CC BY
1
- 2019. - 35. - P.535-556.
6. Kreuder A. J. Comparison of turbidometric immunoassay, refractometry, and gamma-glutamyl transferasa to radial immunodiffusion for assessment of transfer of passive immunity in high-risk beef calves / A. J. Kreuder, R. M. Breuer, C. Wiley [et al.] // J.Vet.IntMed. -2023.37(6).1923-1993.
7. Lombard J. Consensus recommendations on calf- and herd-level passive immunity in dairy calves in the United States / J. Lombard, N. Urie, F. Garry, S. Godden [et al.] // J.Dairy Sci. -2020.103.8.7611-7624.
8. Mancini G. Immunochemical quantitation of
antigens by single radial immunodiffusion / G. Mancini, O. Carbonara and J. F. Heremans // Im-munochem. - 1965.2. - P. 235-254.
9. Mugnier A. A parallel evaluation of 5 indirect cost-effective methods for assessing failure of passive immunity transfer in neonatal calves / A. Mugnier, K. Pecceu, F. Schelcher [et al.] // JDS Communication. - 2020(1).10-14.
10. Roadknigpt N. Prevalence of failure of passive immunity transfer in Australian non-replacement dairy calves / N. Roadknigpt, E. C. Jongman, P. Mansell, N. Cortman // Aust.Vet.J.-2022.100(7).292-295.
БОГ: 10.48612^Ьогтк-2024-1-59 УДК 578.5/.8:636.4.082
ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ПЕСТИВИРУСОВ СВИНЕЙ
Хаммадов Наиль Ильдарович1, канд. биол. наук Горбунова Мария Евгеньевна1, канд. биол. наук Шангараев Рафкат Искандерович1, канд. вет. наук Фахрутдинов Наиль Анисович1 Галеева Антонина Глебовна1, канд. вет. наук Хамидуллина Алина Ильфатовна2
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань, Российская Федерация
2ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», г. Казань, Российская Федерация
В статье представлены различные подходы к анализу генома пестивирусов свиней с целью дизайна специфических олигонуклеотидных затравок для индикации максимально большего количества штаммов и изолятов вируса классической чумы свиней, применяемых при амплификации кДНК искомого вируса с визуализацией результата реакции по технологии ТадМап. В ходе биоинформационного анализа было применено несколько подходов к первичному анализу потенциальных генетических маркеров. Вначале нами был выбран более классический подход, в котором короткие нуклеотидные последовательности (100-1000 пар оснований) подвергали БЬД8Т-анализу, и в рамках последовательностей со 100 % гомологией только к искомому вирусу выполняли предварительный дизайн олигонуклеотидный затравок для амплификации анализируемого генетического маркера. Однако для достижения желаемого результата начало анализа пришлось вести с множественного выравнивания искомых и гетерогенных нуклеотидных последовательностей.
Ключевые слова: пестивирусы; классическая чума свиней; биоинформатика; генетический маркер
SEARCH FOR GENETIC MARKERS FOR INDICATION OF SWINE PESTIVIRUSES
^ammadov Nail Ildarovich1, PhD Biol. Sci. Gorbunova Maria Evgenievna1, PhD Biol. Sci. Shangaraev Rafkat Iskanderovich1, PhD Vet. Sci.
Fakhrutdinov Nail Anisovich1 Galeeva Antonina Glebovna1, PhD Vet. Sci. Khamidullina Alina Ilfatovna2
1Federal Center for ToxicologicalRadiation and Biological Safety, Kazan, Russian Federation 2Kazan State Academy of Veterinary Medicine, Kazan, Russian Federation
The article presents various approaches to the genome analysis of swine pestiviruses, with the aim of designing specific oligonucleotide primers to indicate the largest possible strains and isolates of the classical swine fever virus, used in amplification of the cDNA of the desired virus with visualization of the reaction result using TaqMan technology. During the bioinformatics analysis, several approaches were used for the primary analysis of potential genetic markers. At the beginning, we chose classical approach, in which short nucleotide sequences (100-1000 base pairs) were subjected to BLAST analysis, and within sequences with 100% homology only to the desired virus, a preliminary design of oli-gonucleotide primers was performed to amplify the analyzed genetic marker. However, to achieve the desired result, the analysis had to begin with multiple alignment of the desired and heterogeneous nu-cleotide sequences.
Key words: pestiviruses; classical swine fever; bioinformatics; genetic marker
Классическая чума свиней является заболеванием, представляющим экономическую угрозу, мониторинг по которой в нашей стране ведётся на постоянной основе. По данным Россельхознадзора в 2022 году заболевание классической чумой свиней в нашей стране не регистрировалось, поголовью животных проводят профилактическую вакцинацию, так в 2022 году вакцинации подвергли 91 млн. 679 тысяч 227 голов свиней, среди которых есть несколько диких особей. Кроме того, по данному заболеванию проводятся регулярные диагностические исследования. Так, в том же году более 78 тысяч свиней было исследовано, в том числе методом ПЦР 9955 голов и ИФА 28721 животное. Последним годом регистрации заболевания является 2021 год, классическая чума свиней в тот год была выявлена в Приморском крае нашей страны.
Для эффективной, достоверной прижизненной диагностики и качественного мониторинга всего поголовья животноводческого хозяйства оптимально подходят методики, основанные на генетических исследованиях, а именно применение полимеразной цепной реакции. Данная работа является частью более обширного исследования, цель которого направлена на выявление генетического материала вирусов болезни Ауески и классической чумы свиней в мультиплексном формате.
Научные исследования, посвящённые вирусу классической чумы свиней актуальны не одно десятилетие [2-5, 10], однако вопрос характеристики генетического полиморфизма внутри различных штаммов вируса и его
гомологии с пестивирусами других видов животных актуальны и на сегодняшний день. Классическая чума свиней не представляет опасности для жизни и здоровья человека, как возбудители бешенства [6], бруцеллёза [7] и других особо опасных заболеваний, но данное заболевание приобрело особую актуальность вследствие причинения значительного экономического ущерба свиноводству в случае возникновения эпизоотии [2].
Ключевым вопросом создания эффективного инструмента для специфичного выявления нуклеиновых кислот вируса классической чумы свиней является определение участков генома вируса, размером от 20 до 50 нуклеотидов, находящихся друг от друга на расстоянии от 5 до 50 нуклеотидов, характеризующихся при этом максимальной гомологией для искомого вируса, и максимальным показателем генетического полиморфизма с представителями гетерологичных биологических видов. Указанные характеристики нуклеотидных последовательностей удаётся выявить в результате детальной работы с генетическим материалом целевых организмов по средствам биоинформационного анализа.
Методика исследований. Объектом исследования являлись нуклеотидные последовательности различных штаммов и изолятов вируса классической чумы свиней и вирусной диареи крупного рогатого скота (как объект с максимальной гомологией нуклеотидной последовательности с целевым вирусом.
Поиск нуклеотидных последовательностей целевых и гетерологичных нуклеотид-ных последовательностей осуществляли в
разделе «nucleotide» на сайте национального центра биотехнологической информации (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) по средствам поисковых запросов. В ходе поиска определяли приемлемые для дизайна олигонуклео-тидных затравок последовательности (нук-леотидные последовательности размером 100-1000 пар оснований) которые подвергали BLAST-анализу, и в рамках последовательностей со 100% гомологией только к искомому вирусу выполняли предварительный дизайн олигонуклеотидный затравок для амплификации анализируемого генетического маркера. Полученные (предварительные) олиго-нуклеотидные затравки так же подвергали BLAST-анализу.
Множественное выравнивание полногеномных нуклеиновых последовательностей (только целевого вируса и максимально гомологичного вируса) выполняли в программном алгоритме AlignX, входящего в состав программы VectorNTI 9.1.
Дизайн олигонуклеотидный затравок осуществляли вручную, аналогично ранее выполненным исследованиям [1, 8, 9], в программе VectorNTI 9.1, на основании данных о степени полиморфизма полногеномных нук-леотидных последовательностей единичных нуклеотидных заменах в области гибридизации нуклеотидных последовательностей-кандидатов, BLAST-анализа и свойств анализируемой нуклеотидной последовательности.
Результаты исследований и их обсуждение. В ходе биоинформационного анализа было применено несколько подходов к первичному анализу потенциальных генетических маркеров. В начале нами был выбран более классический подход, в котором короткие нуклеотидные последовательности которые подвергали BLAST-анализу, и в рамках последовательностей со 100 % гомологией только к искомому вирусу выполняли предварительный дизайн олигонуклеотид-ный затравок, однако данный подход в нашем случае оказался несостоятельным - при анализе гомологии анализируемого генетического маркера в местах гибридизации праймеров и зондов для ПЦР с вирусами имеющими максимальную гомологию с возбудителем классической чумы свиней (пестивирусы других животных) каждый раз регистрировалась значительная гомология нуклеотидной последовательности целевого и гетерологично-го вирусов. Так, из первично анализируемых
локусов были выбраны следующие последовательности, идентификационные номера которых в банке генов были следующие: EF026758 (Classical swine fever virus Erns glycoprotein mRNA, partial cds); MZ869067 (Classical swine fever virus isolate NM2016-0323 5' UTR); 0Q150770 (Classical swine fever virus isolate NM2016-0323 5' UTR); EF026757 (Classical swine fever virus NS5B mRNA, partial cds); SEG HCVVPG (Classical swine fever virus polyprotein gene, partial cds); 0Q150763 (Classical swine fever virus isolate NM2016-0333 3' UTR); EF026755 (Classical swine fever virus polyprotein mRNA, 5' UTR and partial cds); EF421710 (Classical swine fever virus strain 241LN84 gp55 (E2) gene, partial cds); EF421699 (Classical swine fever virus strain 295SX00 gp55 (E2) gene, partial cds); EF421680 (Classical swine fever virus strain 7712Rd-GX98 gp55 (E2) gene, partial cds). Так как работа с короткими фрагментами генетической последовательности целевого вируса не принесла ожидаемого результата было принято решение применить иной аналитический подход.
Благодаря относительно небольшому размеру всего генома вируса (чуть больше 12000 нуклеотидов) у нас появилась возможность использовать в работе подход, в котором сравнению подвергается множественное выравнивание целевого вируса и множественное выравнивание гетерологичных вирусов для выявления консервативных участков генома только для целевого вируса. Так для построения основного множественного выравнивания нами было использовано 5 полногеномных последовательностей вируса классической чумы свиней (идентификационные номера которых в банке генов были следующие: KT119352; KP233071; AY259122; AY775178 и NC 002657) штаммов Riems, Shimen HVRI, JSZL и других. Так же было выполнено и другое выравнивание, для построения которого применили 12 полногеномных последовательностей вирусной диареи крупного рогатого скота и одну последовательность вируса классической чумы свиней. Нук-леотидные последовательности вирусной диареи в нашем случае использовались как наиболее гомологичная нуклеотидная последовательность гетерогенного вируса.
Анализируя множественное выравнивание полногеномных последовательностей вируса классической чумы свиней, удалось идентифицировать 5 локусов с минимальным
полиморфизмом нуклеотидов, в области которых возможен дизайн олигонуклеотидных затравок, обозначение локализации анализируемых нуклеотидов будет указано относительно штамма Shimen КУИ классической чумы свиней. BLAST-анализ этих локусов указал на высокий потенциал для дальнейшей работы только у трёх локусов из пяти, среди основных гомологий наиболее часто встречались пестивирусы различных животных, особенно мелкого рогатого скота. Перспективные локусы были локализованы в области от 70 до 206 нуклеотида, от 6312 до 6457 нук-леотида и от 12193 до 12303 нуклеотида.
Дальнейшая работа была направлена на определение точечной гомологии и полиморфизма нуклеотидов у целевого вируса и наиболее близкого (в отношении идентичности нуклеотидной последовательности) вируса диареи крупного рогатого скота. Так, после дизайна зонда, прямого и обратного прайме-ров на каждый из трёх локусов, с учётом минимальной гомологии среди нуклеотидов в выравнивании полногеномных последовательностей вирусов диареи крупного рогатого скота, было установлено что локус локализованный в позиции от 6312 до 6457 нуклео-тида характеризовался минимальным полиморфизмом в отношении к анализируемым гетерогенным вирусам (уникальных для вируса классической чумы свиней нуклеотидов в предполагаемых олигонуклеотидных затравках менее 10 %). BLAST-анализ олигонук-леотидных затравок на оставшиеся два локу-са показал максимальную гомология только для вирусов классической чумы свиней. Детальное сопоставление с нуклеотидными последовательностями в выравнивании полногеномных последовательностей вирусов диареи крупного рогатого скота указало на полиморфизм от 10 до 30 процентов в каждой анализируемой нуклеотидной затравке, что оценивается нами как показатель, позволяющий в реальной амплификации дифференцировать эти два вируса путём специфичной ОТ-ПЦР в режиме реального времени лишь нуклеиновых кислот вируса классической чумы свиней. Дизайн олигонуклеотидных затравок предполагает отжиг праймеров при температуре 60 °С, что будет учтено при конструировании олигонуклеотидов для индикации вируса болезни Ауески и олигонуклеотидов для внутреннего контроля амплификации, в целях применения всех разработанных олиго-
нуклеотидных затравок в мультиплексной ПЦР, с разделением результатов анализа по виду флуоресцентного зонда, согласно технологии TaqMan.
Выводы. Применив различные подходы биоинформационного анализа, удалось определить два наиболее подходящий для специфической амплификации генетического материала вируса классической чумы свиней локуса, которые локализованы в начале и в конце генома целевого вируса. В рамках целевого локуса был выполнен дизайн прямых и обратных праймеров, а также TaqMan зондов, предполагая возможность дальнейшей разработки мультиплексной ПЦР для выявления нуклеиновых кислот вируса болезни Ауески, с внутренним контролем амплификации.
Список литературы
1. Генетические маркеры возбудителей особо опасных заболеваний, характеризующихся природной очаговостью / Н. И. Хамма-дов, К. А. Осянин, Т. Х. Фаизов [и др.] // Ветеринарный врач. - 2020. - № 1. - С. 67-73.
2. Ликвидация классической чумы свиней с помощью гипервакцинации / В. А. Сергеев, Н. А. Яременко, В. М. Авилов [и др.] // Ветеринария. - 2012. - № 2. - С. 3-9.
3. Насыров Ш. М. Особенности переработки мясных продуктов при классической чуме свиней / Ш. М. Насыров, Г. С. Арутюнян, Г. М. Яруллина // Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства. -2019. - № 21. - С. 431-434.
4. Патент № 2801949 C1 Российская Федерация, МПК A61K 39/187, C12N 7/00. Штамм "СК" вируса классической чумы свиней Pestivirus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики классической чумы свиней : № 2023106078 : заявл. 14.03.2023 : опубл. 21.08.2023 / Д. А. Бирючен-ков, Е. П. Баборенко, В. А. Евграфова, А. А. Фро-ловцева ; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных».
5. Патент № 2806252 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ диагностики классической чумы свиней с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) : № 2023102441 : заявл. 03.02.2023 : опубл. 30.10.2023 / В. В. Стаффорд, А. К. Комина, Я. Б. Стрельцова [и др.] ; заявитель Федеральное государственное бюджетное научное учре-
ждение «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К. И. Скрябина и Я. Р. Коваленко Российской академии наук».
6. Ретроспективная оценка эпизоотолого-эпидемиологической характеристики бешенства в Республике Татарстан в 2010-2020 гг / Р. М. Ахмадеев, А. Г. Галеева, И. И. Самерханов [и др.] // Ветеринарный врач. - 2023. - № 4. -С. 27-32.
7. Салмаков К. М. Совершенствование системы специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота с применением вакцины из штамма B. abortus 82 и препарата из штамма B. abortus R-1096 / К. М. Салмаков, М. А. Косарев // Ветеринария. - 2023. - № 8. -
С. 9-13.
8. Хаммадов Н. И. Подбор генетических маркеров для выявления ДНК патогенных боррелий / Н. И. Хаммадов, А. И. Хамидуллина // Проблемы особо опасных инфекций. -2022. - № 2. - С. 134-141.
9. Хаммадов Н. И. Поиск генетических маркеров вируса клещевого энцефалита для его специфичной индикации / Н. И. Хаммадов // Проблемы особо опасных инфекций. - 2020. -№ 2. - С. 122-128.
10. Юсупов Р. Разработка диагностических средств для оценки эффективности иммунопрофилактики классической чумы свиней / Р. Юсупов, Ш. М. Насыров, Г. Р. Юсупова // Ветеринарный врач. - 2011. - № 2. - С. 17-19.
DOI: 10.48612/sbornik-2024-1-60 УДК 618.1:619:636.22/.28
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ СРЕДСТВ ДЛЯ САНАЦИИ ПОЛОСТИ МАТКИ
ПРИ ЭНДОМЕТРИТЕ У КОРОВ
Чекрышева Виктория Владимировна, канд. вет. наук, доцент
Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный Ростовский аграрный научный центр», г. Новочеркасск, Российская Федерация
В данной статье проводится сравнительный анализ терапевтической эффективности средств для санации полости матки у коров при послеродовом эндометрите. Сравнению подлежали два препарата: 0,1 %-ный раствор диоксидина и 0,02 %-ный водный раствор фурацил-лина. Исходя из проведенных нами исследований, мы пришли к выводу, что при терапии послеродового эндометрита у коров важную роль играет санация полости матки 0,1 %-ным раствором диоксидина в сочетании с использованием не только антибактериального средства «Амоксициллин 150», а также препаратов, стимулирующих сократительную способность мио-метрия, таких как «Утеротон». И витаминных препаратов, повышающих естественную резистентность организма и восполняющих витаминную недостаточность в организме животного во время болезни, таких как «Нитамин». Такое сочетание лекарственных средств обеспечивает 100 % терапевтическую эффективность в течение пяти дней лечения.
Ключевые слова: воспаление; эндометрит; корова; эндометрий; санация; полость матки
COMPARATIVE EFFECTIVENESS OF DRUGS FOR SANITATION OF THE UTERINE CAVITY
IN COWS WITH ENDOMETRITIS
Chekrysheva Victoria Vladimirovna, PhD Vet. Sci., Associate Professor
North Caucasus Zonal Research Veterinary Institute - branch of the Federal State Budgetary Scientific Institution "Federal Rostov Agrarian Research Centere", Novocherkassk, Russian Federation
This article provides a comparative analysis of the therapeutic effectiveness of means for sanita-
