CC BY
39
© Коллектив авторов, 2006
А.В. Шабалдин', О.А. Глушкова', О. С. Макарченко', Т.А. Симонова2, П.М. Крюков2, А.Н. Глушков', МЛ. Филипенко3, Л.М. Казакова4
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ У ЖЕНЩИН, РОДИВШИХ ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ РАЗВИТИЯ
'Институт экологии человека СО РАН, 2Областной перинатальный центр, г. Кемерово; 3Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск;
4Кемеровская государственная медицинская академия, г. Кемерово, РФ
Целью настоящего исследования являлось изучение полиморфизма генов I (CYP1A1, CYP1A2) и II (GSTT1, GSTM1) фаз биотрансформации ксенобиотиков среди женщин, родивших здоровых детей и детей с врожденными пороками развития плода (ВПРП). Проведенное исследование показало, что маркерами предрасположенности к ВПРП можно считать генотип С/С CYP1A2, сочетание генотипов С/А CYP1A2 с + GSTT1 и С/А CYP1A2 с О/О GSTM1, а маркерами устойчивости к ВПРП являются генотип А/А CYP1A2, сочетания генотипов А/А CYP1A2 с О/О GSTT1 и А/А CYP1A2 с О/О GSTM1. Выявленные маркеры могут быть использованы в качестве дополнительных диагностических критериев ВПРП.
Authors studied genes polymorphysm of I (CYP1A1, CYP1A2) and II (GSTT1, GSTM1) phases of xenobiotics transformation in women born healthy neonates and neonates with congenital malformations (CMF). The study showed that genotype CYP1A2 and combinations of genotypes C/A CYP1A2+ GSTM1 and 0/0 GSTM1 could be estimated as markers of predisposition to CMF forming, but genotype A/A CYP1A2 and such combinations as A/A CYP1A2+ 0/0 GSTT1 and A/A CYP1A2+ 0/0 GSTM1 were the markers of resistance to CMF forming. These markers can be used as additive diagnostic criteria of CMF.
Врожденные пороки развития плода (ВПРП) - самые тяжелые проявления нарушений раннего онтогенеза, которые вносят значимый вклад в детскую смертность и инвалидность [1, 2]. Причины формирования ВПРП разнообразны и включают генетическую несостоятельность, влияние инфекций, неблагоприятные экосистемы, в частности воздействие ксенобиотиков. Последнее особенно актуально для Кемеровской области, где сконцентрированы предприятия угольной, углеперерабатывающей, металлургической и химической промышленности, что приводит к накоплению в окружающей среде мутагенов и тера-тогенов, таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), гетероциклические амины, полихлорированные бифенилы и 2,3,7,8-тетрахлородибензо-^-диоксины [3]. Эти вещества в организме метаболизируются до безвредных соединений под воздействием ферментов детокси-кации, активность которых контролируется генами СУР1А1, СУР1А2, GSTT1, GSTM1 [3]. Процесс детоксикации ксенобиотиков осуществляется сложной системой ферментов и включает две последовательные стадии (фазы). Ферменты I фазы, монооксигеназы СУР1А1 и СУР1А2, окисля-
ют ксено- и эндобиотики, часто с образованием промежуточных генотоксических метаболитов. Ферменты II фазы, трансферазы GSTT1 и GSTM1, - превращают оксиметаболиты в водорастворимые нетоксические производные, которые и выводятся из организма [3]. Для генов, кодирующих эти ферменты, обнаружен полиморфизм, который определяет их низкую и высокую активность [4, 5]. Тем самым предполагается, что тератогенный эффект ксено- и эндобиотиков зависит от комбинации различной активности ферментов I и II фазы метаболизма.
В связи с этим нам представлялось важным изучение полиморфизма генов СУР1А1, СУР1А2, GSTT1, GSTM1 среди женщин, родивших здоровых детей и детей с ВПРП. Такого рода исследования могут выявить генетические маркеры тератогенеза, которые будут использованы для диагностики и прогнозирования ВПРП.
Материалы и методы исследования
В нашем исследовании изучали 2 группы женщин, живущих в Кемеровской области. 1-я опытная группа состояла из 136 беременных женщин, родивших детей с ВПРП. ВПРП были диагностиро-
ваны антенатально в ходе планового мониторинга, проводимого в Областном перинатальном центре г. Кемерово. Обнаруженные посредством УЗИ (аппарат Aloka 500) ВПРП распределились следующим образом: пороки ЦНС - 53 случая, из них анэнцефалия - 10, гидроцефалия - 11, менингомиелоцеле
- 6, синдром Арнольда-Киари II - 8, экзэнцефалия
- 2, spina bifida - 4, гидронефроз П-Ш степени - 6, гастрошизис - 6; кроме того, были пороки мочевы-водящей системы - 11 случаев, сердца - 6 и множественные пороки развития плода - 6. Средний возраст женщин в этой группе составлял 30,0±3,6 года. 2-я контрольная группа состояла из 133 беременных женщин (средний возраст 29,4±2,8 года) с неосложненным акушерским анамнезом и, по крайней мере, одним живым рождением.
При сравнении опытной и контрольной групп по возрасту и частотам встречаемости наследственной отягощенности, хронической экстраге-нитальной и генитальной патологии, воздействию возможных тератогенов достоверных различий не выявлено, что указывает на правомочность сравнения генетических показателей в этих группах.
Тест-системы для молекулярно-генетического анализа полиморфизма CYP1A1, CYP1A2, GSTT1 и GSTM1 разработаны совместно с ИХБФМ СО РАН.
Для проведения генотипирования брали 5-10 мл венозной крови в пробирки с EDTA. Выделение ДНК проводили, используя фенол-хлороформную экстракцию [6], образцы ДНК растворяли в 10 mM Tris/1
EDTA, pH 8,0 и хранили при 4 °С.
Полиморфизм CYP1A1 связан с точковой заменой Т264->С, которую можно детектировать сайт-специфической рестрикцией ферментом Mspl с последующей оценкой полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) [7].
Полиморфизм CYP1A2 возникает в результате точ-ковой замены С734->А, используя фермент Apal в ПДРФ можно обнаружить эту замену [8].
Предварительным этапом перед проведением ПДРФ являлась амплификация специфического района 1-го интрона.
Смесь для амплификации объемом 15 мкл включала 1,5 мкл 10х каждого праймера (CYP1A1 sense 5'-TAGGAGTCTTGTCTCATGCC-3',CYP1A1 antisense 5'-GCACTTAAGCAGTCTGTTTGAG-3', и CYP1A2 sense 5'-TGAGGCTCCTTTCCAGCTCTCA-3'; CYP1A2 antisense 5'-AGAAGCTCTGTGGCCGAGAAGG-3'), 1,5 мкл 10х ПЦР буфера (10мМ трис-HCl, pH 8,3, 1,5мМ MgCb, 50 мМ КИ), 0,2 мМ каждого dNTP и 0,5 ед. Taq-поли-меразы и 1,5 мкл геномной ДНК. ПЦР проводили при следующих температурных условиях: 3 мин - денатурации при 95 °С, за которой следовали 35 циклов амплификации в режиме 95 °С - 30 с, 62 °С - 30 с, 72 °С - 1 мин. ПЦР была терминирована при 72 °С в течение 10 мин, с последующим охлаждением до 4 °С. Амплифи-цированные фрагменты ДНК были смешаны с Mspl (для CYP1A1) или Apal (для CYP1A2). Продукты рестрикции анализировали в 8% ПААГ с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией фрагментов в проходящем УФ-свете (рис. 1).
м.в. С/С Т/Т Т/С м. в. С/А А/А С/С
а б
Рис.1. Электрофореграмма продуктов амплификации СУР1А1 (а) и СУР1А2 (б) в 8% поли-акриламидном геле.
Дорожки обозначены полученными генотипами. М. в. - молекулярный вес ДНК плазмиды рВ1шспр18КП, гидролизованный плазмидой эндонуклеазой рестрикции Мер!.
О 0 + М-в
Рис.2. Электрофореграмма продуктов амплификации GSTT1 (а) и GSTM1 (б) в 1,5%агарозном геле.
Дорожки обозначены полученными генотипами. М.в. - молекулярный вес ДНК плазмиды pBluscriptSKII, гидролизованный плазмидой эндонуклеазой рестрикции Мзр1.
Частоту нулевого аллеля (делеция участка гена) GSTT1 и GSTM1 исследовали методом ПЦР. Смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 2,5 мкл 10х каждого праймера, 2,5 мкл 10х ПЦР буфера (10М трис-HCl, рН 8,3, 1,5мМ MgCl2, 50 мМ КС1), 0,2 мМ каждого dNTP и 0,5 ед. Taq-полимеразы и 5 мкл геномной ДНК. Для амплификации фрагментов генов GSTM1(GSTM1 F GAA CTC CCT GAA AAG СТА AAG С; GSTM1 R GTT GGG СТС ААА ТАТ ACG GTG G) и GSTT1(GSTT1 F TTC CTT ACT GGT CCT САС АТС ТС; GSTT1 R TCA CCG GAT CAT GGC CAG СА) использовали следующие условия ПЦР: после денатурации (95 °С, 3 мин) проводили 15 циклов амплификации в режиме 95 °С - 12 с; 65 °С - 10 с; 72 °С -12 с; далее 20 циклов в режиме 95 °С - 7 с; 62 °С - 7 с; 72 °С - 12 с. ПЦР была терминирована при 72 °С в течение 3 мин, с последующим охлаждением до 4 °С. После амплификации анализировали продукты реакции в 1,5% ага-розном геле с последующей визуализацией в проходящем УФ-свете. Гомозиготы по нормальному аллелю «+» определяли по наличию на электрофореграммах продукта амплификации размером 315 н.п. для GSTT1 и фрагмента 271 н.п. для GSTM1. Отсутствие соответствующего фрагмента указывало на гомозиготность индивидуума по делеции гена [9]. В качестве внутреннего контроля использовали фрагмент гена VEG (700 н.п.) (рис. 2). Статистический анализ был выполнен при помощи MedCalc 6.O. Для выявления различий в распределении генотипов использовали точный метод Фишера. Критический уровень значимости принимали при р < 0,05.
Результаты и их обсуждение
При исследовании полиморфизма CYP1A1 для обследуемых групп была характерна высокая
частота аллеля Т и низкая - С, также высокая частота генотипа Т/Т и низкая - С/С. Различий в частотах встречаемости аллелей и генотипах в контрольной и опытной группах не выявлено (табл. 1). По данным литературы, фермент CYP1A1 вовлечен в активацию основных классов проканцеро-генных веществ, подобно ПАУ и ароматическим аминам, и тем самым может оказывать косвенное влияние на возникновение различной патологии, индуцированной этими соединениями. Носители мутантного аллеля С обладают более высокой активностью фермента, а дикого аллеля Т - низкой [7]. Но исходя из полученных данных, можно утверждать, что прямого влияния этого гена на формирование ВПРП нет, а значит роль детоксика-ции ПАУ этим ферментом не является ключевым звеном патогенеза данной репродуктивной патологии.
В табл. 2 приведены данные о распределении аллелей и генотипов гена CYP1A2. Из табл. 2 видно, что существует два аллеля (С и А), из которых А является мутантным, детерминирующим высокую активность фермента, а С (дикий аллель) -низкую [8]. При сопоставлении частот аллелей и генотипов CYP1A2 в опытной и контрольной группах выявлено следующее. Аллель С достоверно чаще встречался в группе с ВПРП по сравнению с контролем, тогда как А - достоверно реже. Гомозиготность по этим аллелям усиливала (С/С 9,56% в опыте против 3,01% в контроле, р<0,05) или соответственно подавляла (А/А 52,94% в опыте против 69,17% в контроле) вероятность возникновения репродуктивной патологии.
Таблица 1
Частота встречаемости аллелей и генотипов CYP1A1 в контрольной и опытной группах
* Здесь и в табл. 2-5: данные представлены в %.
Исходя из литературных данных можно предположить, что лица с высокой активностью фермента (носители аллеля А) менее подвержены тератогенному влиянию ПАУ, так как эти вещества активно метаболизируются и не накапливаются в организме матери и плода. Тем самым гомозиготный генотип С/С СУР1А2 можно считать маркером предрасположенности к ПАУ-индуци-рованной репродуктивной патологии, а генотип А/А СУР1А2 - маркером устойчивости к ВПРП, индуцированных ПАУ.
Таблица 2
Частота встречаемости аллелей и генотипов CYP1A2 в контрольной и опытной группах
В настоящее время установлено, что ключевую роль во II фазе детоксикации ксенобиотиков играют глутатион-8-трансферазы (GST). Полиморфизм в этих генах связан с протяженной де-лецией (нулевой аллель), приводящей к полному отсутствию белкового продукта. Согласно данным литературы около 50% кавказоидной популяции и 20-30% афро-американской имеют ну-
левой аллель (генотип О/О) гена GSTM1. В основном, у индивидуумов с отсутствием гена уменьшается детоксикация канцерогенов, что вероятно приводит к возникновению рака [10]. По этой же аналогии могут формироваться репродуктивные нарушения. Исследование полиморфизма генов GSTT1 и GSTM1 у женщин, родивших детей с ВПРП, показало, что частота лиц без делеции или с делецией в гетерозиготе гена GSTT1 (+) была достоверно выше в группе ВПРП по сравнению с контролем (табл. 3) - 54,3% против 37,2% (р<0,05). Напротив, частота гомозигот О/О была достоверно выше в контроле по сравнению с опытом (62,8% и 45,7%; р<0,05).
При исследовании полиморфизма GSTM1 достоверных отличий достигнуто не было (табл. 4).
Таблица 3
Частота встречаемости генотипов GSTT1 в контрольной и опытной группах
Генотип Контроль (n = 78) ВПРП (n=81) р RR EF PF
+ 37,2 54,3 <0,05 1,99 0,27 -0,68
0/0 62,8 45,7 <0,05 0,5 -0,45 0,68
Таблица 4
Частота встречаемости генотипов GSTM1 в контрольной и опытной группах
Генотип Контроль (n = 75) ВПРП (n=82) р RR EF PF
+ 42,6 50,0 - - - -
0/0 57,4 50,0 - - - -
Исследование сочетаний генов метаболизма ПАУ I и II фазы при репродуктивной патологии и в контроле показало ряд ассоциаций (табл. 5 и 6). Для группы с ВПРП была характерна высокая частота сочетаний генотипов С/А СУР1А2 и + GSTT1 (RR = 5,99) по сравнению с контролем (23,4% в опыте против 4,1% в контроле), которые могут претендовать на маркеры чувствительности к ВПРП. В то время как сочетание таких генотипов, как А/А СУР1А2 и О/О GSTT1 (табл. 5), было достоверно выше в контроле (21,3% в опыте против 46,9% в контроле), что, вероятно, позволит назвать их маркерами устойчивости к ВПРП.
Интересен тот факт, что при изучении частот встречаемости комбинаций СУР1А2 и GSTM1 получены прямо противоположные данные. Так, маркерными генотипами для ВПРП являлись сочетания С/А СУР1А2 и О/О GSTM (табл. 6) с от-
Аллели Контроль (n = 194) ВПРП (n=164) р<0,05 RR EF PF
С 10,31* 14,63 — — — —
Т 89,69 85,37 — — — —
Генотип Контроль (n = 97) ВПРП (n = 82) — — — —
С/С 2,06 1,22 — — — —
С/Т 16,49 26,83 — — — —
т/т 81,44 71,95 — — — —
Аллели Контроль (n = 226) ВПРП (n=272) р RR EF PF
С 16,92 28,31 <0,05 1,93 0,14 0,56
А 83,08 71,69 <0,05 0,52 -0,67 0,56
Генотип Контроль (n = 133) ВПРП (n = 136) <0,05 — — —
С/С 3,01 9,56 <0,05 З,15 0,07 0,73
С/А 27,82 37,50 <0,05 — — —
А/А 69,17 52,94 <0,05 0,44 -0,64 0,79
Таблица 5
Частота комбинаций генотипов CYPA2 и GSTT1 в контрольной и опытной группах
CYP1A2 GSTT1 Контроль (n = 49) ВПРП (n=47) р RR EF PF
С/С + 0,0 4,3 — — — —
С/С 0/0 0,0 0,0 — — — —
С/А + 4,1 23,4 <0,05 5,99 0,19 -1,03
С/А 0/0 6,1 17,0 — — — —
А/А + 42,9 34,0 — — — —
А/А 0/0 46,9 21,3 <0,05 0,31 -0,46 1,48
Таблица 6
Частота комбинаций генотипов CYP1А2 и GSTM1 в контрольной и опытной группах
CYP1A2 GSTM1 Контроль (n = 5) ВПРП (n=46) р RR EF PF
С/С + 4,0 4,3 — — — —
С/С 0/0 6,0 0,0 — — — —
С/А + 6,0 10,9 — — — —
С/А 0/0 6,0 30,4 <0,05 6,05 0,25 -1,12
А/А + 36,0 34,8 — — — —
А/А 0/0 42,0 19,6 <0,05 0,35 -0,37 1,37
носительным фактором риска 6,05 (30,4% в опыте против 6% в контроле) .
Заключение
Таким образом, проведенное исследование показало, что маркерами предрасположенности к ВПРП можно считать генотип С/С СУР1А2, сочетание генотипов С/А СУР1А2 и + GSTT1,
а также С/А CYP1A2 и 0/0 GSTM1, в то время как маркерами устойчивости к ВПРП являются генотип А/А CYP1A2 и сочетания генотипов А/А CYP1A2 и 0/0 GSTT1 и А/А CYP1A2 и 0/0 GSTM1. Выявленные маркеры могут быть использованы в качестве дополнительных диагностических критериев ВПРП.
ЛИТЕРАТУРА
1. Здоровье населения и окружающая среда города Кемерово. - Кемерово, 2001.
2. Глебова Л А., Шабалдин А.В., Браиловский В.В. и др. // Педиатрия. - 2004. - №6. - С. 85-87.
3. Гуляева Л.Ф, Вавилин ВА., Ляхович В.В. // ГПНТБ СО РАН, Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН.- Новосибирск, 2000.- 85 с.
4. Cristoph S., Jurgen Brockmoller, Steffen Bauer S.B. // J. Clin. Pharmacol. - 1999. - Vol. 47. - P. 445-449.
5. Catteau A., Bechtel Y.C., Poisson N., Bechtel P.R. // Eur. J. Clin. Pharmacol. - 1995. -Vol. 5.- P. 423-430.
6. Sambrook J., Fritsch E, Maniatis T. //Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. Cold Spring Harbor, 1989.
7. Le Marchand L., Sivaraman L, Pierce L. et al. // Cancer Res. - 1998. - Vol. 21. - P. 4858-4863.
8. Cristiansen L., Bygum A., Jensen A. // Hum. Genet. - 2000. - Vol. 107. - P. 612-614.
9. Mahadevan M. S., Shriver M. S, Foitzik M. A. et al. // Genomics.-1993.-Vol.15.- P. 446-448.
10. Ford J., Li Y., O Sullivan M. et al. // Carcinogenesis.-2000.-Vol. 11. - P. 1971-1975.
