CC BY
3Ветеринарный врач. 2024. № 3. С. 41 - 46 The Veterinarian. 2024; (3): 41 - 46
Научная статья
УДК 578.52; 578.82
DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_3_41
КОНСТРУИРОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ПТТР-ДИАГНОСТИКИ
КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
Наиль Ильдарович Хаммадов1, кандидат биологических наук, [email protected] Мария Евгеньевна Горбунова1, кандидат биологических наук, [email protected] Гайша Рамилевна Сальманова1, [email protected] Наиль Анисович Фахрутдинов1, [email protected]
Алексей Михайлович Гулюкин2, член-корреспондент РАН, доктор ветеринарных наук, [email protected] Антонина Глебовна Галеева1, кандидат ветеринарных наук, [email protected] Елизавета Алексеевна Громова1, кандидат биологических наук, [email protected]
1 Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Казань, Российская Федерация
2Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук, Москва, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Наиль Ильдарович Хаммадов.
Аннотация. В Российской Федерации с 2016 по 2020 гг. классическая чума свиней (КЧС) регистрировалась в популяции диких кабанов Приморского края и Амурской области, среди домашних свиней - в Приморском крае и Московской области, с 2021 ситуация благополучная на фоне массовой профилактической вакцинации свиней против КЧС. В соответствии с эпизоотической значимостью и проблемой дифференциации КЧС от других представителей рода Pestivirus, существует необходимость в разработке эффективных тестов для выявления данного возбудителя. В настоящей статье представлены результаты по анализу генома вируса КЧС, с целью дизайна специфических олигонуклеотидных праймеров и зондов для индикации максимально большего количества штаммов и изолятов. В ходе биоинформационного анализа было применено два подхода к анализу потенциальных генетических маркеров - с использованием неполногеномных и полногеномных нуклеотидных последовательностей вируса КЧС. BLAST-анализом коротких нуклеотидных последовательностей (100-1000 нуклеотидов) была установлена значительная гомология исследуемых последовательностей с гетерологичными вирусами (пестивирусами поражающих других животных), таким образом используемые последовательности не могут быть использованы для разработки специфичных олигонуклеотидных праймеров для индикации целевого вируса КЧС. По результатам множественного выравнивании пяти полногеномных последовательностей вируса КЧС - KT119352, KP233071, AY259122, AY775178 штаммов JSZL, HuN23/2013, Riems, Shimen/HVRI соответственно и NC 002657 были определены два перспективных участка, локализованных в области от 70 до 206 и от 12193 до 12303 нуклеотидов (обозначение относительно изолята AY775178). Исходя из вариабельности нуклеотидных последовательностей выбранных регионов анализируемых штаммов, были сконструированы комбинации олигонуклеотидных праймеров и зондов, в том числе для амплификации внутреннего положительного контроля, которые могут быть использованы для разработки эффективного диагностикума при идентификации вируса КЧС.
Ключевые слова: пестивирусы, классическая чума свиней, штамм, генетический маркер, праймеры
Для цитирования: Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Сальманова Г.Р., Фахрутдинов Н.А., Гулюкин А.М., Галеева А.Г., Громова Е.А. Конструирование специфических праймеров для ПЦР-диагностики классической чумы свиней // Ветеринарный врач. 2024 . № 3 . С.41 - 46. DOI: 10.33632/1998-698Х 2024 3 41
DESIGN OF SPECIFIC PRIMERS FOR PCR DIAGNOSIS OF CLASSICAL SWINE FEVER
Nail I. Khammadov1, candidate of biological sciences, [email protected] Maria E. Gorbunova1, candidate of biological sciences, [email protected] Gaisha R. Salmanova1, [email protected] Nail A. Fakhrutdinov1, [email protected]
Alexey М. Gulyukin2, corresponding member of RAS, doctor of veterinary sciences, [email protected] Antonina G. Galeeva1, candidate of veterinary sciences, [email protected] Elizaveta A. Gromova1, candidate of biological sciences, [email protected]
1Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russian Federation
^Federal Scientific Center - All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after
K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation
Corresponding author: Nail I. Khammadov.
Abstract. In the Russian Federation, from 2016 to 2020, classical swine fever (CSF) was registered in the wild boar population of the Primorsky Territory and the Amur Region, among domestic pigs - in the Primorsky Territory and the Moscow Region, since 2021 the situation has been favorable against the background of mass preventive vaccination of pigs against CSF. In accordance with the epizootic significance and the problem of differentiation of CSF from other representatives of the genus Pestivirus, there is a need to develop effective tests to identify this pathogen. This article presents the results of the analysis of the genome of the CSF virus, with the aim of designing specific oligonucleotide primers and probes to indicate as many strains and isolates as possible. In the course of bioinformatics analysis, two approaches were applied to the analysis of potential genetic markers - using non-genomic and full-genomic nucleotide sequences of the CSF virus. BLAST analysis of short nucleotide sequences (100-1000 nucleotides) has established a significant homology of the studied sequences with heterologous viruses (pestiviruses affecting other animals), thus the sequences used cannot be used to develop specific oligonucleotide primers for the indication of the target CSF virus. According to the results of multiple alignment of five full-genome sequences of the CSF virus - KT119352, KP233071, AY259122, AY775178 strains JSZL, HuN23/2013, Riems, Shimen/HVRI, respectively, and NC 002657, two promising sites were identified, localized in the range from 70 to 206 and from 12193 to 12303 nucleotides (designation relative to isolate AY775178). Based on the variability of the nucleotide sequences of the selected regions of the analyzed strains, combinations of oligonucleotide primers and probes were designed, including for amplification of internal positive control, which can be used to develop an effective diagnostic tool for the identification of the CSF virus.
Keywords: pestiviruses, classical swine fever, strain, genetic marker, primers
Введение. Классическая чума свиней (КЧС) - высококонтагиозное заболевание, характеризующиеся при остром течении септическим процессом с проявлением геморрагического диатеза, при подостром и хроническом - поражениями легких и толстого отдела кишечника. Данное заболевание представляет серьезную проблему для свиноводства Российской Федерации.
Возбудитель КЧС, относится к роду Pestivirus, семейства Flaviviridae. Согласно таксономической классификации NCBI на 2024 год род Pestivirus подразделяется на 14 отдельных видов, однако наиболее часто упоминающимися являются четыре нозологические единицы пестивирусов животных - КЧС, диареи КРС-1 и КРС-2, а также пограничной болезни овец (ПБО).
Вирион вируса КЧС состоит из нуклеокапсида и липопротеиновой оболочки. Геном представляет собой однонитевую несегментированную молекулу РНК положительной полярности, длинной около 12,3 тыс. нуклеотидов [1]. Меньшие или большие размеры генома обусловлены делециями или инсерциями. В 5' и 3'- концевых частях вирусной РНК содержатся нетранслируемые области размером около 400 нуклеотидов. Оболочка образована тремя гликопротеинами - Еш ^р44/48), Е1 ^р33) и Е2 ^р55), которые образуют комплексы (Еш — гомодимер, Е1-Е2 — гетеродимер и Е2 — гомодимер) [1]. Белок Еш характеризуется рибонуклеазной активностью [2], комплекс Е1-Е2 отвечает за проникновение вируса в клетку [3].
Современная филогенетическая классификация предусматривает наличие трех генотипов вируса КЧС с тремя-четырьмя субгенотипами, которые не взаимосвязаны с вирулентностью. Следует отметить, что генетическое разнообразие не приводит к получению истинных серотипов и не влияет
на эффективность вакцин [4, 5]. Широкий спектр клинических признаков при КЧС (в том числе на фоне вакцинации) требует обязательного лабораторного подтверждения болезни [5]. Во многих странах мира с развитым свиноводством КЧС может проявляется спорадически [6]. Так к вирусу КЧС восприимчивы не только домашние свиньи, но и дикие кабаны.
Основными методами контроля и борьбы с КЧС является вакцинация, а также быстрая и точная постановка диагноза при выявлении животных-вирусоносителей. Животные, инфицированные КЧС подлежат немедленному убою с возможным использованием мяса в обезвреженном виде.
Диагностические исследования для выявления возбудителя КЧС в Российской Федерации проводят с использованием методов иммунофлюоресценции, так же известный как метод флуоресцирующих антител (МФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА). К главным недостаткам МФА и ИФА тестов можно отнести то, что они не позволяют дифференцировать вирус КЧС от вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Однако данную проблему можно решить, применяя ПЦР анализ. Важным вопросом при разработке эффективной ПЦР тест-системы для специфичного выявления нуклеиновых кислот вируса КЧС является определение участков генома возбудителя, размером от 20 до 50 нуклеотидов, находящихся друг от друга на расстоянии от 5 до 50 нуклеотидов, характеризующихся при этом максимальной гомологией для искомого вируса и максимальным показателем генетического полиморфизма с представителями гетерологичных биологических видов.
Целью работы являлся дизайн специфичных олигонуклеотидов пригодных для индикации максимально числа штаммов и изолятов вируса классической чумы свиней.
Материалы и методы. Объектом исследования являлись нуклеотидные последовательности свиньи и изолятов вируса КЧС, сохраненные из базы данных GenBank ресурсов NCBI (Национального центра биологической информации). Определение встречаемости исследуемых нуклеотидных последовательностей в генетическом материале других организмов выполняли в программной утилите nBLAST как было описано ранее [7]. Множественное выравнивание проводили в программном алгоритме AlignX, входящего в состав программы VectorNTI 9.1 (Invitrogen Corporation, Карлсбад, США). Дизайн олигонуклеотидных праймеров и зондов осуществляли в программе VectorNTI 9.1, аналогично ранее выполненным исследованиям [8, 9, 10], на основании данных о степени полиморфизма полногеномных нуклеотидных последовательностей, единичных нуклеотидных заменах в области гибридизации локусов-кандидатов. Полученные (предварительные) олигонуклеотиды так же подвергали BLAST-анализу.
Дизайн олигонуклеотидных затравок для внутреннего контроля ОТ-ПЦР-РВ выполняли в программе VectorNTI 9.1 [7], учитывая разницу величины интронов и экзонов кандидатных генов. Критерием правильности подбора потенциального генетического маркера являлась разница размера интрона и экзона величиной 400 и более нуклеотидов.
Результаты исследований и их обсуждение. Классическая чума свиней является заболеванием свиней, представляющим экономическую угрозу, мониторинг по которой в нашей стране ведётся на постоянной основе. Данное заболевание не представляет опасности для жизни и здоровья человека, как возбудители бешенства [11], бруцеллёза [12] и других особо опасных заболеваний. Анализ распространения КЧС в Российской Федерации с 2016 по 2020 гг. показал, что заболевание регистрировалось в популяции диких кабанов Приморского края и Амурской области, среди домашних свиней - в Приморском крае и Московской области [5]. По данным ФГБУ ВНИИЗЖ ИАЦ Управления ветнадзора, с 2021 ситуация благополучная на фоне массовой профилактической вакцинации свиней против КЧС. Так в 2022 году вакцинации подвергли 91 млн. 679 тыс 227 голов свиней, 7 голов диких кабанов (Воронежская область). Кроме того, по данному заболеванию проводятся регулярные диагностические исследования. Так в том же году было исследовано около 79 тыс свиней, в том числе методом ПЦР - 9955 голов и ИФА - 28721 животных. Среди диких кабанов проанализировано 3411 тыс. проб.
Для эффективной индикации вируса КЧС молекулярно-генетическими методами необходимо выявить специфичные локусы, которые будут достоверно отличаться от генетического материала других представителей рода Pestivirus и ДНК различных организмов. В ходе биоинформационного анализа было применено два подхода к анализу потенциальных генетических маркеров. Первоначально для разработки специфических олигонуклеотидных праймеров и зондов для индикации вируса КЧС из базы данных GenBank были сохранены неполногеномные нуклеотидные последовательности изолятов возбудителя: EF026758 (Classical swine fever virus Erns glycoprotein mRNA, partial cds), MZ869067 (Classical swine fever virus isolate NM2016-0323 5' UTR), OQ150770 (Classical swine fever virus isolate NM2016-0323 5' UTR), EF026757 (Classical swine fever virus NS5B
mRNA, partial cds), SEG HCVVPG (Classical swine fever virus polyprotein gene, partial cds), OQ150763 (Classical swine fever virus isolate NM2016-0333 3' UTR), EF026755 (Classical swine fever virus polyprotein mRNA, 5' UTR and partial cds), EF421710 (Classical swine fever virus strain 241LN84 gp55 (E2) gene, partial cds), EF421699 (Classical swine fever virus strain 295SX00 gp55 (E2) gene, partial cds), EF421680 (Classical swine fever virus strain 7712Rd-GX98 gp55 (E2) gene, partial cds). Данные нуклеотидные последовательности исследовали BLAST-анализом и в рамках последовательностей со 100% гомологией только к искомому вирусу выполняли предварительный дизайн олигонуклеотидный затравок. Однако данный подход в нашем случае оказался несостоятельным так как при анализе гомологии анализируемого генетического маркера в местах гибридизации праймеров и зондов для ПЦР с вирусами, имеющими максимальную гомологию с возбудителем КЧС регистрировалась значительная гомология нуклеотидной последовательности целевого и гетерологичного вирусов. Таким образом, по результатам проведенного исследования установлено, что для разработки олигонуклеотидных праймеров и зондов недостаточно исследовать только короткие фрагменты генетической последовательности целевого вируса КЧС.
Генетический аппарат вируса КЧС представлен РНК длиной около 12,3 тыс. нуклеотидов, что позволяет производить поиск маркерных локусов, пригодных для индикации данного вируса, анализируя весь его геном. С этой целью из базы данных GenBank были сохранены пять полногеномных последовательностей вируса КЧС - KT119352, KP233071, AY259122, AY775178 штаммов JSZL, HuN23/2013, Riems, Shimen/HVRI соответственно и NC 002657. По результатам множественного выравнивании указанных выше нуклеотидных последовательностей были определены два перспективных участка локализованных в области от 70 до 206 и от 12193 до 12303 нуклеотидов (обозначение относительно изолята AY775178). Так как, наиболее подходящими для амплификации являются олигонуклеотидные праймеры длиной 28-35 нуклеотидов [13], для указанных выше локусов провели поиск консервативных областей длиной до 40 нуклеотидов. По результатам множественного выравнивания с гетерологичными организмами характеризующимися наибольшей гомологией к анализируемой нуклеотидной последовательности были обнаружены участки со следующими позициям (обозначение относительно изолята AY775178): для КЧС1 F - 6985 п.о., КЧС1 R - 175-201 п.о., КЧС1 Р - 148-178 п.о., КЧС2 F - 12190-12225 п.о., КЧС2 R - 1226712295 и КЧС2 Р - 12232-12262 п.о.. Исходя из вариабельности нуклеотидных последовательностей выбранных регионов анализируемых штаммов, были сконструированы олигонуклеотидные праймеры и зонды, представленные в таблице 1.
Таблица 1 - Характеристика разработанных олигонуклеотидов
Обозначение Нуклеотидная последовательность
олигонуклеотидов 5’ ^ 3’
КЧС1 F cccctccagcgacggcc
КЧС1 R cacgtcgaactactgacgactgtcctg
КЧС1 Р (ROX) - ctccctgggtggtctaagtcctgagtacagg - (BHQ2)
КЧС2 F gtacaaactacctcaagttaccacactacactcatt
КЧС2 R gccgttaggaaattaccttagtccaactg
КЧС2 Р (ROX) - agcactttagctggaaggaaaattcctgacg - (BHQ2)
Разработанные комбинации праймеров и зондов характеризовались следующими показателями: по содержанию ГЦ-пар для КЧС1 F, КЧС1 R и КЧС1 Р - 82.4, 55.6 и 58.1 %, КЧС2 F, КЧС2 R и КЧС2 Р - 38.9, 44.8 и 45.2 % соответственно; минимальное и максимальное значение температуры плавления составило от 60,6 до 62 оС. Олигонуклеотиды не образовывали тугоплавких шпилек со свободной энергией Гиббса менее - 1,1 ккал/моль.
Обязательными составляющими любой ПЦР тест-системы являются положительный контрольный образец (ПКО) и отрицательный контрольный образец (ОКО), с использованием которых можно проверить обеспечивают ли компоненты, входящие в состав реакционной смеси, нормальное прохождение реакции. Однако исследуемый в ПЦР материал ДНК, может содержать примеси ингибиторов, которые зачастую снижают эффективность реакции. Также при выявлении
РНК-содержащих вирусов с помощью ОТ-ПЦР отсутствует возможность контроля стадии обратной транскрипции. Ошибка на любом из этапов анализа может привести к ложному результату [14]. Для решения данной проблемы в ПЦР-диагностике зачастую применяют внутренний контрольный образец (ВКО), который подбирают с учетом конкретного назначения ПЦР и модификации реакции. Он представляет собой любой препарат ДНК, отличный от ДНК искомого микроорганизма. Использование ВКО позволяет определить, насколько эффективно прошла амплификация кДНК в каждой конкретной пробирке. С этой целью для разработанных праймерных комбинаций нами был сконструирован ВКО, состоящий из системы олигонуклеотидов (прямой и обратный праймеры и зонд) со следующими нуклеотидными последовательностями: TNF F - gtgcctcagcctcttctccttcct, TNF R - tgggccagagggttgatgctc, TNF P - (Cy5)caccacgctcttctgcctactgcacttc(BHQ3).
Заключение. В ходе биоинформационного анализа была установлена значительная гомология исследуемых последовательностей с гетерологичными вирусами (пестивирусов других животных). По результатам множественного выравнивании пять полногеномных последовательностей вируса КЧС - KT119352, KP233071, AY259122, AY775178 штаммов JSZL, HuN23/2013, Riems, Shimen/HVRI соответственно и NC 002657. были определены два участка локализованных в области от 70 до 206 и от 12193 до 12303 нуклеотидов (обозначение относительно изолята AY775178). Исходя из вариабельности нуклеотидных последовательностей выбранных регионов анализируемых штаммов, были сконструированы комбинации праймеров и зондов, а также олигонуклеотиды для амплификации внутреннего контрольного образца. Данная мультиплексная система может быть использована для быстрой и точной диагностики вируса КЧС методом ПЦР в режиме реального времени.
Список источников
1. Разработка и испытание образцов рекомбинантной субъединичной вакцины против классической чумы свиней / К.П. Алексеев // Сельскохозяйственная биология. 2019. Т. 54, № 6. С. 1236-1246.
2. Structures and Functions of Pestivirus Glycoproteins: Not Simply Surface Matters / F.I. Wang [et al.] // Viruses. 2015. Vol 7, No 7. P. 3506-3529.
3. Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer / E. Weiland [et al.] // Journal of Virology. 1990. Vol 64(8), No 3. P. 563-3569.
4. A critical review about different vaccines against classical swine fever virus and their repercussions in endemic regions / L. Coronado [et al.] // Vaccines (Basel). 2021. Vol 9 (2). P. 154.
5. Классическая чума свиней: ретроспективный анализ эпизоотической ситуации в Российской Федерации (2007-2021 гг.) и прогноз на 2022 г / А.С. Оганесян [и др.] // Ветеринария сегодня. 2022. Т. 11, № 3. С. 229-238.
6. Classical swine fever - An updated review / S. Blome [et al.] // Viruses. 2017. Vol 9 (4). P. 86.
7. Хаммадов Н.И., Хамидуллина А.И. Подбор генетических маркеров для выявления ДНК патогенных боррелий // Проблемы особо опасных инфекций. 2022. № 2. С. 134-141.
8. Генетические маркеры возбудителей особо опасных заболеваний, характеризующихся природной очаговостью / Н.И. Хаммадов [и др.] // Ветеринарный врач. 2020. № 1. С. 67-73.
9. Сравнение гематологических показателей крупного рогатого скота, инфицированного различными подгруппами вируса лейкоза / М.Е. Горбунова [и др.] // Ветеринарный врач. 2024. № 1. С. 34 - 39.
10. A new approach to the diagnosis of enzootic leukosis by genetic markers of bovine leukemia virus / M. E. Gorbunova [et al.] // Biointerface Research in Applied Chemistry. 2022. Vol. 12, No. 4. P. 4448-4462.
11. Ретроспективная оценка эпизоотолого-эпидемиологической характеристики бешенства в Республике Татарстан в 2010-2020 гг / Р.М. Ахмадеев [и др.] // Ветеринарный врач. 2023. № 4. С. 27-32.
12. Салмаков К.М., Косарев М.А. Совершенствование системы специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота с применением вакцины из штамма B. abortus 82 и препарата из штамма B. abortus R-1096 // Ветеринария. 2023. № 8. С. 9-13.
13. Ляхнович Г.В., Кабачевская Е.М. Дизайн, синтез и использование синтетических олигонуклеотидов // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наук. 2013. № 2. С. 109-117.
14. Использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции / Т.Е. Сизикова, [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. 2013. № 3. С. 41-44.
References
1. Development and testing of samples of a recombinant subunit vaccine against classical swine fever / K.P. Alekseev // Agricultural biology. 2019. Vol. 54, No. 6. P. 1236-1246.
2. Structures and Functions of Pestivirus Glycoproteins: Not Simply Surface Matters / F.I. Wang [et al.] // Viruses. 2015. Vol 7, No 7. P. 3506-3529.
3. Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer / E. Weiland [et al.] // Journal of Virology. 1990. Vol 64(8), No 3. P. 563-3569.
4. A critical review about different vaccines against classical swine fever virus and their repercussions in endemic regions / L. Coronado [et al.] // Vaccines (Basel). 2021. Vol 9 (2). P. 154.
5. Classical swine fever: a retrospective analysis of the epizootic situation in the Russian Federation (20072021) and the forecast for 2022 / A.S. Oganesyan [et al.] // Veterinary Medicine today. 2022. Vol. 11, No. 3. Р. 229-238.
6. Classical swine fever - An updated review / S. Blome [et al.] // Viruses. 2017. Vol 9 (4). P. 86.
7. Khammadov N.I., Khamidullina A.I. Selection of genetic markers for DNA detection of pathogenic borrelia // Problems of especially dangerous infections. 2022. No. 2. P. 134-141.
8. Genetic markers of pathogens of particularly dangerous diseases characterized by natural foci / N.I. Hammadov [et al.] // Veterinarian. 2020. No. 1. Р. 67-73.
9. Comparison of hematological parameters of cattle infected with various subgroups of leukemia virus / M.E. Gorbunova [et al.] // Veterinarian. 2024. No. 1. Р. 34-39.
10. A new approach to the diagnosis of enzootic leukosis by genetic markers of bovine leukemia virus / M. E. Gorbunova [et al.] // Biointerface Research in Applied Chemistry. 2022. Vol. 12, No. 4. P. 4448-4462.
11. Retrospective assessment of the epizootic and epidemiological characteristics of rabies in the Republic of Tatarstan in 2010-2020 / R.M. Akhmadeev [et al.] // Veterinarian. 2023. No. 4. Р. 27-32.
12. Salmakov K.M., Kosarev M.A. Improving the system of specific prevention of bovine brucellosis using a vaccine from the B. abortus 82 strain and a drug from the B. abortus R-1096 strain // Veterinary medicine. 2023. No. 8. Р. 9-13.
13. Lyakhnovich, G.V., Kabachevskaya E.M. Design, synthesis and use of synthetic oligonucleotides // Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus. A series of biological sciences. 2013. No.
2. P. 109-117.
14. The use of external and internal control samples in the formulation of polymerase chain reaction and reverse transcription of polymerase chain reaction / T.E. Sizikova, [et al.] // Clinical laboratory diagnostics. 2013. No. 3. pp. 41-44.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с
написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 21.02.2024;
© Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Сальманова Г.Р., Фахрутдинов Н.А., Гулюкин А.М., Галеева А.Г., Громова Е.А. 2024
