CC BY
21
ORIGINAL RESEARCH
КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
In silico идентификация B- и T-клеточных эпитопов белка CD2v вируса африканской чумы свиней (African swine fever virus, Asfivirus, Asfarviridae)
Мима К.А., Каторкина Е.И., Каторкин С.А., Цыбанов С.Ж., Малоголовкин А.С.
ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии», 601125, Владимирская область, Петушинский р-н, пос. Вольгинский, Россия
Ведение. Вирус африканской чумы свиней (АЧС) - крупный ДНК-вирус, единственный представитель семейства Asfarviridae. Распространение вируса АЧС на территории РФ, стран Восточной Европы и Китая свидетельствует о неэффективности существующих способов борьбы с заболеванием и стимулирует исследования, направленные на создание вакцин. Одним из значимых антигенов, необходимых для формирования иммунной защиты против АЧС, является серотипспецифический вирусный белок CD2v. Цель работы - идентификация B- и T-клеточных эпитопов в белке CD2v вируса АЧС с использованием методов in silico прогнозирования.
Материал и методы. Первичную последовательность белка CD2v вируса АЧС штамма Georgia 2007/1 анализировали с помощью программ BCPred, DiscoTop, NetCTLpan, VaxiJen, PVS и Epitope Conservancy Analysis.
Результаты. На основании проведённого комплексного многопараметрического анализа определены четыре B-клеточных иммуногенных эпитопa в секреторной области белка. Анализ секреторной области белка CD2v вируса АЧС в программе NetCTLpan позволил выявить пять T-клеточных эпитопов с 32-й по 197-ю позицию аминокислот, имеющих перекрёстное связывание с 1-й по 13-ю аллель главного комплекса гисто-совместимости I класса свиньи.
Обсуждение. В данном исследовании представлены результаты использования методов прогнозирования in silico для выявления B- и Т-клеточных эпитопов белка CD2v вируса АЧС. Результаты анализа свидетельствуют о кластерном распределении эпитопов в белке CD2v. Наибольший интерес для дальнейшего использования в качестве компонента рекомбинантной полиэпитопной вакцины против АЧС представляет растворимая область белка CD2v с 17-й по 204-ю аминокислоту, содержащая В- и Т-клеточные эпитопы. Заключение. Идентифицированы B- и T-клеточные эпитопы в секреторной области белка CD2v (с 17-й по 204-ю позицию аминокислот) вируса АЧС с помощью in silico программ. Анализ консервативности B- и T-клеточных эпитопов позволил сформировать карту распределения иммунных эпитопов в последовательности белка CD2v.
Ключевые слова: африканская чума свиней; белок CD2v; in silico; прогнозирование линейных B-эпитопов;
прогнозирование линейных T-эпитопов; главный комплекс гистосовместимости I класса; анализ иммуногенности пептида; анализ вариабельности белка; анализ консервативности иммуноэпитопов. Для цитирования: Мима К.А., Каторкина Е.И., Каторкин С.А., Цыбанов С.Ж., Малоголовкин А.С. In silico идентификация B- и T-клеточных эпитопов белка CD2v вируса африканской чумы свиней (African swine fever virus, Asfivirus, Asfarviridae). Вопросы вирусологии. 2020; 65(2): 103-112. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-103-112
Для корреспонденции: Мима Ксения Александровна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории ге-номики вирусов ФГБНУ ФИЦВиМ, 601125, Владимирская обл., Петушинский р-н, пос. Вольгинский. E-mail: mima89@ya.ru
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 18-316-00092. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Участие авторов. Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Поступила 09.01.2020 Принята в печать 29.01.2020
In silico prediction of B- and T-cell epitopes in the CD2v protein of african swine fever virus (African swine fever virus, Asfivirus, Asfarviridae)
Kseniya A. Mima, Elena I. Katorkina, Sergey A. Katorkin, Sodnom Zh. Tsybanov, Aleksandr S. Malogolovkin
Federal Research Center for Virology and Microbiology, Vladimir region, Volginskiy, 601125, Russia
Introduction. African swine fever virus (ASF) is a large DNA virus that is the only member of the Asfarviridae family. The spread of the ASF virus in the territory of the Russian Federation, Eastern Europe and China indicates the ineffectiveness of existing methods of combating the disease and reinforces the urgent need to create effective
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
vaccines. One of the most significant antigens required for the formation of immune protection against ASF is a serotype-specific CD2v protein.
The purpose of the study. This study presents the results of immuno-informatics on the identification of B- and T-cell epitopes for the CD2v protein of the ASF virus using in silico prediction methods.
Material and methods. The primary sequence of the CD2v protein of the ASFV virus strain Georgia 2007/1 (ID-FR682468) was analyzed in silico by programs BCPred, NetCTLpan, VaxiJen, PVS and Epitope Conservancy Analysis.
Results. Using the BCPred and VaxiJen programs, 4 major B-cell immunogenic epitopes were identified. Analysis of the secretory region of ASF virus CD2v protein in NetCTLpan revealed 5 T-cell epitopes from the 32nd to the 197th position of amino acids that cross-link from the 1st to the 13th allele of the MHC-I of pig Discussion. This study presents the results in silico prediction to identify B- and T-cell epitopes of ASF virus CD2v protein. The soluble region of the CD2v protein can be included in the recombinant polyepitope vaccine against African swine fever.
Conclusion. B- and T-cell epitopes in the secretory region of the CD2v protein (from 17 to 204 aa) of ASF virus were identified by in silico prediction. An analysis of the conservatism of the identified B- and T-cell epitopes allowed us to develop a map of the distribution of immune epitopes in the CD2v protein sequence.
Keywords: African swine fever; CD2v protein; in silico; prediction of linear B-epitopes; prediction of linear T-epi-topes; major histocompatibility complex class I; analysis of immunogenicity peptides; analysis of protein variability; analysis of the conservativeness of immunoepitopes. For citation: Mima K.A, Katorkina E.I, Katorkin S.A, Tsybanov S.Zh., Malogolovkin A.S. In silico prediction of B- and T-cell epitopes in the CD2v protein of african swine fever virus (African swine fever virus, Asfivirus, Asfarviridae).Voprosy Virusologii (Problems of Virology). 2020; 65(2): 103-112. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-103-112
For correspondence: Ksenia A. Mima, PhD, Leading Researcher of Laboratory of Virus Genomics, Federal
Research Center for Virology and Microbiology, Volginsky, Vladimir region, 601125, Russia. E-mail: mima89@ya.ru
Information about the authors:
Mima K.A, https://orcid.org/0000-0001-7184-6968
Katorkina E.I., https://orcid.org/0000-0003-3329-0182
Katorkin S.A., https://orcid.org/0000-0002-4844-9371
Tsybanov S.Zh., https://orcid.org/0000-0001-8994-0514
Malogolovkin A.S., https://orcid.org/0000-0003-1352-1780
Acknowledgments. The reported study was funded by RFBR according to the research project № 18-316-00092. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Contribution. The authors contributed equally to this article.
Received 09 January 2020 Accepted 29 January 2020
Введение
Африканская чума свиней (АЧС) - инфекционная болезнь диких и домашних свиней, характеризующаяся высокой летальностью (до 100%), сверхострым, подострым, острым и хроническим течением. На территории РФ она регистрируется с 2007 г., и на протяжении последних лет страны Восточной Европы и Китай являются территорией стационарного неблагополучия по данному заболеванию [1].
Вирус АЧС - представитель семейства Asfаrviridаe, рода Asfivirus. Геном вируса состоит из линейной двухцепочечной ДНК (дцДНК) размером 170-190 тыс. пар нуклеотидов, в зависимости от штамма/ изолята. При анализе нуклеотидной последовательности генома референтного штамма Ва7^ вируса АЧС выявлено 150 открытых рамок считывания, а в инфицированных вирусом АЧС клетках идентифицировано 95 полипептидов с молекулярной массой от 10 до 220 кДа [2].
На протяжении многих лет исследовательские группы всего мира усиленно работают над созданием вакцины против АЧС на основе как аттенуированных штаммов, так и рекомбинантных вирусов с использо-
ванием ДНК- и РНК-технологий [3]. При разработке эффективных средств специфической профилактики против АЧС одним из актуальных направлений является использование рекомбинантных белков (эпитопов) иммунологически значимых белков вируса АЧС [4].
Вирусные белки, присутствующие на оболочке вирионов и поверхности инфицированных клеток, представляют основную мишень для клеточно-опо-средованного иммунитета и могут быть мишенями для нейтрализующих антител, что, несомненно, требует детального изучения [5].
Ранее были идентифицированы белки, предположительно отвечающие за способность к интернализа-ции вируса: p72/B646Lp, p54/E183Lp и p30/CP204Lp. Антитела к белкам p72/B646Lp и p54/El83Lp могут ингибировать связывание вируса с клетками, а антитела к p30/CP204Lp - интернализацию вируса [6]. Были идентифицированы и другие белки вируса АЧС, которые также отвечают за проникновение и распространение вируса. К ним относятся CD2v/EP402R, р12/06Жр, D117L [6-8]. Применение данных белков в качестве протективных антигенов обеспечивало только частичную защиту, однако не защищало жи-
ORIGINAL RESEARCH
вотных от вирусов АЧС гетерологичного происхождения.
Известно, что отдельные эпитопы в составе вирусных антигенов способны индуцировать В- и Т-кле-точный иммунный ответ и могут быть оптимальными кандидатами для создания эффективных вакцин [9].
Современные алгоритмы иммуноинформатики активно используются для поиска отдельных эпитопов вирусных антигенов для последующего включения их в состав кандидатных вакцин [10]. Эпитопы представляют собой короткие аминокислотные (аа) пептиды из 7-9 аа главного комплекса гистосовместимости I класса (major histocompatibility complex, МНС I) и 12-15 аа главного комплекса гистосовместимости II класса (МНС II). Эпитопы Т-клеток, которые могут связываться с МНС I, стимулируют цитотоксические Т-лимфоциты.
Известно, что иммунная защита при АЧС реализуется за счёт цитотоксических Т-лимфоцитов-килле-ров [11] и эффекторов антителозависимой клеточной цитотоксичности и действует против вирусных белков, представленных на поверхности заражённых моноцитов [7, 12].
При поиске протективных антигенов вируса АЧС сотрудниками ФГБНУ ФИЦВиМ, [1, 12, 13] был идентифицирован и изучен CD2v белок вируса АЧС, являющийся важным компонентом при гомологичной инфекции. В качестве мишени для лимфоцитов, экс-прессирующих рецепторы CD48 и CD58, и презентации антигенпрезентирующим клеткам предложено использовать секреторную часть белка вируса АЧС -СD2v [14]. Однако нет данных, подтверждающих, что только секреторная часть белка СD2v имеет B-и T-клеточные эпитопы, обеспечивающие формирование иммунного ответа.
Цель данной работы - выявление B- и T-клеточных эпитопов в белке CD2v вируса АЧС с использованием методов in silico прогнозирования.
Материал и методы
Анализ аминокислотной последовательности. Первичная последовательность белка CD2v вируса АЧС штамма Georgia 2007/1 (ID FR682468) была получена из базы данных GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Дополнительно для анализа вариабельности и консервативности использовали аминокислотные последовательности белка CD2v 103 полевых изолятов и штаммов вируса АЧС, представленные в базе данных Uniprot (https:// www.uniprot.org/).
Прогнозирование B-клеточных эпитопов. Первичную последовательность белка CD2v вируса АЧС анализировали на наличие B-клеточных эпитопов с помощью программы BCPred и дополнительно BCPred + AAP (http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/predict. html) при установленных стандартных параметрах. Для прогнозирования структурных B-клеточных эпитопов 3D-структуры белка CD2v вируса АЧС использовали сервер DiscoTope 2.0 (http://tools.iedb.org/ discotope).
Прогнозирование T-клеточных эпитопов. Т-клеточ-ные линейные эпитопы анализировали в программе TepiTool (http://tools.iedb.org/tepitool/) и NetCTLpan 1. 1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTLpan/) при установленных стандартных параметрах.
Построение 30-структуры белка CD2v вируса АЧС. Для построения предполагаемой 3D-струк-туры белка CD2v вируса АЧС использовали сервер I-TASSER (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) при стандартных параметрах.
Анализ иммуногенности прогнозируемых B-эпито-пов проводили с помощью программы VaxiJen (http:// www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) при установленных стандартных параметрах.
Анализ вариабельности белка CD2v вируса АЧС проводили в программе PVS (Protein Variability Server) (www.imed.med.ucm.es/PVS/) по методу Симпсона. Порог вариабельности выбран 0,46, согласно рекомендациям к программе.
Анализ консервативности эпитопов проводили в базе данных Epitope Conservancy Analysis с помощью алгоритма Epitope Conservancy Analysis (http:// tools.iedb.org/conservancy/) при установленных стандартных параметрах.
Результаты
На первом этапе работы была смоделирована стратегия поиска и анализа B- и T-клеточных эпитопов в белке СD2v вируса АЧС. Для идентификации иммунных эпитопов была использована аминокислотная последовательность белка CD2v вируса АЧС штамма Georgia 2007/1. Выбор в пользу данного штамма объясняется тем, что, несмотря на длительный период циркуляции вируса на территории России (12 лет), современные штаммы и изоляты вируса АЧС сохраняют свою генетическую однородность и вирулентные свойства. Анализируя аналогичные работы [15-18], нами были выбраны часто применяемые инструменты биоинформатики для поиска и интерпретации B-и T-клеточных эпитопов, которые были использованы для анализа антигена вируса АЧС. В результате была сформирована блок-схема дизайна исследования (рис. 1), которая позволила нам реализовать задачи и этапы исследования.
Прогнозирование B-клеточных эпитопов
Известно, что антигенные эпитопы, способные индуцировать иммунитет обоих типов (В- и Т-клеточ-ный), - хорошие кандидаты для разработки синтетических пептидных вакцин, иммунодиагностических тестов и выработки антител [9, 10]. Начальным этапом конструирования вакцин является предсказание В-клеточных эпитопов. Аминокислотная последовательность белка CD2v была подвергнута in silico прогнозированию на наличие B-клеточных эпитопов с помощью программы BCPred, с использованием метода прогнозирования линейных эпитопов в указанных B-клетках.
Методы BCPred и AAP (аминокислотная пара) довольно часто используют для прогнозирования В-кле-
Первичная последовательность CD2v штамма
Georgia 2007/1 вируса АЧС Primary sequence of CD2v strain Georgia 2007/1 of African swine fever virus
I
Анализ иммуногенности в программе VaxiJen immunogenicity analysis in the VaxiJen program
,_I_,
+ I
Анализ вариабельности первичной последовательности CD2v среди изолятов и штаммов вируса АЧС в программе PVS
Analysis of variability of the primary sequence of CD2v among ASF virus isolates and strains in the PVS program
Анализ консервативности иммуноэпитопов в базе данных The Immune epitope database (IEDB) 3.0
Analysis of the conservatism of immunoepitopes in the The Immune epitope database (IEDB) 3.0
5
Графическое распределение B- и T- клеточных эпитопов белка CD2 штамма Georgia 2007/1 вируса АЧС Graphic distribution of B- and T- of cell epitopes of the CD2 protein of strain Georgia ASF virus
Рис. 1. Дизайн исследования. АЧС - африканская чума свиней.
Fig. 1. Study design.
ASF is African swine fever.
точных эпитопов фиксированной длины [19]. В нашем случае с помощью комбинации BCPred + AAP анализировали всю последовательность белка CD2v вируса АЧС (402 аа) на наличие линейных эпитопов длиной 20 аа, без перекрытия и с учётом специфичности не менее 75%.
Нами показано наличие девяти прогнозируемых В-клеточных эпитопов (табл. 1), имеющих высокие показатели прогнозирования - от 0,99 до 1,00 балла. Кроме того, было продемонстрировано, что большинство B-эпитопов находится во внецитоплазматиче-ском домене (пять из девяти), они располагаются в позициях стартовых аминокислот 63, 104, 133, 154, 176.
Далее все девять эпитопов были проверены на им-муногенность с помощью программы Vaxijen [20]. При анализе учитывали только пептиды с показателями выше порогового значения (0,5). Так, четыре из девяти анализируемых эпитопов имеют наибольший количественный показатель прогнозирующей способности (AUCroc), который варьируется от 0,5 для случайного прогноза до 1,0 для идеального прогноза. Можно отметить, что обнаруженные пептиды располагаются как в цитоплазматической, так и во внецито-плазматической части исследуемого белка. Наиболее иммуногенным представлен пептид в позиции 176-й
аминокислоты, имеющий AUCroc = 0,9935. При рассмотрении локализации данного эпитопа также выделяется его внецитоплазматическое расположение в последовательности белка CD2v вируса АЧС. Таким образом, нами выделены четыре из девяти В-клеточных эпитопов белка CD2v вируса АЧС.
Прогнозирование Т-клеточных эпитопов
Рассматривая возможность дальнейшего создания пептидной вакцины, представляется логичным использование только внецитоплазматической части первичной последовательности белка CD2v вируса АЧС. Анализ секреторной части CD2v с 17-й по 204-ю аминокислоту проводили в программе NetCTLpan версия 1.1 только для MHC I [21], согласно параметрам программы, установленным по умолчанию: длина пептида - 9 аа; анализ проводили для свиных аллелей (SLA); порог идентификации пептида - 1,0; порог протеосомального расщепления (Cle) - 0,225; эффективность транспорта TAP (Transporter associated with antigen processing) - 0,025.
Вся последовательность CD2v была разделена на 196 пептидов длиной 9 аа каждый. В результате анализа пептиды-лиганды MHC I были выявлены в 33 аллелях: SLA-1*0201, SLA-1*0202, SLA-1*0401,
ORIGINAL RESEARCH
Таблица 1. In silico прогнозирование и анализ иммуногенности В-клеточных эпитопов белка CD2v вируса африканской чумы свиней Table 1. In silico prediction and analysis of the immunogenicity of B-cell epitopes of the African swine fever virus CD2v protein
Позиция аминокислот Amino acid position Эпитоп Epitope Показатель BCPred + AAP Score BCPred + AAP Показатель AUCroc Vaxijen Score AUCroc Vaxijen Иммуногенность Vaxijen Immunogenicity Vaxijen
232-254 RKRKKHVEEIESPPPSESNE 1 0,5939 ++
371-390 SPPKPLPSIPLLPNIPPLST 1 0,3747
154-177 DTNGDILNYYWNGNNNFTAT 1 0,2424 -
290-312 PSTQPLNPFPLPKPCPPPKP 1 0,4064 +
104-126 DKKINYTVKLLKSVDSPTIT 1 0,5040 ++
266-286 SPREPLLPKPYSRYQYNTPI 1 0,2061
176-196 INNTISSLNETENINCTNPI 1 0,9935 +++
133-154 CKNNNGTNVNIYLIINNTIV 1 0,0938 -
63-83 GNYCSCCGHNISLYNTTNNC 0,99 0,1204 -
Примечание. BCPred + AAP - показатель прогнозирования линейного эпитопа, где максимальное значение 1 балл; AUCroc Vaxijen -количественный показатель прогнозирующей способности, варьируется от 0,5 для случайного прогноза до 1,0 для идеального прогноза, пороговое значение 0,5; серым цветом выделены эпитопы в цитоплазматическом домене; белым цветом представлены эпитопы во внецито-плазматическом домене; жирным шрифтом выделены эпитопы, имеющие прогнозируемую иммуногенность.
Note. BCPred + AAP - indicator of prediction of the linear epitope, where the maximum value is 1 point; AUC Vaxijen - a quantitative indicator of predictive ability, which ranging from 0.5 for a random prediction, to 1.0 for an ideal prediction. A threshold value 0.5; epitopes in the cytoplasmic domain are highlighted in gray; epitopes in the extracytoplasmic domain are highlighted in white; epitopes with predicted immunogenicity are shown in bold font.
Рис. 2. Результаты анализа вариабельности белка CD2v вируса африканской чумы свиней. Fig. 2. Results of variability analysis of protein CD2v of African swine fever virus.
SLA-1*0501, SLA-1*0601, SLA-1*0701, SLA-1*0702, SLA-1*0801, SLA-1*1101, SLA-1*1301, SLA-2*0101, SLA-2*0301, SLA-2*0302, SLA-2*0401, SLA-2*0402, SLA-2*0501, SLA-2*0502, SLA-2*0701, SLA-2*1002, SLA-2*1201, SLA-3*0101, SLA-3*0301, SLA-3*0302, SLA-3*0303, SLA-3*0304, SLA-3*0401, SLA-3*0601, SLA-3*0701, SLA-6*0101, SLA-6*0102, SLA-6*0103, SLA-6*0104 и SLA-6*0105. В общей сложности всего было определено 53 пептида, способные связываться с MHC I (табл. 2).
Затем были выделены пептиды, имеющие перекрёстное связывание с несколькими аллелями MHC I (табл. 3). Так, пептид YYWNGNNNF способен связывать 13 аллелей с MHC I, SVDSPTITY - 10 аллелей, YGGLFWNTY - 8 аллелей, ITYNCTNSL - 5 аллелей, STLFYIIIF - 4 аллели, GGLFWNTYY - 4 аллели, NTEIFNRTY - 3 аллели, DTNGDILNY - 3 аллели, остальные 6 пептидов способны связываться только с одной аллелью.
Далее мы искали аминокислотные последовательности белка CD2v в базе данных Uniprot (www.uniprot. org). В результате идентифицированы 103 источника первичной последовательности белка CD2v вируса АЧС. Множественное выравнивание полноразмерных последовательностей целевого белка CD2v различных штаммов и изолятов вируса АЧС
позволило определить от 51,5 до 100% гомологии. Затем сравнительный анализ 103 последовательностей белка CD2v в формате FASTA был использован для анализа вариабельности. Вариабельность белка CD2v вируса АЧС анализировали в программе PVS (Protein Variability Server) (www.imed.med.ucm.es/ PVS/). Для анализа вариабельных областей был использован метод Симпсона, основанный на расчёте индекса разнообразия аминокислотных последовательностей в пропорциях [22]. Индекс описывает вероятность того, что две последовательности с заменами, выбранные случайным образом, будут схожи с остальными аминокислотными последовательностями. Значения этого индекса находятся в диапазоне от 0 до 1 и тем больше, чем разнообразнее образцы. В нашем случае эталонной считалась консен-сусная последовательность белка CD2v вируса АЧС. Порог изменчивости был установлен на уровне 0,46, как рекомендовано инструкцией.
Анализ вариабельности белка CD2v вируса АЧС (рис. 2) показал, что наиболее вариабельной областью является внеклеточная часть белка. Подробно рассматривая секреторную область, можно выделить участок со 130-й по 260-ю аминокислоту, имеющий наибольший профиль изменчивости. Однако в секреторной области встречаются и отдельные локусы, ко-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 2. In silico прогнозирование T-клеточных эпитопов белка CD2v вируса африканской чумы свиней Table 2. In silico prediction of T-cell epitopes of the African swine fever virus CD2v protein
Аллель Пептид Показатель MHC I Показатель TAP Показатель Cle Показатель Comb Оценка достоверности
Allele Peptide Score MHC I Score TAP Score Cle Score Comb Reliability index
SLA-1*0201 SVDSPTITY 0,40300 3,04100 0,97851 0,69919 0,80
SLA-1*0202 SVDSPTITY 0,40300 3,04100 0,97851 0,69919 0,80
SLA-1*0401 NTEIFNRTY 0,17800 2,93700 0,96077 0,46760 0,80
SLA-1*0401 SVDSPTITY 0,21800 3,04100 0,97851 0,51419 0.40
SLA-1*0401 ITYNCTNSL 0,21700 1,15300 0,96219 0,46232 0.80
SLA-1*0501 YGGLFWNTY 0,15300 2,48500 0,93511 0,42552 0,80
SLA-1*0501 YYWNGNNNF 0,21300 3,09200 0,96218 0,50679 0,15
SLA-1*0601 SVDSPTITY 0,24100 3,04100 0,97851 0,53719 0,80
SLA-1*0701 SVDSPTITY 0,18100 3,04100 0.97851 0,47719 0,80
SLA-1*0701 DTNGDILNY 0,24500 2,63400 0.81970 0,49528 0,80
SLA-1*0702 SVDSPTITY 0,18100 3,04100 0,97851 0,47719 0,80
SLA-1*0702 DTNGDILNY 0,24500 2,63400 0,81970 0,49528 0,80
SLA-1*0801 SVDSPTITY 0,22300 3,04100 0,97851 0,51919 0,80
SLA-1*1101 YGGLFWNTY 0,10000 2,48500 0,93511 0,37252 0,80
SLA-1*1101 YYDNNRSNF 0,08400 2,61300 0,94314 0,36153 0,80
SLA-1*1101 YYWNGNNNF 0,10300 3,09200 0,96218 0,39679 0,30
SLA-1*1301 YYWNGNNNF 0,19700 3,09200 0,96218 0,49079 0.,80
SLA-2*0101 STLFYIIIF 0,19700 2,63200 0,66679 0,41283 0,80
SLA-2*0301 ITYNCTNSL 0,26900 1,15300 0,96219 0,51432 0,40
SLA-2*0302 SVDSPTITY 0,22700 3,04100 0,97851 0,52319 0,80
SLA-2*0401 YGGLFWNTY 0,16600 2,48500 0,93511 0,43852 0,80
SLA-2*0401 NTEIFNRTY 0,16400 2,93700 0,96077 0,45360 0,80
SLA-2*0401 DTNGDILNY 0,18500 2,63400 0,81970 0,43528 0,80
SLA-2*0402 NIFTINDTY 0,08600 3,34300 0,87245 0,36588 0,80
SLA-2*0402 YGGLFWNTY 0,09700 2,48500 0,93511 0,36952 0,80
SLA-2*0402 TYCGIAGNY 0,11600 3,07200 0,96286 0,40944 0,20
SLA-2*0402 YYWNGNNNF 0,10200 3,09200 0,96218 0,39579 0,30
SLA-2*0501 ITYNCTNSL 0,14200 1,15300 0,96219 0,38732 0,80
SLA-2*0502 ITYNCTNSL 0,30800 1,15300 0,96219 0,55332 0,30
SLA-2*0701 VFLNNIFTI 0,14600 0,79200 0,87718 0,36317 0,40
SLA-2*0701 SVDSPTITY 0,05000 3,04100 0,97851 0,34619 0,80
SLA-2*0701 YYWNGNNNF 0,06500 3,09200 0,96218 0,35879 0,80
SLA-2*1002 SVDSPTITY 0,29000 3,04100 0,97851 0,58619 0,80
SLA-2*1201 ITYNCTNSL 0,12700 1,15300 0,96219 0,37232 0,80
SLA-3*0101 KYQNYLSTL 0,29000 1,34200 0,78452 0,50007 0,80
SLA-3*0301 YGGLFWNTY 0,23700 2,48500 0,93511 0,50952 0,80
SLA-3*0301 GGLFWNTYY 0,21400 2,44500 0,93864 0,48632 0,80
SLA-3*0301 YYWNGNNNF 0,19500 3,09200 0,96218 0,48879 0,80
SLA-3*0302 NIFTINDTY 0,15300 3,34300 0,87245 0,43288 0,80
SLA-3*0302 YGGLFWNTY 0,21700 2,48500 0,93511 0,48952 0,30
SLA-3*0302 NTEIFNRTY 0,15500 2,93700 0,96077 0,44460 0,80
SLA-3*0302 YYWNGNNNF 0,16200 3,09200 0,96218 0,45579 0,80
SLA-3*0302 YQNYLSTLF 0,38700 2,59700 0,09834 0,47405 0,40
SLA-3*0303 YGGLFWNTY 0,23700 2,48500 0,93511 0,50952 0,80
SLA-3*0303 GGLFWNTYY 0,21400 2,44500 0,93864 0,48632 0,80
SLA-3*0303 YYWNGNNNF 0,19500 3,09200 0,96218 0,48879 0,80
SLA-3*0304 YGGLFWNTY 0,25800 2,48500 0,93511 0,53052 0,40
SLA-3*0304 GGLFWNTYY 0,24300 2,44500 0,93864 0,51532 0,80
SLA-3*0401 STLFYIIIF 0,45200 2,63200 0,66679 0,66783 0,20
SLA-3*0601 GGLFWNTYY 0,33100 2,44500 0,93864 0,60332 0,80
SLA-3*0601 STLFYIIIF 0,38000 2,63200 0,66679 0.59583 0,80
SLA-3*0701 STLFYIIIF 0,39600 2,63200 0,66679 0,61183 0,80
SLA-6*0101 YYWNGNNNF 0,24100 3,09200 0,96218 0,53479 0,30
SLA-6*0102
SLA-6*0103
SLA-6*0104
SLA-6*0105
ORIGINAL RESEARCH
Таблица 3. T-клеточные эпитопы белка CD2v вируса африканской чумы свиней, имеющие перекрёстное связывание с аллелями MHC I Table 3. T-cell epitopes of African swine fever virus CD2v protein cross-linked with MHC I alleles
№ Пептид Peptide Аллель Allele Показатель иммуногенности Score Immunogenicity Иммуногенный потенциал Immunogenic potential
1 YYWNGNNNF SLA-1*0501, SLA-1*1101, SLA-1*1301, SLA-2*0402, SLA-2*0701, SLA-3*0301, SLA-3*0302, SLA-3*0303, SLA-6*0101, SLA-6*0102, SLA-6*0103, SLA-6*0104, SLA-6*0105 0,0134 -
2 SVDSPTITY SLA-1*0201, SLA-1*0202, SLA-1*0401, SLA-1*0601, SLA-1*0701, SLA- 1*0702,SLA-1*0801, SLA-2*0302, SLA-2*0701, SLA-2*1002 -0,2392 -
3 YGGLFWNTY SLA-1*0501, SLA-1*1101, SLA-2*0401, SLA-2*0402, SLA-3*0301, SLA-3*0302, SLA-3*0303, SLA-3*0304 0,1467 -
4 ITYNCTNSL SLA-1*0401, SLA-2*0301, SLA-2*0501, SLA-2*0502, SLA-2*1201 0,5662 +
5 STLFYIIIF SLA-2*0101, SLA-3*0401, SLA-3*0601, SLA-3*0701 -0,0831
6 GGLFWNTYY SLA-3*0301, SLA-3*0303, SLA-3*0304, SLA-3*0601 0,1157 -
7 NTEIFNRTY SLA-1*0401, SLA-2*0401, SLA-3*0302 0,0108 -
8 DTNGDILNY SLA-1*0701, SLA-1*0702, SLA-2*0401 -0,1999 -
9 YYDNNRSNF SLA-1*1101 0,5656 +
10 NIFTINDTY SLA-2*0402 0,5329 +
11 TYCGIAGNY SLA-2*0402 1,3006 +++
12 VFLNNIFTI SLA-2*0701 -0,2956 -
13 KYQNYLSTL SLA-3*010 0,5117 +
14 YQNYLSTLF SLA-3*0302 -0,0829 -
Рис. 3. Графическое распределение B- и Т-клеточных эпитопов белка CD2v штамма Georgia 2007/1 вируса африканской чумы свиней. Fig. 3. Image of positions of B- and T-cell epitopes in CD2v protein of strain Georgia 2007/1 African swine fever virus.
торые имеют низкий показатель изменчивости и являются консервативными среди выборки штаммов и изолятов вируса АЧС. Наиболее консервативный профиль гетерогенности имеет C-концевая часть белка, которая характерна для цитоплазматической локализации.
Результаты определения вариабельности белка CD2v вируса АЧС легли в основу следующего исследования по анализу консервативности иммунных эпитопов. Консервативность эпитопов анализировали в базе данных иммуноэпитопов The immune epitope database (IEDB) 3.0 с помощью алгоритма Epitope Conservancy Analysis [23] и оценки линейных эпитопов с порогом идентичности последовательности не менее 100%. Консервацию эпитопа выражали в процентах (табл. 4) с полностью гомологичными ему последовательностями относитель-
но всей исследуемой выборки штаммов и изолятов вируса АЧС.
Как видно из результатов анализа консервативности, представленных в табл. 4, для четырёх B-клеточных эпитопов характерен диапазон консервативности от 50 до 100%. Наиболее консервативным является эпитоп PSTQPLNPFPLPKPCPPPKP, локализующийся в позиции от 290-й аминокислоты и имеющий 100% показатель гомологии. Наиболее вариабельным эпитопом оказался пептид DKKINYTVKLLKSVD SPTIT, локализующийся в позиции от 104-й аминокислоты и име-щий 50% показатель гомологии.
Так, в конце исследования нами была сформирована карта распределения идентифицированных иммунных эпитопов на первичной последовательности белка CD2 вируса АЧС (рис. 3), принадлежащих к современным полевым изолятам вируса АЧС, штамма Georgia 2007/1.
Таблица 4. Консервативность T- и B-клеточных эпитопов белка CD2v в штаммах и изолятах вируса африканской чумы свиней Table 4. Conservation of T-and B-cell epitopes of CD2v protein in strains and isolates of African swine fever virus
№ Позиция аминокислот Amino acid position Последовательность Sequence Иммуногенность Immunogenicity Консервативность эпитопов,% Conservation of epitopes,%
B-клеточные эпитопы
B-cell epitopes
1 232-254 RKRKKHVEEIESPPPSESNE ++ 80
2 290-312 PSTQPLNPFPLPKPCPPPKP + 100
3 104-126 DKKINYTVKLLKSVDSPTIT ++ 50
4 176-196 INNTISSLNETENINCTNPI +++ 65
T-клеточные эпитопы
T-cell epitopes
1 122-131 ITYNCTNSL + 88,89
2 48-57 YYDNNRSNF + 44,44
3 32-41 NIFTINDTY + 44
4 57-66 TYCGIAGNY +++ 55,56
5 197-206 KYQNYLSTL + 33,33
Таблица 5. In silico прогнозирование структурных В-клеточных эпитопов белка CD2v вируса африканской чумы свиней Table 5. In silico prediction of structural B-cell epitopes of the African swine fever virus CD2v protein
Позиция аминокислоты, Amino acid position Аминокислотный остаток Amino acid Количество контактирующих остатков аминокислот Amount of contact amino acid Скоринг приближённости Score proximity Скоринг DiscoTop Score DiscoTop
21 VAL 9 -2,943 -3,639
32 LYS 0 -1,863 -1,648
40 ASN 1 -3,15 -2,903
80 PRO 10 -2,242 -3,134
81 ASN 12 -1,309 -2,538
83 THR 0 -0,447 -0,395
84 ASP 8 -0,935 -1,747
128 LYS 0 -4,154 -3,676
Рис. 4. 3D-модель структуры растворимой области белка CD2v вируса африканской чумы свиней штамма Georgia 2007/1, прогнозируемая сервером I-Tasser (а), и прогнозируемые структурные В-клеточные эпитопы белка CD2v вируса африканской чумы свиней в
3D-формате (б).
Области В-клеточных эпитопов показаны чёрным цветом.
Fig. 4. 3D model of the structure of soluble region of CD2v protein of strain Georgia 2007/1 African swine fever virus, predicted by server I-Tasser (a), and predicted structural B-cell epitopes of African swine fever virus CD2v protein in 3D format (b).
Areas of B-cell epitopes are shown in black.
Прогнозирование структурных B-клеточных эпитопов
Для поиска структурных B-клеточных эпитопов была смоделирована предполагаемая 3D-модель растворимой области белка CD2v вируса АЧС штамма Georgia 2007/1. Используя программу I-Tasser, удалось получить несколько прогнозируемых 3D-структур
исследуемого белка, из которых модель 1СС2 pdb (рис. 4, а) обладала наибольшей структурной гомологией с белком CD2v. Модель трёхмерной структуры белка CD2v вируса АЧС - 1СС2 была использована в качестве матрицы для поиска конформаци-онных В-клеточных эпитопов. С помощью сервера DiscoTope 2.0 и 3D-модели 1СС2 pdb были идентифи-
ORIGINAL RESEARCH
цированы 8 участков прогнозируемых B-клеточных эпитопов (см. рис. 4, б; табл. 5).
Обсуждение
Ранее авторами [12, 13] было установлено, что белок CD2v вируса АЧС способен модулировать иммунный ответ и является неотъемлемым компонентом защиты. В связи с этим обнаружить наличие T-и B-клеточных эпитопов в белке CD2v вируса АЧС с использованием методов in silico прогнозирования стало актуальной задачей.
Прогнозирование в программе BCPred с дополнительным анализом AAP является основным методом, который позволяет предсказать наличие B-клеточных эпитопов в исследуемом белке. Нами выявлено 9 предполагаемых B-клеточных эпитопов. Дополнительный анализ иммуногенности в программе Vaxijen для выявленных пептидов позволил сузить круг пептидов до четырёх основных, несущих свойства антигенности. Иммуно-генные В-клеточные эпитопы локализуются как во вне-цитоплазматической, так и во внутриплазматической части белка CD2v. Таким образом, были определены эпитопы (RKRKKHVEEIESPPPSESNE, PSTQPLNPFPL PKPCPPPKP, DKKINYTVKLLKSVDSPTIT, INNTISSL NETENINCTNPI), которые входят в состав антигена CD2v и могут активировать B-клеточный иммунитет.
Далее был проведён анализ для идентификации Т-клеточных эпитопов, способных связываться с молекулой MHC I. К сожалению, отсутствие референсной трёхмерной структуры белка CD2v, а также in silico серверов с базами данных аллелей свиньи не позволяет оценить наличие структурных конформационных T-клеточных эпитопов. Так, нами выявлено 53 линейных эпитопа только во внецитоплазматической области белка CD2v вируса АЧС. Пептиды, которые связываются с различными аллелями MHC I и одновременно имеют сайт расщепления протеосом на C-конце (Cle), высокоэффективны в прогнозировании Т-клеточных эпитопов. Применение анализа иммуногенности в программе Vaxijen позволило выявить Т-пептиды с большим иммуногенным потенциалом. В результате были выделены следующие пептиды, которые, по нашему мнению, заслуживают особого внимания для активации Т-клеточного ответа: ITYNCTNSL, YYDNNRSNF, NIFTINDTY, TYCGIAGNY, KYQNYLSTL.
Анализируя достоверность результатов идентификации T-клеточных эпитопов, G. Burmakina и соавт. [13] идентифицировали четыре кластера Т-клеточ-ных эпитопа белка CD2v, показавших интерферо-новый ответ на стимуляцию синтетическим пептидами клеток PBMC (peripheral blood mononuclear cell). Два Т-эпитопа были локализованы во внецито-плазматической области белка CD2v и затрагивали иммуноглобулин-подобный домен. Таким образом, подтверждено, что белок CD2v штамма Congo K-49 вируса АЧС имеет Т-клеточные эпитопы, способные активировать клетки CD4+ и CD8+. Кроме того, некоторые из этих пептидов совпали с in silico прогнозированием в программе CTLPred, что ещё раз доказывает обоснованность использования вычис-
лительных моделей и алгоритмов для поиска поли-эпитопных антигенов.
Выявление конформационных B-эпитопов растворимой области белка CD2v позволило идентифицировать восемь структурных эпитопов. Это позволяет ещё раз убедиться в способности антигена CD2v вируса АЧС активировать B-клеточный иммунитет.
Учитывая возможность создания препарата для профилактики АЧС с помощью технологии рекомбинант-ных белков, нужно рассматривать структурные и физико-химические особенности данного белка, в частности, использования только растворимой области. Как упоминалось ранее, эпитопы, способные индуцировать иммунитет обоих типов (В- и Т-клетки), являются хорошими кандидатами для создания вакцины.
Заключение
Результаты анализа in silico прогнозирования В-и Т-клеточных эпитопов позволяют сделать вывод о том, что аминокислотная последовательность с 17-й по 204-ю аминокислоту белка CD2v вируса АЧС может быть включена в конструкцию полиэпитопной B-и Т-клеточной вакцины против АЧС.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 2, 3, 5-22 см. REFERENCES)
1. Середа А.Д. Белки вируса африканской чумы свиней. Научный журналКубГАУ. 2012; 3(77): 1-12. Available at: http://ej.kubagro. ru/2012/03/pdf/35.pdf 4. Власова Н.Н. Перспективы использования методов молекулярной иммунологии и генной инженерии в системе мер по борьбе с африканской чумой свиней (обзор). Сельскохозяйственная биология. 2012; 47(4): 22-30. 23. Мима К.А., Бурмакина Г.С., Титов И.А., Малоголовкин А.С. Иммунологически значимые гликопротеины p54 и CD2v вируса африканской чумы свиней: биоинформатический анализ генетических вариаций и гетерогенности. Сельскохозяйственная биология. 2015; 50(6): 785-93.
DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.6.785rus
REFERENCES
1. Sereda A.D. Proteins of African swine fever virus. Nauchnyy zhur-nal KubGAU. 2012; 3(77): 1-12. Available at: http://ej.kubagro. ru/2012/03/pdf35.pdf (in Russian)
2. Gogin A., Gerasimov V., Malogolovkin A., Kolbasov D. African swine fever in the North Caucasus region and the Russian Federation in years 2007-2012. Virus Res. 2013; 173(1): 198-203. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.12.007
3. Barderas M.G., Rodriguez F., Gomez-Puertas P., Aviles M., Beitia F., Alonso C., et al. Antigenic and immunogenic properties of a chimera of two immunodominant African swine fever virus proteins. Arch. Virol. 2001; 146(9): 1681-91.
DOI: http://doi.org/10.1007/s007050170056
4. Vlasova N.N. Prospects of molecular immunology and genetic engineering in control of African swine fever (review). Sel'skokhozyayst-vennaya biologiya. 2012; 47(4): 22-30. (in Russian)
5. Han T., Marasco W. A. Structural basis of influenza virus neutralization. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2011; 1217: 178-90.
DOI: http://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2010.05829.x
6. Zsak L., Onisk D.V., Afonso C.L., Rock D.L. Virulent African swine fever virus isolates are neutralized by swine immune serum and by monoclonal antibodies recognizing a 72-Kda viral protein. Virology. 1993; 196(2): 596-602.
DOI: http://doi.org/10.1006/viro.1993.1515
7. Escribano J.M., Galindo I., Alonso C. Antibody-mediated neutralization of African swine fever virus: Myths and facts. Virus Res. 2013; 173(1): 101-9.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.10.012
8. Neilan J.G., Zsak L., Lu Z., Burrage T.G., Kutish G.F., Rock D.L. Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteins p30, p54, and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection. Virology. 2004; 319(2): 337-442.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.virol.2003.11.011
9. Thomson S.A., Elliott S.L., Sherritt M.A., Sproat K.W., Coupar B.E., Scalzo A.A., et al. Recombinant polyepitope vaccines for the delivery of multiple CD8 cytotoxic T cell epitopes. J. Immunol. 1996; 157(2): 822-6.
10. Khalili S., Jahangiri A., Borna H., Ahmadi Zanoos K., Amani J. Computational vaccinology and epitope vaccine design by im-munoinformatics. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 2014; 61(3): 285-307.
DOI: http://doi.org/10.1556/AMicr.61.2014.34
11. Takamatsu H.H., Denyer M.S., Lacasta A., Stirling C.M., Argi-laguet J.M., Netherton C.L., et al. Cellular immunity in ASFV responses. Virus Res. 2013; 173(1): 110-21.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.11.009
12. Burmakina G., Malogolovkin A., Tulman E.R., Zsak L., Delhon G., Diel D.G., et al. African swine fever virus serotype-specific proteins are significant protective antigens for African swine fever. J. Gen. Virol. 2016; 97(7): 1670-5.
DOI: http://doi.org/10.1099/jgv.0.000490
13. Burmakina G., Malogolovkin A., Tulman E.R., Xu W., Delhon G., Kolbasov D., et al. Identification of T-cell epitopes in African swine fever virus CD2v and C-type lectin proteins. J. Gen. Virol. 2019; 100(2): 259-65.
DOI: http://doi.org/10.1099/jgv.0.001195
14. Crosby K., Yatko C., Dersimonian H., Pan L., Edge A.S. A novel monoclonal antibody inhibits the immune response of human cells against porcine cells: identification of a porcine antigen homologous to CD58. Transplantation. 2004; 77(8): 1288-94.
DOI: http://doi.org/10.1097/01.tp.0000120377.57543.d8
15. Li X., Yang X., Jiang Y., Liu J. A novel HBV DNA vaccine based on T cell epitopes and its potential therapeutic effect in HBV transgen-ic mice. Int. Immunol. 2005; 17(10): 1293-302.
DOI: http://doi.org/10.1093/intimm/dxh305
16. Oyarzun P., Kobe B. Computer-aided design of T-cell epitope-based vaccines: Addressing population coverage. Int. J. Immunogenet. 2015; 42(5): 313-21.
DOI: http://doi.org/10.1111/iji.12214
17. Khan M.A., Hossain M.U., Rakib-Uz-Zaman S.M., Morshed M.N. Epitope-based peptide vaccine design and target site depiction against Ebola viruses: An immunoinformatics study. Scand. J. Immunol. 2015; 82(1): 25-34.
DOI: http://doi.org/10.1111/sji.12302
18. Soria-Guerra R.E., Nieto-Gomez R., Govea-Alonso D.O., Rosales-Mendoza S. An overview of bioinformatics tools for epitope prediction: Implications on vaccine development. J. Biomed. Inform. 2015; 53: 405-14.
DOI: http://doi.org/10.1016/jjbi.2014.11.003
19. Chen J., Liu H., Yang J., Chou K.C. Prediction of liniar B-cell epi-topes using amino acid pair antigenicity scale. Amino Acids. 2007; 33(3): 423-8.
DOI: http://doi.org/10.1007/s00726-006-0485-9
20. Doytchinova I.A., Flower D.R. VaxiJen: a server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC Bioinformatics. 2007; 8: 4.
DOI: http://doi.org/10.1186/1471-2105-8-4
21. Stranzl T., Larsen M.V., Lundegaard C., Nielsen M. NetCTLpan: pan-specific MHC class I epitope predictions. Immunogenetics. 2010; 62(6): 357-68.
DOI: http://doi.org/10.1007/s00251-010-0441-4
22. Bui H.H., Sidney J., Li W., Fusseder N., Sette A. Development of an epitope conservancy analysis tool to facilitate the design of epitope-based diagnostics and vaccines. BMC Bioinformatics. 2007; 8: 361.
DOI: http://doi.org/10.1186/1471-2105-8-361
23. Mima K.A., Burmakina G.S., Titov I.A., Malogolovkin A.S. African swine fever virus glycoproteins p54 and CD2v in the context of immune response modulation: bioinformatic analysis of genetic variability and heterogeneity. Sel'skokhozyaystvennaya biologiya. 2015; 50(6): 785-93.
DOI: http://doi.org/http://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.6.785eng (in Russian)
