CC BY
23
НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В УРОЛОГИИ
УДК 577.21:599.9
© Л.З. Ахмадишина, Г.Ф. Корытина, О.В. Кочетова, М.М. Шаймухаметова, С.М. Измайлова, А.А. Измайлов, Т.В. Викторова, И.Р. Кабиров, 2015
Л.З. Ахмадишина1, Г.Ф. Корытина1, О.В. Кочетова1, М.М. Шаймухаметова2, С.М. Измайлова3, А.А. Измайлов3, Т.В. Викторова1'3, И.Р. Кабиров3 ПОИСК АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ VEGF, VCAM1, PECAM1, ICAM1 С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
ФГБУН «Институт биохимии и генетики» Уфимского научного центра РАН, г. Уфа 2ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет», г. Уфа 3ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа
Показана значимость полиморфных локусов генов VEGF, VCAM1 как маркеров риска развития неинвазивной формы рака мочевого пузыря. Локус rs5498 гена ICAM1 ассоциирован с риском развития как инвазивной, так и неивазивной формы опухоли мочевого пузыря вне зависимости от статуса курения.
Ключевые слова: рак мочевого пузыря, полиморфный локус гена, ассоциация.
L.Z. Akhmadishina, G. F. Korytina, O.V. Kochetova, M.M. Shaymukhametova, S.M. Izmailova, A.A. Izmailov, T.V. Viktorova, I.R. Kabirov SEARCH OF THE VEGF, VCAM1, PECAM1, ICAM1 GENE POLYMORPHISMS ASSOCIATION WITH BLADDER CANCER RISK
The research shows the significance of VEGF, VCAM1 gene polymorphisms as risk marker of non-invasive bladder cancer. Rs5498 ICAM1 gene polymorphism is associated with the risk of both invasive and non-invasive bladder cancer irrespective of smoking status.
Key words: bladder cancer, gene polymorphism, association.
Значительную роль в патогенезе злокачественных новообразований, в том числе и рака мочевого пузыря, играют специфические факторы роста клеток. Фактор роста эндотелия сосудов VEGF вовлечен в процесс новообразования сосудов в растущей опухоли.
VEGF секретируется опухолевыми клетками, стимулирует экспрессию молекул межклеточной адгезии 1 типа (ICAM1), молекул адгезии клеток сосудистого эндотелия 1 типа (VCAM-1) и молекул адгезии тромбоцитов (РЕСАМ-1) в эндотелиальных клетках. ICAMl-опосредованная адгезия лейкоцитов к эндотелию является ключевым этапом в раннем ангиогенезе и имеет важное значение в развитии эндотелиальной клеточной полярности, таким образом опосредуя миграцию эндо-телиальных клеток VCAM-1, которые, как полагают, выполняют аналогичную роль, что и ICAM-1, в то время как PECAM-1 регулирует и адгезию эндотелия, и миграцию, опосредованную межклеточными взаимодействиями [1].
VEGF-C и VEGF-D стимулируют пролиферацию, миграцию и выживаемость эндо-телиальных клеток in vitro. Было установлено, что VEGF индуцирует лимфоангиогенез и усиливает процесс метастазирования у трансгенных мышей и других модельных объектов in vivo [2]. Его высокая экспрессия характери-
зует интенсивность роста и большой метастатический потенциал опухоли.
Клеточная пролиферация, миграция и дифференциация являются важными в процессе развития организма. Координация всех этих процессов приводит к образованию сложных структур, таких как ткани и органы. Эти клеточные процессы происходят при тесном взаимодействии клеток друг с другом и микроокружением. Молекулы клеточной адгезии имеют большое значение в процессе развития и поддержания целостности архитектуры тканей у взрослых. В нормальной ткани экспрессия молекулы клеточной адгезии жестко регулируется. Однако дисбаланс молекул клеточной адгезии нарушает нормальные межклеточные взаимодействия и содействует формированию опухоли и метастазированию.
Поэтому целью нашего исследования было провести анализ ассоциации полиморфных локусов -2549 1/0 гена VEGF, интронного га 3917010 гена УСАМ1, га71647806 (Leul25Val) гена PECAM1, ^71647806 (Leu125Val) гена ICAM1 с риском развития инвазивного и неин-вазивного рака мочевого пузыря.
Материал и методы
Материалом для молекулярно-генетического анализа послужили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови стандартным фенольно-
хлороформным методом. Группу исследования составили 228 больных раком мочевого пузыря. Средний возраст больных 60,93±11,32 года. Индекс курения для курильщиков составил 29,37±14,61 пачек/лет. Все больные находились на стационарном лечении в урологических отделениях клинических больниц г. Уфы: Республиканской клинической больнице им. Куватова, Республиканского онкологического диспансера и клиники БГМУ - и были прооперированы в период с 2005 по 2014 годы. В соответствие с Международной классификацией Европейской ассоциации урологов [3] обследованные больные РМП были разделены на две группы в за-
Тип полиморфизма, последовательности праймеров
висимости от клинических форм заболевания: мышечно-инвазивная и мышечно-неинвазивная.
Контрольную группу составили 286 человек, жители Республики Башкортостан, отобранные по возрасту, полу и этнической принадлежности, без хронических заболеваний мочеполовой системы в анамнезе. Средний возраст 56,12±8,57 года. Индекс курения для курильщиков составил 20,79±15,11 пачек/лет.
Анализ полиморфных вариантов генов проводили методом ПЦР-ПДРФ и аллельспе-цифичной ПЦР. Условия проведения ПЦР и последовательность праймеров представлены в табл. 1.
Таблица 1
и номенклатура аллелей анализируемых ДНК-локусов
Ген полиморфизм (локализация) Праймеры 5'-3' (эндонуклеаза рестрикции) Аллели (размер фрагментов, п.о.)
VEGF -2549(18)I/D 5' конец GTGCTGAGGATGGGGCTGAC CAAAGTTGGGGCTCTGA *I(196) *D (178)
PECAM1 Rs668 Leu125Val CACAGCTGTTATTCACGCCA GATGTCAGCACCACCTCTCA (PvuII) 273 5 Leu 195_78_5 Val
VCAM1 rs3917010 A-ATCCTGTCAGTTCTACCTCAAAC C-ATCCTGTCAGTTCTACCTCAAAC Gen-CAGGAGCCCAAGTGAGAGATG R-TTACACCCCTGGGTCCTCTT 200 ВК 98 Аллель
ICAM1 469K/E rs5498 (экзон 6) TGCCCGAGCTCAAGTGTC GCCTGCAGTGCCCATTAT (Bsh1236I) *K (301) *E (127, 174)
Результаты амплификации оценивали при помощи вертикального электрофореза в 6-8% полиакриламидном геле (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида -29:1) при напряжении 200-300 В (10 В/см). В качестве буфера использовали трис-боратный буфер (ТВЕ). По окончании электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,1 мкг/мл) в течение 15 мин и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для идентификации аллелей использовали маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н. "100 bp DNA ladder" ("Сибэнзим").
Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакетов статистических программ, SNPstats [4]. Вычисляли средние величины количественных показателей и их стандартные ошибки (M ± m). При сравнении частот качественных признаков использовали критерий %2. Анализ ассоциации проводили с использованием расчета показателя отношения шансов (OR). При всех использованных методах анализа статистически значимыми считали различия при р<0,05. Для выявления ассоциации полиморфных локусов в различных моделях (аддитивной, доминантной, рецессивной, сверхдоминирования) использовали метод логистической регрессии. Гипотезу о значимости независимых факторов
проверяли на основе коэффициента ^ статистики и уровня значимости (рта1ие) для коэффициента 1 Экспоненту отдельного коэффициента регрессии (Р) интерпретировали как OR для логистической модели с расчетом 95% доверительного интервала (95%С1). Лучшую модель выбирали с использованием информационного критерия Акайке (А1С). Взаимодействие генетических локусов и фактора курения оценивали при помощи регрессионного анализа в программе SNPStats [4].
Результаты и обсуждение
Проведен анализ распределения частот полиморфных локусов предварительно отобранных генов фактора роста эндотелия сосудов VEGF (-2549 1/Б), молекулы адгезии клеток сосудистого эндотелия 1 типа УСЛМ1 (rs 3917010, интрон), молекулы адгезии тромбоцитов PECAM1 71647806, Leu125Val), молекулы межклеточной адгезии 1 типа ICAM1 (ге5498, K469E) в группах больных раком мочевого пузыря с инвазивной (127 человек) и неинвазивной формами (101 человек) заболевания, а также в контрольной выборке практически здоровых индивидов (286 человек).
В нашем исследовании ассоциации с риском развития рака мочевого пузыря по ло-кусу -2549 1/Б гена VEGF получено не было. Однако при отдельном анализе неинвазивной
формы заболевания было показано, что генотип II встречался чаще в выборке больных раком мочевого пузыря (29%), чем в группе здоровых индивидов (19,3%), p=0,05, OR=1,71, 95%CI (1,00-2,92). Анализ выборок курящих и некурящих статистически значимых различий не выявил.
Имеются данные об ассоциации функционально значимых полиморфных локусов гена VEGF с некоторыми видами опухолей. Исследованный нами полиморфный локус -2549 I/D находится в тесном сцеплении с локусом -2578 C/A [5]. Так, носители аллеля А по локусу -2578 C/A имеют инсерцию в 18 п.н., тогда как носители аллеля С-делецию. Показана ассоциация этого локуса с риском развития рака молочной железы [6-7], опухоли щитовидной железы и метастазами в региональные лимфоузлы у мужчин [8]. Cooper et al. (1999) в функциональных исследованиях in vitro показали, что присутствие делеции в промоторном регионе -2549 усиливает экспрессию гена VEGF [9]. Yang et al. (2003) показали, что конструкция, содержащая делецию в 18 п.н. имеет транскрипционную активность выше в 1,95 раза, по сравнению с той, которая содержит инсерцию [10].
VCAM-1 (молекула адгезии клеток сосудистого эндотелия 1 типа) очень тесно коррелирует с плотностью микрососудов в опухоли, способствует ее раннему рецидивированию и прогрессивному росту [11]. Эндотелиальный VCAM1, подобно ICAM1, связываясь с инте-грином альфа-4 бета-1 на поверхности циркулирующих опухолевых клеток, обеспечивает их прочную адгезию к эндотелиальной выстилке сосуда, способствуя последующей инвазии [12]. В 2009 году Dong et al показали, что гаплотип из 14 локусов гена VCAM1, одним из которых является rs3917010, ассоциирован с риском развития рака почки (OR=1,25, 95% CI (1,01-1,54)) [13]. Andrew et al (2014) на выборке американцев, проживающих на территории Нью-Хемпшира, показали ассоциацию вариантного аллеля локуса rs3176879 гена VCAM1 у больных раком мочевого пузыря с укороченным временем рецидивирования опухоли при иммунотерапевтическом лечении (Pinteractlon < 0.001, FDR 0,06) [14]. Сравнение наших выборок больных раком мочевого пузыря и здоровых индивидов показало отсутствие различий в распределении частот генотипов (%2=4,66, р=0,10) и аллелей (%2=0,02, р=0,88). Однако при анализе выборки больных с неивазивной формой рака мочевого пузыря была показана ассо-
циация с риском развития опухоли в модели сверхдоминирования (OR=1,72, 95% CI (1,022,88), р=0,04). Сравнительный анализ внутри выборок курящих и некурящих достоверных различий не показал.
PECAM1 - молекула адгезии тромбоцитов 1 типа - определялась в клеточных линиях солидных опухолей человека, мыши и крысы. Ген PECAM1 расположен на участке 17q23.3, содержит 16 экзонов, 1-8 экзоны кодируют экстрацеллюлярный домен, который ответственен за связывание PECAM1 с другими молекулами и миграцию клеток. Полиморфизм 373 C>G приводит к замене аминокислоты Leu на Val в положении 125. Имеются данные о том, что PECAM-1 (CD31), наряду с другими представителями молекул клеточной адгезии, ассоциирует с метастатической прогрессией при меланоме, глиоме, опухоли молочной железы, яичников, простаты и др. [15]. Однако в нашем исследовании статистически значимых ассоциаций ни с риском развития заболевания, ни с тяжестью течения показано не было.
ICAM1 - молекула межклеточной адгезии 1 типа - экспрессируется в эндотелиаль-ных клетках и клетках иммунной системы. Продукция белка ICAM-1 ('CD54') стимулируется цитокинами. Анализ локуса rs5498 гена ICAM1 выявил ассоциацию с риском развития рака мочевого пузыря в доминантной модели (OR=2,63, 95% CI (1,79-3,88), р<0,0001). Причем полученная ассоциация сохранялась как при анализе неинвазивной формы (OR=2,91, 95% CI (1,72-4,95), р<0.0001 в доминантной модели), так и при анализе инвазивной формы опухоли (0R=1,90, 95% CI (1,35-2,66), р=0,0002 в аддитивной модели). Полученные нами данные согласуются с результатами других исследований. Так, подобная ассоциация в доминантной модели была показана с риском развития рака ротовой полости у курильщиков (0R=1,341, 95% CI (1,060-1,697)) [16]. Cai et al (2014) установили, что минорный аллель G локуса rs5498 ассоциирован с высокой степенью злокачественности рака яичников (OR=2,650) [17].
Заключение
Таким образом, показана роль полиморфных локусов rs3917010 гена VCAM1 и rs 34357231 гена VEGF в развитии мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря. Тогда как локус rs5498 гена ICAM1 ассоциировал и с инвазивной, и с неинвазивной формами рака мочевого пузыря.
Сведения об авторах статьи: Ахмадишина Лейсан Зинуровна - к.б.н., н.с. лаборатории физиологической генетики ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН. Адрес: 450054, г. Уфа, Пр. Октября, 71. Тел./факс: 8(347)235-60-88. E-mail: l.akhmadishina@gmail.com.
Корытина Гульназ Фаритовна - д.б.н., доцент, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН. Адрес: 450054, г. Уфа, Пр. Октября, 71. E-mail: guly_kory@mail.ru. Кочетова Ольга Владимировна - к.б.н., научный сотрудник лаборатории физиологической генетики ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН. Адрес: 450054, г. Уфа, Пр. Октября, 71. E-mail: ecolab_203@mail.ru.
Шаймухаметова Мунира Мунировна - магистрант второго года обучения биологического факультета ФГБОУ ВПО БГУ. Адрес: 450074, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32. Тел. 8(347) 273-67-08. E-mail: ecolab 203@mail.ru.
Измайлова Светлана Михайловна - к.б.н., доцент кафедры биологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел./факс: (347) 272-11-60. E-mail: izmailovas73@mail.ru.
Измайлов Адель Альбертович - д.м.н., доцент кафедры урологии с курсом ИПО ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел./факс: 8(347) 272-11-60. E-mail: izmailov75@mail.ru.
Викторова Татьяна Викторовна - д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологической генетики ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, зав. кафедрой биологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел./факс: 8(347) 272-11-60. E-mail: t vict@mail.ru.
Кабиров Ильдар Раифович - ассистент кафедры урологии с курсом ИПО ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел./факс: 8(347) 272-11-60. E-mail: ildarkabirov@gmail.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. PECAM-1 regulates proangiogenic properties of endothelial cells through modulation of cell-cell and cell-matrix interactions / S. Park [et al.]// Am J Physiol Cell Physiol. - 2010. - № 299(6). - P. 1468-84.
2. Kleespies A. Clinical significance of VEGF-A, -C and -D expression in esophageal malignancies / A Kleespies, CJ Bruns, KW Jauch.// Onkologie. - 2005. - № 28(5). - P. 281-8.
3. European Association of Urology// Guidelines. -2013 edition.
4. SNPStats: a web tool for the analysis of association studies / X. Solé [et al.] // Bioinformatics. - 2006. - V 22(15). - P. 1928-1929.
5. Yuan Q. Association between promoter polymorphisms of vascular endothelial growth factor gene and sporadic Alzheimer's disease among Northern Chinese Han / Q Yuan, X Zuo, J. Jia // Neurosci Lett. - 2009. - № 457(3) - P. 133-6.
6. Association of polymorphisms of angiogenesis genes with breast cancer / BP. Schneider [et al.] // Breast Cancer Res Treat. - 2008. -№ 111(1). - P.157-63.
7. Association of VEGF and VEGFR1 polymorphisms with breast cancer risk in North Indians / Kapahi R. [et al.] //Tumour Biol. - 2015, Jan 22.
8. Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms in thyroid cancer / Hsiao PJ. [et al.]// J Endocrinol. - 2007. - № 195(2). - P. 265-70.
9. Increased renal expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor VEGFR-2 in experimental diabetes / Cooper ME. [et al.] // Diabetes. - 1999. - № 48(11). - P. 2229-39.
10. Polymorphisms of the vascular endothelial growth factor and susceptibility to diabetic microvascular complications in patients with type 1 diabetes mellitus / Yang B. [et al.] // J Diabetes Complications. - 2003. - № 17(1). P. 1-6.
11. Schlesinger M. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)-An increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis / M Schlesinger, G. Bendas // Int J Cancer. - 2014. - doi: 10.1002/ijc.28927.
12. Honn KV. Adhesion molecules and tumor cell interaction with endothelium and subendothelial matrix / KV Honn, DG. Tang // Cancer Metastasis Rev. - 1992. - № 11(3-4). - P. 353-75.
13. An analysis of growth, differentiation and apoptosis genes with risk of renal cancer / Dong LM. [et al.] // PLoS One. - 2009. -№ 4(3):e4895. doi: 10.1371/joumal.pone.0004895.
14. Genetic polymorphisms modify bladder cancer recurrence and survival in a USA population-based prognostic study / Andrew AS. [et al.] // BJU Int. -2015. - № 115(2). - P. 238-47.
15. Wai Wong C. The role of immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules in cancer metastasis / C Wai Wong, DE Dye, DR Coombe.// Int J Cell Biol. - 2012. - doi: 10.1155/2012/340296.
16. Combined effects of icam-1 single-nucleotide polymorphisms and environmental carcinogens on oral cancer susceptibility and clinicopathologic development / Lin CW. [et al.] // PLoS One. - 2013. - № 8(9): e72940. doi: 10.1371/journal.pone.0072940.
17. Prediction value of intercellular adhesion molecule-1 gene polymorphisms for epithelial ovarian cancer risk, clinical features, and prognosis / Cai G. [et al.] // Gene. - 2014. - № 546(1). - P. 117-23.
УДК 616-089.844
© Т.М. Жарикова, М.А. Газимиев, EA. Безруков, А.С. Греченков, 2015
Т.М. Жарикова, М.А. Газимиев, Е.А. Безруков, А.С. Греченков ТЕХНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БУККАЛЬНОЙ МЫШЦЕ- И НЕРВОСБЕРЕГАЮЩЕЙ ПЛАСТИКИ ЛУКОВИЧНОГО ОТДЕЛА УРЕТРЫ
ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, г. Москва
Заместительная пластика при стриктурах проксимальной части луковичного отдела уретры сопровождается пересечением бульбоспонгиозных мышц. Это может являться причиной появления постмикционного дриблинга и секвестрации спермы в послеоперационном периоде, что приводит к снижению качества жизни пациентов [2]. Шестнадцати пациентам была выполнена пластика луковичного отдела уретры с использованием слизистой оболочки ротовой полости с сохранением бульбоспонгиозных мышц и центрального сухожилия промежности. Применение мышце-и нервосберегающей методики может снизить вероятность развития данных осложнений [2]. Контрольное обследование на выраженность сексуальных расстройств и нарушений мочеиспускания проводилась на 4-, 8- и 12-й месяцы после операции с помощью опросника и исследования мышц тазового дна. Средний срок наблюдения составил 19,3 месяца (от 2 до 37 месяцев). Ни у одного пациента не было выявлено рецидива стриктуры или задержки жидкости в луковичном отделе уретры при микционной цистоуретро-графии. В данной работе мы попытались оценить технические аспекты выполнения заместительной мышце- и нервосбере-гающей уретропластики при стриктурах луковичного отдела уретры.
Ключевые слова: заместительная пластика, луковичный отдел уретры, постмикционный дриблинг, секвестрация спермы.
