансформация ксенобиотиков является многоступенчатым процессом, в котором одновременно или поочередно участвуют многие ферменты деток-сикации. В классическом варианте система защиты организма от ксенобиотиков представлена трехэтапным процессом, включающим активацию (фаза 1), детоксикацию (фаза 2) и выведение (фаза 3). Исследования последних лет показали, что изменение функции системы детоксикации ксенобиотиков повышает восприимчивость организма к вредным воздействиям и, как следствие, к увеличению риска развития некоторых заболеваний [1, 6].
В настоящее время установлена роль ряда полиморфных локусов, участвующих прямо или опосредованно в биотрансформации чужеродных веществ, — генов семейства цитохромов, и прежде всего цитохрома Р-450 (ген CYP1A1),
контролирующих фазу 1, а также гена глутатион Б-трансферазы М1 (СБТМ1), ответственного за нормальное функционирование фазы 2 и нейтрализацию поступающих в организм ксенобиотиков путем связывания с глютатионом [2, 15]. Выявление генетических маркеров повышенной чувствительности рабочих к производственным факторам может использоваться для профотбора в группы предрасположенности к развитию заболеваний.
Целью настоящей работы являлся поиск молекулярно-генетических маркеров индивидуальной чувствительности организма рабочих к вредным химическим веществам в условиях нефтехимических производств.
Обследованы 183 человека, работающих на вредных нефтехимических производствах, в возрасте от 24 до 79 лет (средний возраст — 43,3 года) со стажем от 8 до 41 года. Среди них было 156 мужчин и 27 женщин. В группу контроля вошли 90 здоровых лиц в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст - 40,4 года), подобранных по полу, не имеющих профессионального контакта с вредными химическими соединениями. В воздухе рабочих мест изученных нефтехимических производств присутствует комплекс вредных высокотоксичных соединений: бензол, этилбензол, стирол и др. Метаболический путь превращения этих соединений в организме сопровождается появлением промежуточных высокотоксичных субстратов. Для работающих в этих производствах характерен интер-миттирующий режим воздействия веществ: концентрация их в воздухе рабочей зоны варьирует от 0,5 до 2,0 ПДК в
течение 80% времени. Примерно 15% времени смены рабочие находятся в условиях воздействия концентраций на уровне 3,0-5,0 ПДК и менее 3% -в условиях 6-10 и более ПДК.
Сбор анкетных данных и анализ заболеваемости рабочих проводили путем опроса при изучении их индивидуальных карт. Выделение ДНК осуществляли стандартным методом фенольно-хло-роформной экстракции из лимфоцитов периферической крови [7]. Молекуляр-но-генетический анализ полиморфизма генов CYP1A1 и GSTM1 был проведен методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательности праймеров взяты из работ Oyama et al. и Chen et al. [9, 12]. Для амплификации использовали реакционную смесь следующего состава: 67 мМ трис-HCl, РН 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% TWEEN-20, 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого dNTP, 1 ед. Tag-поли-меразы (Promega), 0,1 мкг геномной ДНК. Анализ проводили в 25 мкл смеси в автоматическом режиме на амплификато-ре "ДНК-Технология". Амплификацию осуществляли по схеме: денатурация (94С - 7 мин), 32 цикла амплификации (94°С - 40 с, 55°С - 40 с, 72°С - 1 мин), элонгация (72С - 7 мин). Для анализа полиморфизма гена CYP1A1 продукты ПЦР подвергали расщеплению специфической эндонуклеазой HincII. Продукты амплификации и расщепления анализировали в 7% полиакриламидном геле с последующей окраской бромидом этидия и визуализацией в проходящем УФ-свете. В гене CYP1A1 тестировали наличие С^А трансверсии в положении 4887 экзона 7 гена CYP1A1, характеризующейся заменой изолейци-на (Ile, аллель I) на валин (Val, аллель V) в кодоне 462 [9]. Гомозигот по делеции гена GSTM1 (генотип GSTM1*0/0) выявляли по отсутствию амплифициро-ванного фрагмента.
Статистическую обработку результатов исследования производили с помощью компьютерных программ "STATISTICA V. 5.5". Разницу в структуре исходных данных определяли по критерию х2 с использованием программ (RSC) [10]. Относительный риск разви-
тия заболеваний (ОИ) при определенной комбинации генотипов рассчитывали по стандартной формуле:
ои=а/ь*а/с,
где а и Ь - число больных, имеющих мутантный генотип и без него, с и й -число людей в контрольной группе с мутантным генотипом и без него [2,10].
Результаты сравнительного анализа частот генотипов и аллелей гена CYP1A1 показали, что как в контрольной группе, так и среди рабочих число гетерозиготных носителей мутантных аллелей (генотип 1/У) примерно совпадает — от 7,4 до 10,4%. Гомозиготных носителей мутантного аллеля ни в контрольной, ни в производственной группах выявлено не было. Не обнаружено различий по распределению частот генотипов гена СУР1А1 между рабочими в зависимости от продолжительности трудового стажа на производстве (%2=0,265; р=0,607). Различия в характере распределения частот аллелей между рабочими и контролем также отсутствуют.
Принимая во внимание разную склонность к заболеваниям среди рабочих, мы посчитали целесообразным провести анализ полиморфизма гена СУР1А1 с учетом сопутствующей патологии. С этой целью в группе рабочих были выделены подгруппы с заболеваниями нервной системы — вегетососу-дистая дистония, люмбалгия, остеохондроз, нейроциркуляторная дистония (п=35), сердечно-сосудистой системы — ИБС, гипертония (п=28), органов дыхания — хронические бронхиты (п=13) и желудочно-кишечного тракта — гастриты, язвенная болезнь, гепатиты (п = 73). У 34 рабочих общесоматических заболеваний не выявлено. Анализ полиморфизма гена СУР1А1 с учетом сопутствующих заболеваний среди обследованных рабочих показал, что у лиц с мутантной формой аллеля (V) возрастает частота болезней органов дыхания (х2 =2,556; р=0,110; ОИ=2,7), желудочно-кишечного тракта (х2= 1,040; р=0,308; ОИ=1,8).
В табл. 1 представлены результаты молекулярно-генетического анализа по-
Таблица 1
Частота генотипов гена С8ТМ1 у рабочих нефтехимических производств в зависимости от стажа работы во вредных условиях труда
Группы Стаж, лет Число обследованных Генотипы X2
С5ТМ1(+) СБТМ! (0/0)
абс. % абс. %
до 10 40 29 72,5 11 27,5 7,042*
Рабочие до 20 54 41 75,9 13 24,1 12,532*
свыше 20 89 62 69,6 27 30,4 9,681*
Всего 183 132 70,1 51 29,9 17,229*
Контроль 90 41 45,6 49 54,4 —
* Различие с контролем достоверно (р< 0,05).
диморфизма гена СБТМ1 в производственной и контрольной группах. Как следует из приведенных данных, у рабочих по сравнению с контролем существенно снижена частота гомозиготных носителей делеции гена СБТМ1 (гентип 0/0 — соответственно 29,9% и 54,4%; х2= 17,229). Полученные результаты свидетельствуют о неслучайном отборе рабочих в случае наличия в генотипе делеции гена СБТМ1. Это можно связать со следующими факторами. Во-первых, одной из причин повышенной встречаемости среди рабочих лиц с нормальными вариантами по гену СБТМ1 может быть предварительный медицинский осмотр, являющийся обязательным условием при поступлении на работу с вредными веществами. Во-вторых, нельзя исключить, что в результате периодических медицинских осмотров происходил отсев носителей делеции по гену СБТМ1. В-третьих, лица, имеющие в генотипе делецию гена СБТМ1, возможно, сами увольнялись из цехов с неблагоприятными условиями труда ввиду повышенной заболеваемости. Анализ частот генотипов гена СБТМ1 в зависимости от продолжительности трудового стажа обследованных не показал существенного снижения частоты гомозигот по делеции гена СБТМ1 среди рабочих со стажем работы более 20 лет по сравнению с рабочими в целом
(х2=0,078; р=0,780).
Поиск генетических маркеров является наиболее информативным, когда в анализ включается исследование комбинаций генотипов по полиморфным системам. Для этого нами была изучена комбинация генотипов по генам
Таблица 2
Спектр и частота сочетаний генотипов по полиморфным локусам СУР1А1 и С8ТМ1 у рабочих нефтехимических производств
Сочетание генотипов Рабочие Контроль ОИ
абс. % абс. %
1/1;+ 114 62,30 32 47,05 1,9
18 9,84 3 4,41 2,4
1/1;0 50 27,32 31 45,59 0,5
1/У;0 1 0,56 2 2,95 0,3
СУР1А1 и СБТМ1 в производственной и контрольной группах (табл. 2). Установлено, что у рабочих с наиболее высокой частотой определялись две комбинации генотипов: 1/1; + , ОИ — 1,9 и 1/У; + , ОИ - 2,4. Наряду с этим генотипы 1/1 ;0 и 1/У;0, характеризующиеся присутствием делеции гена СБТМ1, в 1,9 раз реже встречались у рабочих, чем в контроле.
Для выявления роли генетических факторов в развитии различных патологий у рабочих нами была проанализирована распространенность определенных генотипов среди лиц с наличием в анамнезе заболеваний. Установлено, что при заболеваниях чаще встречается генотип 1/1;0 и показатель ОИ в этом случае возрастает в 2,7 раза. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования изученных полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков в качестве молекулярных маркеров повышенной чувствительности рабочих к вредным факторам нефтехимического производства.
На сегодняшний день в литературе накоплены многочисленные данные об аллельном полиморфизме генов метаболизма ксенобиотиков в разных этнических группах, у больных с мультифакто-
риальной патологией, прежде всего со злокачественными новообразованиями, а также у рабочих, подвергающихся воздействию высоких концентраций вредных соединений органической природы. Разными исследователями установлено, что полиморфизм данных генов играет существенную роль в индивидуальной чувствительности к внешнесредовым мутагенам и в повышении риска развития рака, особенно у курящих [5]. Было показано [14], что у рабочих, экспонированных высокими концентрациями полициклических ароматических углеводородов, имеется ассоциация между определенными аллельными вариантами генов цитохромов и глутатион транс-фераз с уровнем мутагенов, экскрети-рующихся с мочой. В настоящее время широко изучается полиморфизм генов детоксикации ксенобиотиков в производственных группах, контактирующих с органическими соединениями, в частности, с органическими растворителями [1], оксидом этилена [13], трихлор-этаном [3], бензидином [4], бенз(а)пи-реном [11] и т.д. Полученные нами результаты в целом согласуются с данными литературы и свидетельствуют о возможности использования полиморф-ных вариантов генов метаболизма ксенобиотиков в качестве молекулярных маркеров повышенной индивидуальной чувствительности к условиям труда у рабочих нефтехимических производств.
ВЫВОДЫ
1. Наличие мутантной формы гена СУР1А1 у рабочих нефтехимических производств можно рассматривать в качестве фактора повышенного риска развития заболеваний.
2. Среди рабочих изученных нефтехимических производств существенно снижена частота гомозиготных носителей делеции гена СБТМ1, что может быть обусловлено отбором.
3. Выявлены комбинации генотипов по генам СYР1А1 и СБТМ1, ассоциированные с повышенной индивидуальной чувствительностью рабочих к производственным факторам: маркерами повышенной чувствительности являются комбинации генотипов 1/1; 0 и I/V; 0.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фунда-
ментальных исследований (грант №02-04-97905 — "Агидель").
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев M.B. Геном человека и гены "предрасположенности". — СПб, 2000.
2. Беспалова О.Н., Аржанова О.Н., Иващенко Т.Э. и др. // Журн. акуш. и женск. бол. -2001. - № 2. -
С. 1-8.
3. Brunning Th, Lammert M. et al. // Arch. Toxicol. -1997. - Vol.71. -P.596-599.
4. Guofang L., Qingwen М. et al. // Arch. Toxicol. -
2001. -Vol. 75. -P. 138-149.
5. Hatagima A. // Cad.Saude Publica, Rio de Janeiro. - 2002. -Vol.18(2). -P.357-377.
6. Indulski J.,Luts W. // Int. Arch. Occup. Environ. Health. -2000. - № 73. - P. 71-85.
7. Mathew C.C. Methods in molecular biology/
Ed. Walker J.M. —N.-Y. — 1984. -P. 31-34.
8. Nebert D. W., Carvan M. J. Ecogenetics: from biology to health / / Toxicol and Health. -1997. -№13. - P. 163-192.
9. Oyama T, Mitsudomi T. еt al. // Int. Arch. Occup. Environ. Health. -1995. - Vol. 67. - Р. 253-256.
10. Roff D. F, Bentzen P. // Mol. Biol. Evol. -1989. -Vol.6. -P.539-545.
11. Rojas M., Cascorbi I. et al. // Carcinogenesis. -
2000. -Vol. 21. -P.35-41.
12. Seidegard J, Uorachek W.R. et al. // Proc. Natl. Sci. USA. -1988. - Vol. 85. -P. 7293-7297.
13. Their R., Lewalter J. et al. // Arch. Toxicol. -1999. -Vol. 73. -P.197-202.
14. Zang J., Ichiba M. et al. // Occup. Environ. Med. -2001. -Vol. 58. -P.716-721.
15. Zhang J., Ichiba M. et al. // Int. Arch. Occup. Environ. Health. -2000. - Vol. 73. - Р. 127-135.
Поступила 28.02.03.
SEARCH OF GENETIC MARKERS IN PREDICTING EFFECTS OF OIL AND CHEMISTRY INDUSTRY SUBSTANCES OF HAZARD ON ORGANISM OF WORKERS
O.V. Makarova, L.K. Karimova, G.G. Gimranova, S.K. Churmantaeva, T.V. Viktorova
S u m m a r y
Molecular and genetic markers of xenobiotics detoxication genes responsible for individual sensitivity for organism of workers to unhealthy chemical substances in oil and chemistry industry are analyzed. It is established that the presence of mutant form of CYP1A1 gene in workers of oil industry can be considered as the increased risk factor of disease development. The essential reduction of rate of homozygous carriers of GSTM1 gene deletion and combination of genotypes by CYP1A1 and GSTM1 genes associated with increased sensitivity of workers to hazard chemical substances are revealed.
