CC BY
7Ветеринарный врач. 2024. № 1. С. 28 - 33 The Veterinarian. 2024; (1): 28 - 33
Научная статья
УДК 636.3:619:578:577.2
DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_1_28
ДИЗАЙН АНТИГЕННОЙ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ФРАГМЕНТА ГЛИКОПРОТЕИНА
Е2 ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
Антонина Глебовна Галеева, кандидат ветеринарных наук, [email protected] Константин Валерьевич Усольцев, кандидат ветеринарных наук, [email protected] Наиль Ильдарович Хаммадов, кандидат биологических наук, [email protected] Шамиль Минесалихович Насыров, кандидат ветеринарных наук, [email protected]
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Антонина Глебовна Галеева
Аннотация. Классическая чума свиней (КЧС) - особо опасная трансграничная болезнь представителей семейства Suidae всех пород и возрастных групп - остается одной из наиболее серьезных угроз глобальной свиноводческой отрасли. Для включения Российской Федерации в глобальный рынок производства свинины необходимо получение официального статуса свободы от КЧС, одним из условий которого является отказ от вакцинации поголовья за исключением случаев применения эффективных маркированных вакцин. На сегодняшний день в РФ применяются традиционные (живые аттенуированные) вакцины, многообещающей перспективой которым считаются рекомбинантные вакцины, обладающие безопасностью, мультивалентностью и эффективной презентацией антигена. В настоящем исследовании с применением методов обратной вакцинологии был выполнен дизайн антигенной композиции на основе фрагмента гликопротеина Е2 вируса КЧС. Были идентифицированы основные имумые детерминанты, обеспечивающие протективный эффект in vivo, определена аминокислотная последовательность гибридного полипептида, состоящего из специфической и маркерной частей. При помощи инструментов протеомного анализа установлено, что полипептид E2-V5 обладает стабильностью и гидрофильностью, а также оптимальным для решения биотехнологических задач периодом полураспада в дрожжевых и прокариотических системах экспрессии. Выбранный для дизайна специфической части полипептида фрагмент гликопротеина Е2 большинства эпизоотических и вакцинных штаммов вируса КЧС обладает высокой степенью гомологии к таковому штамму «Ши-Мынь» (от 89,0 % до 98,5 %), что позволяет предположить формирование высокого уровня перекрестной защиты от вирусов разных генотипов.
Ключевые слова: классическая чума свиней, рекомбинантные вакцины, биоинформатический анализ, маркированный антиген, обратная вакцинология
Для цитирования: Галеева А.Г., Усольцев К.В., Хаммадов Н.И., Насыров Ш.М. Дизайн антигенной композиции на основе фрагмента гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней // Ветеринарный врач. 2024. № 1. С. 28 - 33. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_1_28
DESIGN OF ANTIGENIC COMPOSITION BASED ON PARTIAL E2 GLYCOPROTEIN
OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS
Antonina G. Galeeva, candidate of veterinary sciences, [email protected] Konstantin V. Usoltcev, candidate of veterinary sciences, [email protected] Nail I. Khammadov, candidate of biological sciences, [email protected] Shamil M. Nasyrov, candidate of veterinary sciences, [email protected]
Federal State Budgetary Scientific Institution «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological safety», Kazan, Russian Federation
Corresponding author: Antonina Glebovna Galeeva
Abstract. Classical swine fever (CSF), a highly virulent transboundary disease of the Suidae family of all breeds and age groups, remains one of the most serious threats to the global swine industry. To include the Russian Federation in the global production market with a mandatory guaranteed CSF-free status, one of the conditions is the refusal to vaccinate livestock for not using the use of effective labeled vaccines. To date, traditional (live attenuated) vaccines are used in the Russian Federation, but recombinant vaccines with their safety, multivalence and significant antigen presentation are promising choice. In the present study, using reverse vaccinology methods, an immunogenic composition based on the partial E2 glycoprotein of the CSF virus was designed. The main antigenic determinants providing a protective effect in vivo were identified, the amino acid sequence of the hybrid polypeptide consisting of specific and marker parts was determined. Using proteomic analysis tools, it was found that the target E2-V5 polypeptide has stability and hydrophilicity, as well as an optimal half-life for solving biotechnological problems in yeast and prokaryotic expression systems. The partial E2 glycoprotein chosen for the design of the specific part of the polypeptide of most epizootic and vaccine strains of the CSF virus has a high degree of homology to that of the Shimen strain (89.0 - 98.5%), which suggests the formation of a high level of cross protection against viruses of different genotypes.
Keywords: classical swine fever, recombinant vaccines, bioinformatics analysis, labeled antigen, reverse vaccinology
Введение. Классическая чума свиней (КЧС) относится к особо опасным инфекциям представителей семейства Suidae, вспышки которой, несмотря на обилие средств специфической профилактики, ежегодно регистрируются в ряде стран мира [1]. В настоящее время большинство развитых стран благодаря эффективным мерам эрадикации приобрело статус зон, свободных от КЧС, и вакцинация поголовья в них не проводится [2]. В Российской Федерации, эндемичной по КЧС, контроль за распространением заболевания осуществляется тотальной вакцинацией поголовья традиционными (живыми ат-тенуированными) вакцинами, применение которых, несмотря на высокую практическую ценность, является причиной перманентной циркуляции вакцинного вируса [3]. Согласно «Кодексу здоровья наземных животных» Международного эпизоотического бюро (МЭБ), одним из условий присвоения статуса благополучной по КЧС территории является отказ от вакцин на фоне отсутствия вспышек инфекции в течение года; исключение составляют вакцины, отвечающие требованиям стратегии DIVA [4]. Проблема конструирования эффективных маркированных вакцин против КЧС может быть решена применением технологий рекомбинантного синтеза. Получение рекомбинантных белков, содержащих отдельные иммунодоминантные эпитопы возбудителя, является одной из многообещающих стратегий разработки вакцин для профилактики вирусных инфекций. Подобные вакцины обладают рядом преимуществ перед классическими вакцинами, в частности, безопасностью, мультивалентностью и эффективной презентацией антигена [5]. Наиболее часто применимой иммуногенной основой является гликопротеин Е2 вируса КЧС - мажорный антиген, индуцирующий образование вируснейтрализую-щих антител и обеспечивающий протективный эффект. Его эпитопы представляют собой важные мишени для антигенной эволюции; изменения в структуре этих эпитопов, как правило, связаны со значительным снижением нейтрализующих титров против гетерологичных вирусов [6]. Большинство эпи-топов, входящих в состав гликопротеина Е2 вируса КЧС, были ранее идентифицированы при помощи моноклональных антител, метода фагового дисплея и пептидного синтеза, однако задача подбора эффективных антигенных композиций для конструирования рекомбинантных вакцин является по-прежнему актуальной.
Целью настоящего исследования является дизайн антигенной композиции - гибридного полипептида - на основе фрагмента гликопротеина Е2 вируса КЧС.
Материалы и методы. Для анализа были использованы последовательности 50 геномов и про-теомов эпизоотически значимых и вакцинных штаммов и изолятов вируса КЧС (Pestivirus C), депонированных в базе данных Национального центра биотехнологической информации Genbank (NCBI, NIH, США), а именно: «Ши-Мынь» (ID AF092448.2), «C»/«Chinese» (ID Z46258.1), «ЛК-ВНИВВиМ» (ID KM522833.1), «Alfort A19» (ID U90951.1), «Riems» (ID AY259122.1), «JSZL» (ID KT119352.1) и др. Поиск иммуногенных эпитопов осуществляли при помощи базы данных The Immune Epitope Database (IEDB, США). Антигенность кандидатных протеинов для включения в состав композиции анализировали при помощи ресурса «Vaxign 2.0» («Violin», США) при пороговом значении cutoff>0,4. Поиск трансмембранных доменов и сигнальных пептидов осуществляли при помощи онлайн-ресурсов ТМНММ 2.0 и SignalP 5.0 (DTU Health Tech, Дания). Прогнозирование сайтов N- и О-гликозилирова-ния осуществляли при помощи сервисов NetNGlyc - 1.0 и DictyOGlyc - 1.1 (DTU Health Tech, Дания) при установленных стандартных параметрах [9]. Анализ консервативности эпитопов был проведен с помощью программы BLASTn (NCBI, NIH, США) на основе локального выравнивания генов против
геномов представителей рода Pestivirus. При оценке гомологии нуклеотидных последовательностей учитывались показатели идентичности, охвата и значимости выравнивания (E-value <0,05).
Для дизайна гибридного полипептида - композиции для специфической профилактики КЧС -использовали фрагмент гликопротеина Е2 штамма «Ши-Мынь» вируса КЧС и маркерную последовательность, включающую модифицированный маркерный эпитоп V5 и фрагмент бычьего сывороточного альбумина (BSA, ID Y17769.1). Основные физико-химические характеристики белков (аминокислотный состав, молекулярную массу, теоретическую изоэлектрическую точку (pI), коэффициент экс-тинкции, расчетный период полураспада in vivo, алифатический индекс (АИ), индекс нестабильности (ИН), индекс гидроксипатичности GRAVY) определяли с помощью инструмента «ProtParam Tool» («Expasy», Швейцария). Гомологическое моделирование полноразмерной структуры гибридного полипептида производили при помощи сервиса Swiss-Model («SIB», Швейцария).
Результаты исследований. При дизайне иммуногенных композиций методами обратной вак-цинологии основными критериями, принимаемыми во внимание, являются антигенность и иммуноген-ность. Одним из косвенных показателей иммуногенности белков считается плотность расположения Т- и В-эпитопов, характеризующая их потенциал для стимулирования соответствующих звеньев иммунитета. На сервере базы данных IEDB нами в структуре гликопротеина Е2 был проведен поиск основных эпитопов с подтвержденной иммуногенностью для целевых животных - свиней (табл. 1).
Таблица 1 - Наиболее иммуногенные В-клеточные эпитопы гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней (штамм «Ши-Мынь»)
Эпитоп, локализация в структуре Результат исследования Источник
E2-a CFRREK- PFPHRMDCVTTTVENED (844-865 а.о.) Сочетанное введение рекомбинантных эпитопов индуцировало образование антител у поросят в титрах 1:16 - 1:256 и обеспечивало защиту от летального заражения вирулентным штаммом в дозе 1 х 106 ККИД50 / мл Zhou B. et al., 2011 [5]
E2-b CKEDYRYAISSTNEIGLLGAG (693-716 а.о.)
Антигенный мотиф В/С домена RYLASLHKKALPT (753-765 а.о.) Конструкция обеспечивала дозозависимую ин-гибицию связывания гомологичного штамма вируса КЧС «TD/96» с клетками PK15, что свидетельствует о роли В/С домена в интернализации вируса Huang Y. et al., 2021 [6]
Консервативный CSFV-специфический мотиф TAVSPTTLR (829-837 а.о.) Растворимый слитый белок GST-M эффективно вызывал иммунный ответ, защищая кроликов и свиней от летального заражения Liu S. et al, 2006 [7]
Консервативный гомологичный мотиф LFDGTNP (772-778 а.о.) Химерное свиное моноклональное антитело rHQ06Sw, полученное на данный эпитоп, специфически реагировало с гликопротеином Е2 вируса КЧС в ИФА и вестерн-блоте, не проявляя кросс-реактивности к вирусу диареи КРС Peng W.P. et al, 2008 [8]
Большинство антигенных детерминант, перечисленных в таблице 1, входят в состав фрагмента гликопротеина Е2 протяженностью с 33 по 192 а.о., который можно рассматривать в качестве специфической части иммуногенного полипептида; при этом исходную усеченную последовательность сформировали на основании данных протеома высокопатогенного штамма «Ши-Мынь» (ID AF092448.2), принадлежащего к субгенотипу 1.1. Согласно данным BLAST-анализа, проведенного относительно 50 протеомов эпизоотически значимых штаммов и изолятов вируса КЧС, уровень гомологии данного фрагмента разных штаммов по отношению к таковому штамма «Ши-Мынь» варьирует на уровне от 89,0 % до 98,5 %. Учитывая данный факт, включение данного фрагмента в состав рекомби-нантной вакцины позволит с высокой степенью вероятности индуцировать образование антител, способных нейтрализовать вирусы разных субгенотипов. Ввиду того, что для вакцинопрофилактики КЧС предпочтительно использование маркированных штаммов либо отдельных антигенов (стратегия DIVA), нами дополнительно был выполнен дизайн неспецифической части полипептида. Для этого к
С-концу исходной усеченной последовательности Е2 был добавлен модифицированный эпитоп VP5 и фрагмент последовательности бычьего сывороточного альбумина (BSA, ID NM_180992.2). Использование известных эпитопов в качестве маркерного фрагмента, на наш взгляд, позволит сформировать теги для выработки дополнительных антител, что, в свою очередь, расширит возможности биотехнологического применения подобных гибридных полипептидов. Структурные аспекты разработки композиции отражены на рис. 1 А, Б.
Рисунок 1 - Структура полипептида E2-V5: А - аминокислотная последовательность усеченной специфической части полипептида (полужирным шрифтом выделены участки, включающие эпитопы с доказанным протективным эффектом in vivo, красным цветом - сайты О-гликозилирования, голубым - сайты N-гликозилирования); Б - трехмерная модель полноразмерного полипептида E2-V5
RLACKEDYRYAISSTNEIGLLGAEGLTTTWK EYSHDLHLDDGTVKAVCTAGSFKVTALNVV SRRYLASLHKRALPTSVTFELLFDGTNPVIEE MDDDFGFGLCPFDTSPVIKGKYNTTLLNGSA FYLVCPIGWTGVVECTAVSPTTLRTEVVKTF RRDK
А Б
Карта аминокислотной последовательности (рис. 1А) наглядно демонстрирует высокую плотность расположения иммуногенных эпитопов, а также наличие в структуре фрагмента 29 сайтов О-гликозилирования и 2 сайтов N-гликозилирования. Данные сайты ответственны за возникновение одной из наиболее распространенных форм посттрансляционных модификаций белка - гликозилирова-ния, которое, соответственно, может быть О- или N-связанным в зависимости от выбранной экспрес-сионной системы. Известно, что гликозилирование влияет на отдельные свойства белка: конформаци-онные изменения, антигенные свойства, скорость полураспада in vivo, устойчивость к протеолизу и степень растворимости [9]. Учитывать возможность гликозилирования необходимо при создании отдельных систем экспрессии: в частности, для дрожжей характерно «внешнецепочечное» гликозилирование за счет активности маннозилтрансфераз, для клеток млекопитающих - формирование N-гликанов в результате добавления Р(1,4)-галактозы [10]. Зачастую подобные формы гликозилирования являются нежелательными, так как приводят к неоднородности рекомбинантного продукта по углеводному составу и молекулярной массе, что может значительно затруднить его очистку. Данные факторы необходимо учитывать в формировании гликоинженерной стратегии при выборе экспрессионной системы. На заключительном этапе исследования нами были определены основные физико-химические характеристики прогнозируемого полипептида.
Таблица 2 - Физико-химические характеристики полипептида E2-V5
Показатель Значение
Средняя молекулярная масса, г/моль 20971,9
Моноизотопная молекулярная масса, г/моль 20958,7
Теоретическая изоэлектрическая точка, рН 5,94
Коэффициент экстинкции, М-1 х см-1 25440
Период полураспада 7,2 ч (ретикулоциты млекопитающих, in vitro) >20 ч (дрожжи, in vivo) >10 ч (E. coli, in vivo)
Алифатический индекс 85,11
Индекс нестабильности 33,08 (белок стабилен)
Индекс гидроксипатичности GRAVY - 0,09
Таким образом, анализ разработанной композиции с использованием биоинформатических веб-инструментов показал ее стабильность и отрицательный индекс GRAVY, что характеризует реком-бинантный продукт как гидрофильный. Также следует отметить оптимальный расчетный период полураспада для экспрессии в дрожжевых и прокариотических системах.
Заключение. В результате проведенных исследований был выполнен дизайн кандидатной антигенной композиции E2-V5, включающей большинство известных детерминант, обеспечивающих протективный эффект против высокопатогенных штаммов КЧС in vivo. Предлагаемая композиция также содержит неспецифический (маркерный) фрагмент, выработка дополнительных антител на который позволит дифференцировать инфицированных животных от иммунизированных рекомбинант-ной вакциной. Целевой рекомбинантный продукт обладает оптимальными прогнозируемыми характеристиками (стабильность, гидрофильность, период полураспада) для экспрессии в дрожжевых и про-кариотических системах. Представленные данные в перспективе лягут в основу конструирования про-кариотической системы экспрессии рекомбинантного полипептида E2-V5 для разработки новой реком-бинантной вакцины против КЧС.
Список источников
1. Колбин, И.В. Определение репродуктивных свойств вируса классической чумы свиней вирулентных и вакцинных штаммов в первичных и перевиваемых культурах клеток / И.В. Колбин, А.С. Иголкин, В.Л. Гаврилова, О.С. Пузанкова, Е.В. Аронова, А.А. Елсукова, Н.Н. Власова // Ветеринария сегодня. - 2022. - Т. 11, № 2. - С. 149-155. DOI: 10.29326/2304-196X-2022-11-2-149-155.
2. Шевцов, А.А. Классическая чума свиней: перспективы искоренения / А.А. Шевцов // Животноводство России. - 2021. - № 10. - С. 27-30.
3. Алипер, Т.И. Перспектива использования маркированных вакцин против классической чумы свиней в Российской Федерации / Т.И. Алипер, К.П. Алексеев, Е.В. Шемельков, О.А. Верховский, А.Д. Забережный // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию Армавирской биофабрики, 20-21 августа 2021. - С. 54-60. DOI: 10.47804/978-5-89904-028-3_2021_ 54.
4. OIE Terrestrial Animal Health Code: online access. https://www.woah.org/en/what-we-do/stand-ards/codes-and-manuals/terrestrial-codeonline%20access/?id= 169&L=1&htmfile=glossaire.htm. Дата обращения: 15.08.2023.
5. Zhou, B. Multiple linear B-cell epitopes of classical swine fever virus glycoprotein E2 expressed in E. coli as multiple epitope vaccine induces a protective immune response / B. Zhou, K. Liu, J.-C. Wei, P. Chen // Virology Journal. - 2011. - 378. DOI: 10.1186/1743-422X-8-378.
6. Huang, Y.L. Identification of a Common Conformational Epitope on the Glycoprotein E2 of Classical Swine Fever Virus and Border Disease Virus / Y.L. Huang, D. Meyer, A. Postel, K.J. Tsai, H.M. Liu, C.H. Yang, Y.C. Huang, N. Berkley, M.C. Deng, F.I. Wang, P. Becher, H. Crooke, C.Y. Chang // Viruses. -2021. - V. 13, No. 8. - 1655. DOI: 10.3390/v13081655.
7. Liu, S. Quadruple antigenic epitope peptide producing immune protection against classical swine fever virus / S. Liu, X. Yu, C. Wang, J. Wu, X. Kong, C. Tu // Vaccine. - 2006. - V. 24, No. 49-50. - PP. 71757180. DOI: 10.1016/j .vaccine.2006.06.042.
8. Peng, W.P. Identification of a conserved linear B-cell epitope at the N-terminus of the E2 glycoprotein of Classical swine fever virus by phage-displayed random peptide library / W.P. Peng, Q. Hou, Z.H. Xia, D. Chen, N. Li, Y. Sun, H.J. Qiu // Virus Res. - 2008. - V. 135, No. 2. - PP. 267-272. DOI: 10.1016/j.vi-rusres.2008.04.003.
9. Walsh, G. Post-translational modifications in the context of therapeutic proteins / G. Walsh, R. Jefferis // Nat Biotechnol. - 2006. - Vol. 24, No. 10. - PP. 1241-1252. DOI: 10.1038/nbt1252.
10. Розов, С.М. Стратегии оптимизации синтеза рекомбинантных белков в растительных клетках: классические подходы и новые направления / С.М. Розов, Е.В. Дейнеко // Молекулярная биология. - 2019. - Т. 53, № 2. - С. 179-199. DOI: 10.1134/S0026898419020149.
References
1. Kolbin, I.V. Determination of the reproductive properties of the classical swine fever virus of virulent and vaccine strains in primary and transplanted cell cultures / I.V. Kolbin, A.S. Igolkin, V.L. Gavrilova, O.S.
Puzankova, E.V. Aronova, A.A. Elsukova, N.N. Vlasova // Veterinary science today. - 2022. - Vol. 11, No. 2. - PP. 149-155. DOI: 10.29326/2304-196X-2022-11-2-149-155.
2. Shevtsov, A.A. Classical swine fever: prospects for eradication / A.A. Shevtsov // Livestock in Russia. -2021. - No. 10. - PP. 27-30.
3. Aliper, T.I. The prospect of using labeled vaccines against classical swine fever in the Russian Federation / T.I. Aliper, K.P. Alekseev, E.V. Shemelkov, O.A. Verkhovsky, A.D. Zaberezhny // Scientific foundations for the production and quality assurance of biological preparations: materials of the international scientific and practical conference dedicated to the 100th anniversary of the Armavir Biofactory, August 20-21, 2021. - PP. 54-60. DOI: 10.47804/978-5-89904-028-3_2021_54.
4. OIE Terrestrial Animal Health Code: online access. https://www.woah.org/en/what-we-do/stand-ards/codes-and-manuals/terrestrial-codeonline%20access/?id= 169&L=1&htmfile=glossaire.htm. Дата обращения: 15.08.2023.
5. Zhou, B. Multiple linear B-cell epitopes of classical swine fever virus glycoprotein E2 expressed in E. coli as multiple epitope vaccine induces a protective immune response / B. Zhou, K. Liu, J.-C. Wei, P. Chen // Virology Journal. - 2011. - 378. DOI: 10.1186/1743-422X-8-378.
6. Huang, Y.L. Identification of a Common Conformational Epitope on the Glycoprotein E2 of Classical Swine Fever Virus and Border Disease Virus / Y.L. Huang, D. Meyer, A. Postel, K.J. Tsai, H.M. Liu, C.H. Yang, Y.C. Huang, N. Berkley, M.C. Deng, F.I. Wang, P. Becher, H. Crooke, C.Y. Chang // Viruses. -2021. - V. 13, No. 8. - 1655. DOI: 10.3390/v13081655.
7. Liu, S. Quadruple antigenic epitope peptide producing immune protection against classical swine fever virus / S. Liu, X. Yu, C. Wang, J. Wu, X. Kong, C. Tu // Vaccine. - 2006. - V. 24, No. 49-50. - PP. 71757180. DOI: 10.1016/j .vaccine.2006.06.042.
8. Peng, W.P. Identification of a conserved linear B-cell epitope at the N-terminus of the E2 glycoprotein of Classical swine fever virus by phage-displayed random peptide library / W.P. Peng, Q. Hou, Z.H. Xia, D. Chen, N. Li, Y. Sun, H.J. Qiu // Virus Res. - 2008. - V. 135, No. 2. - PP. 267-272. DOI: 10.1016/j.vi-rusres.2008.04.003.
9. Walsh, G. Post-translational modifications in the context of therapeutic proteins / G. Walsh, R. Jefferis // Nat Biotechnol. - 2006. - Vol. 24, No. 10. - PP. 1241-1252. DOI: 10.1038/nbt1252.
10. Rozov, S.M. Strategies for optimizing the synthesis of recombinant proteins in plant cells: classical approaches and new directions / S.M. Rozov, E.V. Deineko // Molecular biology. - 2019. - V. 53, No. 2. -PP. 179-199. DOI: 10.1134/S0026898419020149.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с
написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 16.10.2023;
© Галеева А.Г., Усольцев К.В., Хаммадов Н.И., Насыров Ш.М. 2024
