ПОДБОР ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАТОГЕННЫХ БОРРЕЛИЙ

Хаммадов Н.И.; Хамидуллина А.И.

DOI: 10.21055/0370-1069-2022-2-134-141

УДК 579.834.114:579.25

н.и. хаммадов1, А.и. хамидуллина2

подбор генетических маркеров для выявления днк патогенных боррелий

'ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Российская Федерация;

2ФГБОУВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», Казань, Российская Федерация

цель исследования - анализ генетических маркеров возбудителей болезни Лайма, которые можно использовать для специфичной индикации их максимально большего числа штаммов и изолятов. материалы и методы. Нуклеотидные последовательности различных генов Borrelia garinii, B. afzelii, B. burgdorferi загружены из базы данных NCBI (Национального центра биологической информатизации). Определение встречаемости анализируемых нуклеотидных последовательностей в генетическом коде различных организмов определяли в программной утилите nBLAST. Для дизайна праймеров и зондов использовали программу Vector NTI 9.1.0 (Invitrogen Corporation, Карлсбад, США). ДНК выделяли, используя набор реагентов «МАгНО-сорб» вариант 100-200 («АмплиСенс», Москва, Россия), согласно инструкции производителя. Праймеры и зонды синтезировали в ЗАО «Евроген» (Москва, Россия). Для проведения ПЦР использовались реактивы производства ЗАО «Синтол» (Москва, Россия). результаты и обсуждение. Для достоверной индикации патогенных боррелий методами молекулярно-генетического анализа определены специфичные локусы (гены) различных видов возбудителей: B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi, - которые отличались от генетических кодов других представителей рода Borrelia и от ДНК иных организмов. В результате предварительного определения аналитической значимости исследуемых локусов для дальнейшей работы выбраны следующие гены и локусы: pepX, clpA, ospA,p83/100, ospC и flaB, - из которых для практической индикации ДНК патогенных боррелий выбраны геныflaB и ospA. Индикация генетических маркеров B. burgdorferi и B. afzelii происходит при амплификации генаflaB, а B. garinii и B. afzelii -при использовании в качестве генетического маркера гена ospA.

Ключевые слова: боррелии, специфичность, полиморфизм генов, ПЦР.

Корреспондирующий автор: Хаммадов Наиль Ильдарович, e-mail: [email protected].

Для цитирования: Хаммадов Н.И., Хамидуллина А.И. Подбор генетических маркеров для выявления ДНК патогенных боррелий. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 2:134-141. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-2-134-141

N.I. Khammadov1, A.I. Khamidullina2

Genetic Markers for Detecting the DNA of Pathogenic Borrelia

'Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russian Federation; 2Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after N.E. Bauman, Kazan, Russian Federation

Abstract. The aim of the study was to analyze the genetic markers of Lyme disease pathogens, which can be used to specifically indicate maximum number of their strains and isolates. Materials and methods. The nucleotide sequences of various genes of Borrelia garinii, B. afzelii, B. burgdorferi were downloaded from the NCBI database (National Center for Biological Informatization). The occurrence of the analyzed nucleotide sequences in the genetic code of various organisms was determined in the nBLAST software utility. For the design of primers and probes, the Vector NTI 9.1.0 program ("Invitrogen Corporation", Carlsbad, USA) was used. DNA was isolated using the MAGNO-sorb kit, version 100-200 ("AmpliSens", Moscow, Russia), according to the manufacturer's instructions. Primers and probes were synthesized at "Evrogen" company (Moscow, Russia). For PCR, reagents manufactured by "Synthol" company (Moscow, Russia) were applied. Results and discussion. In order to perform the reliable indication of pathogenic Borrelia, specific loci (genes) of B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi, which were significantly different from the genetic code of other representatives of the genus Borrelia and from the DNA of other organisms, have been determined by molecular-genetic methods. As a result of a preliminary determination of the analytical significance of the studied loci, the following genes and loci were selected for further work: pepX, clpA, ospA, p83/100, ospC andflaB, of which the flaB and ospA genes were selected for practical indication of pathogenic Borrelia DNA. The genetic markers of B. burgdorferi and B. afzelii are displayed during amplification of the flaB gene, while B. garinii and B. afzelii occur when the ospA gene is used as a genetic marker.

Key words: Borrelia, specificity, gene polymorphism, PCR.

Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

Corresponding author: Nail I. Khammadov, e-mail: [email protected].

Citation: Khammadov N.I., Khamidullina A.I. Genetic Markers for Detecting the DNA of Pathogenic Borrelia. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2022; 2:134-141. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2022-2-134-141

Received 06.02.2020. Revised 13.11.2020. Accepted 19.05.2022.

Khammadov N.I., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5669-1486

Khamidullina A.I., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5593-2399

Возбудитель боррелиоза - бактерия класса Spirochaetia, отряда Spirochaetales, семейства Borre-liaceae, рода Borrelia, данный род насчитывает более

30 видов, из которых патогенными видами считаются Borrelia garinii, B. afzelii, B. burgdorferi [1], маркерные локусы которых будут описаны в данной работе.

В России обращения людей с жалобами на укусы клещей не редки. В 2020 г. было зарегистрировано 989 случаев заболевания клещевым энцефалитом (0,67 случая на 100 тыс. населения) [2]. Показатель заболеваемости клещевыми боррелиозами в тот же период составил 2,85 случая на 100 тыс. населения [3]. Оба заболевания зарегистрированы почти во всех федеральных округах страны и за ее пределами.

Схожая симптоматика протекания клещевого энцефалита и боррелиоза, а также кардинальные различия в их лечении и профилактике подчеркивают необходимость своевременной дифференциации анализируемых биопатогенов друг от друга. Для точной и быстрой индикации указанных выше патогенов хорошо подходят молекулярно-генетические методы (например, ПЦР). Маркерные локусы, наиболее подходящие для индикации вируса клещевого энцефалита, были описаны ранее [4]. Аналогичная работа относительно генетических маркеров патогенных боррелий представлена в данной публикации.

Цель исследования - анализ генетических маркеров возбудителей болезни Лайма, которые можно использовать для специфичной индикации их максимально большого числа штаммов и изолятов.

Материалы и методы

Нуклеотидные последовательности различных генов B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi загружены из базы данных NCBI (Национального центра биологической информации) [5]. Определение встречаемости анализируемых нуклеотидных последовательностей в генетическом коде различных организмов определяли в программной утилите nBLAST [6]. Для дизайна праймеров и зондов использовали программу Vector NTI 9.1.0 (Invitrogen Corporation, Карлсбад, США).

В качестве исследуемого материала использовали плазмидную ДНК со вставкой маркерных локусов clpA, ospA и flaB (синтезирована в ЗАО «Евроген», москва, россия) и образцы нуклеиновых кислот, полученные от клещей родов Ixodes (24 особи) и Dermacentor (11 особей). Клещи собраны в черте города Казани и пригородной лесополосе (Волжско-Камский заповедник), каждый экземпляр исследован индивидуально. Плазмидная ДНК являлась маркером, определяющим специфичность как нук-леотидную последовательность для амплификации, а нуклеиновые кислоты клещей обоих видов - как внутренний контроль (подтверждение результативности выделения ДНК). Для амплификации ДНК применяли термоциклер C1000 с оптическим блоком CFX96 (BioRad, Интернациональный бизнес-парк, Сингапур). Выделение ДНК производили, используя набор «МАГНО-сорб» вариант 100-200 («АмплиСенс», москва, россия), согласно инструкции производителя. При работе с образцами клещей их предварительно измельчали на гомогенизаторе FastPrep-24 (MP Biomedicals, Гленвиллоу, США)

с применением Lysing Matrix A (MP Biomedicals, Гленвиллоу, США).

Для реакции амплификации использовали следующий состав реакционной смеси из расчета на одну пробу: 1,5 мкл 25 mM раствора MgCl2; 1,5 мкл 2,5 mM раствора dNTP; 1,5 мкл 10x буфера для ПЦР; 0,5 мкл 10 pM раствора зонда для ПЦР; 10 pM раствора прямого и обратного праймеров по 0,5 мкл; 0,5 мкл Taq-полимеразы; 5 мкл нуклеиновых кислот и 3,5 мкл - деионизированной воды. При совместной амплификации плазмидной ДНК и ДНК клещей применяли следующую пропорцию: 5 мкл плазмидной ДНК и 3,5 мкл ДНК клещей (в данном случае в составе реакционной смеси деионизиро-ванная вода не применяется). Праймеры и зонды синтезировали в ЗАО «Евроген» (Москва, Россия). Для ПЦР использовались реактивы производства ЗАО «Синтол» (Москва, Россия). Конечный объем реакционной смеси составил 15 мкл. Амплификация нуклеиновых кислот осуществлялась по следующей программе: (I) денатурация ДНК при температуре 95 °C в течение 2 минут; (II) 5 циклов, состоящих из 10 секунд, - при 95 °C, 30 секунд - при 59 °C; (III) 40 циклов, состоящих из: 10 секунд - при 95 °C, 30 секунд - при 57,5 °C. Детекция результата ПЦР происходит на каждом из 40 циклов третьей стадии ПЦР, при 57,5 °C по каналам Hex (R6G) и Cy5.

Результаты и обсуждение

Для достоверной индикации патогенных бор-релий методами молекулярно-генетического анализа необходимо определить специфичные локусы (гены) B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi, которые будут достоверно отличаться от генетического кода других представителей рода Borrelia и ДНК иных организмов. В среднем геном боррелий составляет 1219280 пар нуклеотидных оснований. Для анализа выбраны нуклеотидные последовательности B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi, которые широко представлены в базе данных NCBI, что позволило провести их детальный анализ для подбора наиболее специфичного (амплификация нуклеиновых кислот патогенных боррелий) локуса. Наиболее интересующими нас в данном исследовании (имеющиеся у всех указанных выше видов боррелий) были следующие гены илокусы (GenBank ID): omp66 (MN007126);плаз-мида cp32 (NZ_CP018293); clpX (MH747562.1); clpA (MH747556); recG (MH747536); ospA (MF279825); p83/100 (MG010848); rplB (MF398161); groEL (KY828977); штамм В023 плазмида (CP018279); плазмида cp26 (CP018266); P66 (AY090473); ospC (HQ660512); bmpC и bmpA (AF222439); bmpD и bmpC (AF222435); cspA (GQ344485); rpoB (AF525483); ospE (AF029910); L7/L12 (AY737707); bmpA (KM267258); uvrA (JX971419); nifS (JX971299); rpoD (U68016); vlsE (AY100632); 5S-23S ribosomal RNA (JX649207); плазмида lp54 (AJ786368); 16S ribosomal RNA (EU152127); dbpA (AB253535); bbk32 (AB253531);

p17 (AJ131976); recA (AF465241); flaB (KT347453); flagellin (JF732876);pyrG (MG013953) [7-21].

Всего потенциальных генетических маркеров для специфичной амплификации нуклеиновых кислот патогенных боррелий - 34, относительно всех нуклеотидных последовательностей выполнен анализ с использованием алгоритма BLAST [6], результаты анализа отражены в табл. 1.

У указанных микроорганизмов гомология к анализируемым генам не ниже 89 %.

все анализируемые гены (табл. 1) - специфичные для рода Borrelia.

В результате определения аналитической значимости исследуемых локусов (BLAST-анализ) для дальнейшей работы выбраны следующие гены: pepX, clpA, ospA, p83/100, ospC, flaB и flagellin. В табл. 2

указаны виды боррелий, обладающие идентичными анализируемым генам нуклеотидными последовательностями.

Цифровые обозначения в табл. 2 указывают на количество выявляемых изолятов соответствующего организма при поисковом запросе по каждому из анализируемых маркерных локусов.

При анализе представленных маркерных локу-сов установлено, что гены ospA и flaB характеризуются большим количеством выявляемых изолятов B. afzelii, B. garinii и B. burgdorferi и минимальным содержанием гетерогенных организмов со схожим нуклеотидным составом генома (гомология ниже 95 %). Комбинация вышеуказанных маркерных локусов позволяет исключить выявление гетерогенных организмов и повысить эффективность

Таблица 1 / Table 1

Встречаемость анализируемых генов у микроорганизмов рода Borrelia The occurrence of analyzed genes in microorganisms of the genus Borrelia

Организм Organism Маркерный локус / Marker locus

omp66 pepX clpX c recG ospA p83/100 rplB groEL pB023 6 <N P66 ospC bmpC/A bmpD/C cspA rpoB ospE L7/L12 bmpA uvrA & n rpoD vlsE 5S-23S > 16S ydqp bbk32 7 p recA flagellin pyrG

B. afzelii + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B. garinii + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B. burgdorferi + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B. spielmanii + + + + + + + + + + + + +

Borreliella bavariensis + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B. japonica + + + + + + + + + + +

B. lanei + + + + + + + + + +

B. mayonii + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B. yangtzensis + + + + + + + + + + + +

B. valaisiana + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B. tanukii + + + +

B. carolinensis + + + + +

B. maritima + + + + + + + + + + + + + + + +

B. chilensis + + + + + + + + + + + + + + +

B. finlandensis + + + +

B. bissettii + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B. lusitaniae + + + + + + + + + + + + +

B. sinica + + + + + + +

B. kurtenbachii + + + + + + +

B. andersonii + + + + + + + + + + + +

B. americana + + + + + + + +

B. californiensis + + + + + + + +

B. turdi + + +

Borrelia sp. +

Таблица 2 / Table 2

Встречаемость анализируемых генов у боррелий разных видов Frequency of the analyzed genes in different species of Borrelia

Организм / Organism Маркерный локус / Marker locus

pepX clpA ospA p83/100 ospC flaB flagellin

B. afzelii 14 26 >100 39 66 >100 >100

B. garinii 64 >100 >100 - 65 - -

B. burgdorferi 4 - 10 4 37 >100 >100

B. spielmanii 1 - - - - - -

B. bavariensis 12 32 - - 8 - -

B. japonica - 1 - - - - -

B. lanei - 1 - - - - -

B. mayonii - - - 2 - - -

B. yangtzensis - - - - 1 - -

B. valaisiana - - - - 1 - -

B. tanukii - - - - 2 - -

B. carolinensis - - - - 1 - -

индикации патогенных боррелий. Специфичное выявление генетических маркеров B. burgdorferi и B. afzelii у максимально большего количества их изолятов достигается благодаря анализу гена flaB. Амплификация гена ospA позволяет выявить ДНК B. garinii и B. afzelii. Мультилокусный подход для индикации и типирования патогенных боррелий описывается многими исследователями, при этом в качестве основного инструмента интерпретации полученных данных чаще всего используется анализ нуклеотидных последовательностей с использованием алгоритма BLAST [6] при секвенировании

искомых генов (чаще всего применяются гены _АаВ, glpQ, OspA, 16SрРНК и межгенный участок 5S-23S рРНК) [22-24].

Степень комплементарности различных изолятов выявляемых боррелий к общей нуклеотидной последовательности каждого гена отличается. С целью выявления наиболее консервативных участков внутри анализируемого локуса произведено взаимное сравнение ДНК изолятов с различной степенью гомологии по каждому из анализируемых маркерных локусов. Результат такого сравнения представлен на рис. 1.

1а

lb

1с

2 а

2Ь

2с

rAGAAAAAGTTTTAGTAAGAATGAAAGAATTAGCAGTTCAATCAGGTAACGGAACGTATTCAGACTCAGACAGAGGTTCTATACAGATT^^

rAGAAAAAGTTTTAGTAAGAATGAAAGAATTAGCAGTTCAATCAGGTAACGGAACGTATTCAGACTCAGACAGAGGTTCTGTACAGATTGAAATAGAGCAACTTACAGACGAAÄTTAATAGAATTGCTGATC TAGAAAAAGTTTTAGTAAGAATGAAAGAATTAGCAGTTCAATCAGGTAACGGAACGTATTCAGACTCAGACAGAGGTTC ^s.GAAAAAGTTTTAGTAAGAATGAAAGAATTAGCAGTTCAATCAGGTAACGGAACGTATTCAGACTCAGACAGAGGTTCT^ tagju^AAGTTTTAGTAAGAATGAAAGAATTAGCAGTTCAATCAGGTAACGGAACGTATTCAGACTCAGAC^

—----AAAGTTTTAGTAAGAATGAAAGAATTAGCAGTTCAATCAGGTAACGGAACGTATTCAGACTCAGACAGAGGTTCTiATACAGATTGAAATAGAGCAACTTACAGACGAAATTAATAGAATTGCTGATCAGGCTCAATATAACCAAATGCACATGTTGTCAAACAAATCTGCTTCCCA

rAGJUUAAGTTTTAGTAAGAATGAAAGAATTAGCAGTTCAATCAGGTAACGGAACG^

310

320

330

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

340

.350

360

370

390

410

430

440

460

470

AAATGTAAAAACAGCTGAjftGAGCTTGGAATGCAGCCTGCAAAAATTAACACACCAGCATCACTTTCAGGATCTCAAGCTTCTTGGACTTTAAGAGTTCATGTGGGAGCAAATCAAGATGAAGCAATTGCTGTAAATATTTATTCAGCTAATGTTGCA

AAATGTAAAAÀCAGCTGA&GAGCTTGGAATGCAGCCÏÉGCAAAAATTAACACÀCCAGCATC^^

AAATGTAAAAACAGCTGAiGAGCTTGGAATGCAGCCTGCAAAAATTAACACACCA^

AAATGTAAAAACAGCTGAj^GAGCTTGGAATGCAGCCCGCAAAAATTAACACACCAGCATCACTTTCAGGATCTC AAATGTAAAAACAGCTGAÎftGAGCTTGGAATGCAGCCTGCAAAAATTAACACACCAGCATCACTTT AAATGTAAAAACAGCTGAiftGAGCTTGGAATGCAGCC^GCAAAAATTAACACACCAGCATCACTTTCAGGATCTC^ AAATGTAAAAACAGCTGAGGAGCTTGGAATGCAGCCÎÉGCAAAAATTAACACACCAGCATCACTTTCAG

600 610 620 630 ,640 .650 ,660 f

TCAAGCTGCTCAGGCTGCACCTGTTCAAGAGGGTGCTCAAGAAGAAGGAGCTCAGCAACCAACACCTGCTACAGCACCTACTCAAGGTGGAGTTAATTCTCCTGTTAATGTTACAACCACAGTTGATGCTAATACATCACTTGCTAAAATAGAAAATGCTATTAGAATGATAAGTGATCA.

TCAAGCTGCTCAGGCTGCACCTGTTCAAGAGGGAGCTCAAGAAGAAGGAGCTCAGCAACCAACACCTGCTACAGCAC^^

TCAAGCTGCTCAGGCTGCACCTGTTCAAGAGGGjKCTCAAGAAGAAGGAGTTCAGCAACCAACACCTGC^^

TCAAGCTGCTCAGGCTGCACCTGTTCAAGAGGGiTGCTCAAGAAGAAGGAG^TCAGCAACCAACACCTGCTACAGCACCT^--------

TCAAGCTGCTCAGGCTGCACCTGTTCAAGAGGGjTGCTCAAGAAGAAGGAG'qTC

TCAAGCTGCTCAGGCTGCACCTGTTCAAGAGGGpGCTCAAGAAGAAGGAGCTX;AGCAACCAACACCTGCTACAGCACCTACTC

TCAAGCTGCTCAGGCTGCACCTGTTCAAGAGGGTGCTCAAGAAGAAGGAGCTCAGCAACCAACACCTGCTACAGCACCTACTCAAGGTGGAGTTAATTCTCCTGTTAATGTTACAACCACAGTTGATGCTAATACAACACTTGCTAAAATAGAAAATGC

ВШ1

.180

.190

.200

.210

220

,240

,250

270

290

.300

3X0

,330

.340

acagtagacaagattgagctaaaaggaacttctgataaagacaatggttctggagtgcttgaaggtacaaaagatgacaaaa

acagtagacaagattgagctaaaaggaacttctgataaagacaatggttctggagtgcttgaaggtacaaaagatgacaaaagtaaagcaaaattaacaattgctgacgatctaagtaaaaccacattcgaactt acagtagacaagattgagctaaaaggaacttctgataaagacaatggttctggagtgcttgaaggtacaaaagatgacaaaagta^^

acagtagacaagattgagctaaaaggaacttct^ataaagacaatggttctggagtgcttgaaggtacaaaagatg

acagtagacaagattgagctaaaaggaacttctgataaagacaatggttctggagtgcttgaaggtacaaaagatgacaaaagtaaagcaaaattaacaattgctgacgatctmgtaaaaccacattcgaacttttcaaaga acagtagacaagattgagctàaaaggaacttctgataaagacaatggttctggagtgcttgaaggtàcaaaagatgacaaaagtaaa

,440

,520

aagacaaaacatcaacagatgaaatgttcaatgaaaaaggtgaattgtctgcaaaaaccatgacaagagaaa---aaag

aagacaaaacatcaacagatgaaatgttcaatgaaaaaggtgaattgtctgcaaaaaccatgacaagagaaaatg^^---aaag

aagacaaaacatcaacagatgaaatgttcaatgaaaaaggtgaattgtctgcaaaaaccatgacaag---aaag

aagacaaaacatcaacagatgaaatgttcaatgaaaaaggtgaattgtctgcaaaaaccatgacaagagaaaatggaaçcaaactt^---aaag

aagacaaaacatcaacagatgaaatgttcaatgaaaaaggtgaattgtctgcaaaaaccatgacaagagaaaatggaac^---aaag

aagacaaaacatcaacagatgaaatgttcaatgaaaaaggtgaattgtctgcaaaaaccatgacaagagaaaatggaaccaaacttgaatatacagaaatgaaaagcgatggatccggaaaagctaaa---aaag

540

550

560

570

590

600

610

630

640

650

660

670

680 ,

690

gtaacattggaagtaaaagaaggaaccgttactttaagtaaggaaattgcaaaatctggagaagtaacagttgctcttaatgacactaacactactcaggctactaaaaaaactggcgc

gtaacattggaagtaaaagaaggaaccgttActttaagtaaggaaattgcaaaatctggagaa

gtaacattggaagtaaaagaaggaaccgttactttaagtaaGgaaattgcaaaatctggagaag

gtaacattggaagtaaaagaaggaacCgttäctttaagtaaGgaaattgcaaaatctggagaaGtaacagttgctcttaatgacactAacactactcaggctac gtaacattggaagtAaaggaaggjuccgttgctttaagtaaggaaattgcaaaat^

gtaacattggaagtaaaagaaggaaccgttactttaagtaaggaaattgcaaaatctggagaagyaacagttgctcttaatgacactaacactactcaggctactaaaaaaactggcgcatgg-----------------------------------------------

Рис. 1. Вариабельность нуклеотидных последовательностей генов flaB и ospA:

' - выравнивания по гену flab; 1a - нуклеотиды с 130-го по 310-й нуклеотид; 1b - с 310-го по 490-й нуклеотид; 1с - с 490-го по 670-й нуклеотид; 2 -выравнивания по гену ospA; 2a - с 169-го по 349-й нуклеотид; 2b - с 350-го по 530-й нуклеотид; 2с - с 529-го по 699-й нуклеотид

Fig. 1. The variability of the nucleotide sequences of the flaB and ospA genes:

1 - alignment by the flaB gene; la - nucleotides, from 130th to 310th ones; lb - from 310th to 490th nucleotides; lc ment by the ospA gene; 2a

- from the 169th to 349th nucleotides; 2b - from the 350th to 530th nucleotides; 2c -

from 490th to 670th nucleotides; 2 -from 529th to 699th nucleotides

■ align-

Нуклеотидные основания, выделенные желтым цветом, характеризуются идентичностью во всех анализируемых последовательностях. Выделение белым цветом указывает на точечную замену анализируемого основания (совпадение менее 50 % по отношению к общему числу анализируемых случаев), синий цвет - совпадение более 50 % по отношению к общему числу анализируемых нуклеотидов.

В результате сравнения ДНК микроорганизмов, характеризующихся наличием анализируемых генов, удалось установить, что ген flaB обладает наименьшей вариабельностью последовательности нуклеотидов. В совокупности с наличием гена flaB лишь у бактерий вида B. afzelii и B. burgdorferi применение данного маркера целесообразно для выявления генетического материала патогенных боррелий. Анализ гена ospA (для выявления ДНК B. garinii и B. afzelii) также подразумевает наличие маловариабельных участков для дизайна комплементарных им олигонуклеотидных затравок.

Исходя из вариабельности генов flaB и ospA, выполнен дизайн праймеров и зондов для амплификации каждого из маркерных локусов, которые представлены в табл. 3.

Дизайн праймеров и зондов для ПЦР осуществлялся комплементарно локусам маркерных последовательностей ДНК, характеризующихся минимальной вариабельностью нуклеотидов искомых изолятов патогенных боррелий. Так, удалось достичь отсутствия полиморфизма в составе олигонуклеоти-дов во всех случаях, кроме праймеров для амплификации гена ospA. Все димеры и вторичные структуры не оказывают негативного влияния на процесс амплификации, так как характеризуются минимальной длиной.

Для контроля качества выделения нуклеиновых кислот применялись праймеры и зонды, описанные ранее [4], с обозначением Ixodes и Dermacentor. Данные затравки применяются в мультиплексном

формате (все олигонуклеотиды для контроля качества выделения нуклеиновых кислот применяются в одной пробирке).

Праймеры для индикации клещевого боррелио-за (Forward primer flaB, Reverse primer flaB, Forward primer ospA, Reverse primer ospA) имеют среднюю температуру плавления (57,67±0,26) °С, а олигонуклеотиды для контроля амплификации - (56,35±0,29) °С, что минимизирует влияние контрольной амплификации на прохождение специфичной ПЦР при температуре отжига 57,8 °С.

Для контроля ПЦР (специфичная часть положительного контрольного образца для этапа ПЦР) была создана следующая нуклеотидная последовательность (5TAGGCTCAATATAACCAAATGCACATTG GTCCTTCTGGAGCGGGATCAAACAAATCTGCTT CCCAAAATGTAAAAACAAATTGACGGATATTTT ATCAGAAGAGCTTGGATTAACACACCAGCATCA CTTTCAGGACCTGTTTTAAGTAATGAAGGGTAT TATGAATCATGAAAGTTCTTGTAAGTAAAGAAA AAGACAAAGACGGTAAATACAGCCAAACTTGA GCTAAAAGGAACTTCTGATAAAAGCAATGGTTC TGGAGTGCTTGAAGGTACAAAAGCTGACAAAA GTAAAGCAAAGTTAACCATTTC3). Вставку маркерной последовательности в плазмиду pAL2-T заказали в ЗАО «Евроген». Результат ПЦР с плазмид-ной ДНК и ДНК клещей представлен на рис. 2.

для определения предела обнаружения синтетической ДНК подготовили 10 десятикратных разведений плазмиды с начальной концентрацией 375 нг/мкл, что соответствует (для применяемой плазмиды) 99417428000 геном-эквивалентов на миллилитр (ГЭ/мл). Каждое из разведений амплифици-ровали в четырех повторах. Предельное работоспособное (все реакции ПЦР успешны) разбавление составило 10-9, что соответствует одной молекуле ДНК в реакционной смеси (200 ГЭ/мл).

Интерпретация результатов амплификации осуществляется следующим образом. визуализация

Таблица 3 / Table 3

Применяемые в работе для амплификации олигонуклеотиды Oligonucleotides used in the work for amplification

Название праймера, зонда Name of primer, probe Нуклеотидная последовательность Nucleotide sequence

Forward primer flaB CAGGCTCAATATAACCAAATGCACAT

Reverse primer flaB CCTGAAAGTGATGCTGGTGTGTTAAT

ProbeflaB (R6G)TCAAACAAATCTGCTTCCCAAAATGTAAAAACA(BHQ1)

Forward primer ospA TGTTAATTTTGCTTTACTTTTGTCAGCTTT

Reverse primer ospA AAGTTCTTGTAAGTAAAGAAAAAGACAAAGACG

Probe ospA (R6G)AGAACCATTGTTTTTATCAGAAGTTCCTTTTAGCTCAA(BHQ1)

Forward primer Ixodes CATATTGAATTTGAGGAGGATTTTCAGT

Reverse primer Ixodes TGTGAAGTAAGGGTGGAAAGGGAT

Probe Ixodes (Cy5)ACACTCACTCGATTTTTTTCTTTACATTTTATTTTACCTTT(RTQ2)

Forward primer Dermacentor GCTAAGAGAATGGAATTTCAGGGAA

Reverse primer Dermacentor AGATGCCCCAACTAAGAATTCCTAAT

Probe Dermacentor (Cy5)AAGAAACAATTATATAAATTAAGGACAAGAAGACCCTAAGAA(RTQ2)

Рис. 2. Амплификация маркерных локусов для индикации патогенных боррелий (ген flaB): А - амплификация контрольной и клещевой ДНК; В - количественная калибровка плазмидного контроля

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Fig. 2. Amplification of marker loci to indicate pathogenic Borrelia (flaB gene): A - amplification of control and tick DNA; B - quantitative calibration of plasmid control

ПЦР с олигонуклеотидными затравками для выявления клещевого боррелиоза происходит по каналу Hex (он же R6G), а внутреннего контроля - по каналу Cy5. Так, индикация B. burgdorferi и B. afzelii осуществляется с использованием гена flaB, амплификация генетического маркера ospA позволяет идентифицировать боррелии видов B. garinii и B. afzelii. Мультиплексный подход исследования ДНК боррелий позволяет выявлять максимальное количество изолятов и штаммов боррелий видов B. garinii, B. burgdorferi и B. afzelii (табл. 2).

при получении положительного результата пцр по каналу Hex результат амплификации по каналу Cy5 можно не учитывать. В случае отсутствия амплификации по каналу Hex и наличия сигнала флуоресценции (положительной ПЦР) по каналу Cy5 можно утверждать об отсутствии в анализируемом материале патогенных боррелий. Отрицательный результат амплификации по обоим каналам (подтверждение работоспособности общих компонентов реакционной смеси и применяемых специфичных олигонуклеотидов происходит при амплификации положительного контрольного образца) может свидетельствовать о потере Днк в процессе выделения (или ингибировании реакции) либо о принадлежности исследуемого клеща к биологическому виду, который не амплифицируется с олигонуклеотидами внутреннего контроля амплификации, применимыми в данном исследовании. Подтвердить отсутствие потери генетического материала при выделении Днк и качественную очистку от ингибиторов ПЦР можно, повторив анализ начиная с этапа выделения ДНК, дополнительно добавив плазмидную Днк, содержащую нуклеотидную последовательность (5'CAT ATTGAATTTGAGGAGGATTTTCAGTGCTAAGAA

ACA3'), аналогичную генетическому маркеру для амплификации генетического материала клещей рода Ixodes (вставка осуществляется аналогично случаю с положительным контролем амплификации).

В этом случае при качественном выделении ДНК будет положительный результат ПЦР по каналу Cy5, если по-прежнему амплификация пробы не произошла (а проба с положительным контролем ампли-фицируется), нужно заменить набор для выделения ДНК и повторить анализ.

Осуществив подбор генетических маркеров для выявления ДНК патогенных боррелий, установили, что наиболее эффективной для этого является амплификация генов flaB и ospA, интерпретировать результат амплификации следует по обоим генам. Определить качество выделения ДНК можно при амплификации генетического материала клещей родов Ixodes и Dermacentor.

В дальнейшем нами планируется работа по подтверждению практической эффективности разработанных олигонуклеотидов для индикации маркерных генов патогенных боррелий (flaB и ospA) в сравнении с коммерческими тестами.

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

Благодарность. Благодарим Дениса Владимировича Тишина за предоставление образцов клещей для исследования.

Список литературы

1. Бессолицына Е.А., Копосова О.Н. Подбор праймеров для идентификации Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferi. В кн.: Общество. Наука. Инновации (НПК-2019): Сборник статей XIX Всероссийской научно-практической конференции: в 4 т. Киров: Вятский государственный университет; 2019. Т. 1. Биологические и химические науки. С. 13-9. [Электронный ресурс]. URL: https://yadi.sk/i/JsFAWdHJQ2ilHg.

2. АндаевЕ .И., Никитин А.Я., Яцменко Е.В., В еригина Е.В., Толмачёва М.И., Аюгин Н.И., Матвеева В.А., Балахонов С.В. Тенденции развития эпидемического процесса клещевого вирусного энцефалита в Российской Федерации, лабораторная диагностика, профилактика и прогноз на 2021 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 1:6-16. DOI: 10.21055/0370-10692021-1-6-16.

3. Рудакова С.А., Пеньевская Н.А., Блох А.И., Рудаков Н.В., Транквилевский Д.В., Савельев Д.А., Теслова О.Е., Канешова Н.Е. Обзор эпидемиологической ситуации по иксодо-вым клещевым боррелиозам в Российской Федерации в 20102020 гг. и прогноз на 2021 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 2:52-61. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-2-52-61.

4. Хаммадов Н.И. Поиск генетических маркеров вируса клещевого энцефалита для его специфичной индикации. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; 2:122-8. DOI: 10.21055/03701069-2020-2-122-128.

5. National Center for Biotechnology Information. [Электронный ресурс]. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (дата обращения 03.03.2022).

6. Basic Local Alignment Search Tool. [Электронный ресурс]. URL: https:/Mast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn& PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK LOC=blasthome (дата обращения 03.03.2022).

7. Bunikis J., Noppa L., Bergström S. Molecular analysis of a 66-kDa protein associated with the outer membrane of Lyme disease Borrelia. FEMSMicrobiol. Lett. 1995; 131(2):139-45. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1995.tb07768.x.

8. Ornstein K., Ostberg Y., Bunikis J., Noppa L., Berglund J., Norrby R., Bergström S. Differential immune response to the variable surface loop antigen of P66 of Borrelia burgdorferi sensu lato species in geographically diverse populations of lyme borrelio-sis patients. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002; 9(6):1382-4. DOI: 10.1128/cdli.9.6.1382-1384.2002.

9. Gorbacheva V.Y., Godfrey H.P., Cabello F.C. Analysis of the bmp gene family in Borrelia burgdorferi sensu lato. J. Bacteriol. 2000; 182(7):2037-42. DOI: 10.1128/jb.182.7.2037-2042.2000.

10. Kisová-Vargová L., Mucha R., Cemanská D., Bhide M. Host-dependent differential expression of factor H binding proteins, their affinity to factor H and complement evasion by Lyme and relapsing fever borreliae. Vet. Microbiol. 2011; 148(2-4):341-7. DOI: 10.1016/j.vetmic.2010.09.026.

11. Sung S.Y., Lavoie C.P., Carlyon J.A., Marconi R.T. Genetic divergence and evolutionary instability in ospE-related members of the upstream homology box gene family in Borrelia burgdorferi sensu lato complex isolates. Infect. Immun. 1998; 66(10):4656-68. DOI: 10.1128/IAI.66.10.4656-4668.1998.

12. Mukhacheva T.A., Kovalev S.Y. Multilocus sequence analysis of Borrelia burgdorferi s.l. in Russia. Ticks Tick Borne Dis. 2013; 4(4):275-9. DOI: 10.1016/j.ttbdis.2013.02.004.

13. Pan M.J., Tsai C.P., Yeh J.C. Sequence diversity of a gene encoding a putative primary sigma factor among Borrelia burgdorferi sensu lato strains. FEMS Microbiol. Lett. 1997; 148(2):153-8. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1997.tb10281.x.

14. Wang D., Botkin D.J., Norris S.J. Characterization of the vls antigenic variation loci of the Lyme disease spirochaetes Borrelia garinii Ip90 and Borrelia afzelii ACAI. Mol. Microbiol. 2003; 47(5):1407-17. DOI: 10.1046/j.1365-2958.2003.03386.x.

15. Chao L.L., Lu C.F., Shih C.M. Molecular detection and genetic identification of Borrelia garinii and Borrelia afzelii from patients presenting with a rare skin manifestation of prurigo pigmentosa in Taiwan. Int. J. Infect. Dis. 2013; 17(12):e1141-7. DOI: 10.1016/j.ijid.2013.08.004.

16. Wallich R., Pattathu J., Kitiratschky V., Brenner C., Zipfel P.F., Brade V., Simon M.M., Kraiczy P. Identification and functional characterization of complement regulator-acquiring surface protein 1 of the Lyme disease spirochetes Borrelia afzelii and Borrelia garinii. Infect. Immun. 2005; 73(4):2351-9. DOI: 10.1128/IAI.73.4.2351-2359.2005.

17. Zygner W., Jaros S Wedrychowicz H. Prevalence of Babesia canis, Borrelia afzelii, and Anaplasma phagocytophi-lum infection in hard ticks removed from dogs in Warsaw (central Poland). Vet. Parasitol. 2008; 153(1-2):139-42. DOI: 10.1016/j. vetpar.2008.01.036.

18. Koci J., Derdákova M., Peterková K., Kazimirová M., Selyemová D., Labuda M. Borrelia afzelii gene expression in Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) ticks. Vector Borne Zoonotic Dis. 2006; 6(3):296-304. DOI: 10.1089/vbz.2006.6.296.

19. Jauris-Heipke S., Rössle B., Wanner G., Habermann C., Rössler D., Fingerle V., Lehnert G., Lobentanzer R., Pradel I., Hillenbrand B., Schulte-Spechtel U., Wilske B. Osp17, a novel immunodominant outer surface protein of Borrelia afzelii: recombinant expression in Escherichia coli and its use as a diagnostic antigen for serodiagnosis of Lyme borreliosis. Med. Microbiol. Immunol. 1999; 187(4):213-9. DOI: 10.1007/s004300050095.

20. Espí A., Del Cerro A., Somoano A., García V., Prieto J.M., Barandika IF., García-Pérez A.L. Borrelia burgdorferi sensu lato prevalence and diversity in ticks and small mammals in a Lyme bor-reliosis endemic Nature Reserve in North-Western Spain. Incidence in surrounding human populations. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2017; 35(9):563-8. DOI: 10.1016/j.eimc.2016.06.011.

21. Nunes M., Parreira R., Maia C., Lopes N., Fingerle V., Vieira M.L. Molecular identification of Borrelia genus in questing hard ticks from Portugal: Phylogenetic characterization of two novel Relapsing Fever-like Borrelia sp. Infect. Genet. Evol. 2016; 40:26674. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.03.008.

22. Jungnick S., Margos G., Rieger M., Dzaferovic E., Bent S.J., Overzier E., Silaghi C. Walder G., Wex F., Koloczek J., Sing A., Fingerle V. Borrelia burgdorferi sensu stricto and Borrelia afzelii: Population structure and differential pathogenicity. Int. J. Med. Microbiol. 2015; 305(7):673-81. DOI: f0.1016/j.ijmm.2015.08.017.

23. Zhai B., Niu Q., Liu Z., Yang J., Pan Y., Li Y., Zhao H., Luo J., Yin H. First detection and molecular identification of Borrelia species in Bactrian camel (Camelus bactrianus) from Northwest China. Infect. Genet. Evol. 2018; 64:149-55. DOI: 10.1016/j. meegid.2018.06.028.

24. Ruzic-Sabljic E., Cerar T. Borrelia genotyping in Lyme disease. Open Dermatology J. 2016; 10(1):6-14. DOI: 10.2174/1874372201610010006.

References

1. Bessolitsyna E.A., Koposova O.N. [Selection of primers for identification of Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferi]. In: [Society. Science. Innovations (SPC-2019) Collection of papers of the XIX All-Russian Scientific and Practical Conference: in 4 volumes. Vyatka State University]. 2019. Vol. 1. [Biological and Chemical Sciences]. P. 13-9. Available from: https://yadi.sk/i/ JsFAWdHJQ2ilHg.

2. Andaev E.I., Nikitin A.Ya., Yatsmenko E.V., Verigina E.V., Tolmacheva M.I., Ayugin N.I., Matveeva V.A., Balakhonov S.V. [Trends in epidemic process development of tick-borne encephalitis in the Russian Federation, laboratory diagnosis, prophylaxis and forecast for 2021]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2021; (1):6-16. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-6-16.

3. Rudakova S.A., Pen'evskaya N.A., BlokhA.I., Rudakov N.V., Trankvilevsky D.V., Savel'ev D.A., Teslova O.E., Kaneshova N.E. [Review of the epidemiological situation on ixodic tick-borne borreliosis in the Russian Federation in 2010-2020 and prognosis for 2021]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2021; (2):52-61. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-2-52-61.

4. Khammadov N.I. [Search for genetic markers of tick-borne encephalitis virus for its specific indication]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; (2):122-8. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-2-122-128.

5. National Center for Biotechnology Information. (Cited 3 Mar 022). [Internet]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

6. Basic Local Alignment Search Tool. (Cited 3 Mar 2022). [Internet]. Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_ LOC=blasthome.

7. Bunikis J., Noppa L., Bergström S. Molecular analysis of a 66-kDa protein associated with the outer membrane of Lyme disease Borrelia. FEMS Microbiol. Lett. 1995; 131(2):139-45. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1995.tb07768.x.

8. Ornstein K., Ostberg Y., Bunikis J., Noppa L., Berglund J., Norrby R., Bergström S. Differential immune response to the variable surface loop antigen of P66 of Borrelia burgdorferi sensu lato species in geographically diverse populations of lyme borreliosis patients. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002; 9(6):1382-4. DOI: 10.1128/ cdli.9.6.1382-1384.2002.

9. Gorbacheva V.Y., Godfrey H.P., Cabello F.C. Analysis of the bmp gene family in Borrelia burgdorferi sensu lato. J. Bacteriol. 2000; 182(7):2037-42. DOI: 10.1128/jb.182.7.2037-2042.2000.

10. Kisova-Vargova L., Mucha R., Cernanska D., Bhide M. Host-dependent differential expression of factor H binding proteins, their affinity to factor H and complement evasion by Lyme and relapsing fever borreliae. Vet. Microbiol. 2011; 148(2-4):341-7. DOI: 10.1016/j.vetmic.2010.09.026.

11. Sung S.Y., Lavoie C.P., Carlyon J.A., Marconi R.T. Genetic divergence and evolutionary instability in ospE-related members of the upstream homology box gene family in Borrelia burgdorferi sensu lato complex isolates. Infect. Immun. 1998; 66(10):4656-68. DOI: 10.1128/IAL66.10.4656-4668.1998.