CC BY
112
УДК 616.62-006.6-036-07:575.174.015.3
© Т.В. Викторова, А.А. Измайлов, С.М. Измайлова, В.Н. Павлов, Л.З. Ахмадишина, А. Т. Мустафин, М.Ф. Урманцев, А.А. Загидуллин, Ю.Н. Хризман, 2010
Т.В. Викторова1’2, А.А. Измайлов1, С.М. Измайлова1, В.Н. Павлов1,
Л.З. Ахмадишина2, А.Т. Мустафин1, М.Ф. Урманцев1, А.А. Загидуллин1, Ю.Н. Хризман1 АНАЛИЗ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ ЦИТОХРОМА Р450 (CYP1A1 И CYP1A2) С ПОВЕРХНОСТНЫМ И ИНВАЗИВНЫМ РАКОМ
МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ 1ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Росздрава, г. Уфа 2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
С целью выявления возможных ассоциаций полиморфных вариантов генов цитохрома Р450 с развитием инвазивных и поверхностных форм рака мочевого пузыря нами проведен анализ распределения генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов CYP1A1(А2455G), CYP1A2(С-163А и Т-2467delT) у больных раком мочевого пузыря (N=208), из них с поверхностными (N=104) и инвазивными (N=104) формами. Установлено, что маркерами риска инвазивного роста РМП являются аллель *2С полиморфного локуса A2455G гена CYP^^1(ОЯ=1.69) и аллель *Ю полиморфного локуса Т-2467delT гена CYP1A2(OR=1.96). Обнаружена ассоциация аллеля *М (0Я=0.59) полиморфного локуса A2455G гена CYP1A1, генотипа *1А*1А (0R=0.41) и аллеля *Ы (0R=0.51), полиморфного локуса Т-2467delT гена CYP1A2 с неинвазивным характером роста РМП.
Ключевые слова: рак, мочевой пузырь, онкомаркеры, полиморфные варианты
T.V. Victorova, AA. Izmailov, S.M. Izmailova, V.N. Pavlov,
L.Z. Akhmadishina, A.T. Mustafin, M.F. Urmanzev, A.A. Zagidullin, J.N. Hrizman ASSOCIATION ANALYSIS OF POLYMORPHIC P450 CYTOCHROME GENE MARKERS (CYP1A1 CYP1A2) WITH SUPERFICIAL BLADDER CANCER
AND INVASIVE BLADDER CANCER
To detect any possible associations of polymorphisms of the P450 cytochrome gene with development of invasive and superficial bladder cancer CYP1A1 (А2455G), CYP1A2 (С-163А and Т-2467delT) were genotyped in patients with bladder cancer (N=208) among them patients with superficial bladder cancer (N=104) and invasive bladder cancer (N=104). It was shown that CYP1A1 gene A2455G polymorphism loci *2С allele (OR=1.69) and CYP1A2 gene T-2467delT polymorphism loci *1D allele (OR=1.96) are risk markers of invasive bladder cancer. At the same time CYP1A1 gene A2455G polymorphism loci *2A allele (0R=0.59), CYP1A2 gene T-2467delT polymorphism loci *1A allele (0R=0.51) and M *M genotype (0R=0.41) were associated with superficial bladder cancer.
Key words: cancer, urinary bladder, oncomarkers, polymorphisms
В настоящее время рак мочевого пузыря (РМП) - одна из актуальных проблем в онкоурологии. РМП составляет 3% в структуре всех злокачественных новообразований. У мужчин данное заболевание встречается в 3 раза чаще, чем у женщин [2,9,14]. Стандартная лечебная тактика при поверхностном раке мочевого пузыря заключается в трансуретральной резекции опухоли и внутрипузырной химиоиммунотерапии. Однако до 85% поверхностных раков рецидивируют после лечения. Переход поверхностного рака в инвазивный наблюдается в 25-65% случаев. 3летняя выживаемость при первичном инвазивном раке во всем мире не превышает 67%, а при прогрессирующем из поверхностного -вполовину меньше (37%) [11,13,16]. Актуальной, окончательно не решенной проблемой в онкоурологии является прогнозирование риска прогрессии РМП. Формирование групп риска по прогрессированию заболевания основано на морфологических параметрах опухоли, таких как степень инвазии, степень дифференцировки, наличие или отсутствие CIS [13] Группировка больных по морфоло-
гическим критериям не полностью отражает биологический потенциал уротелиальной карциномы, в связи с этим большое значение приобретает поиск дополнительных генетических маркеров прогноза риска прогрессии при раке мочевого пузыря [6].
РМП - распространенное многофакторное, онкологическое заболевание с разнообразием факторов риска. Пусковым механизмом развития любого многофакторного заболевания является предрасположенность, провоцируемая разнообразными внешнесредовыми факторами, прежде всего химической природы. По данным литературы, к данным факторам риска РМП относятся канцерогены табачного дыма, полиароматические углеводороды (ПАУ), некоторые лекарственные препараты, объединенные общим названием ксенобиотики [1,5,19]. Генетический полиморфизм в генах детоксикации, ассоциированный с изменением соответствующих ферментов, может влиять на характер роста опухоли. Особого внимания заслуживают гены семейства цитохрома Р450 [14].
Цитохромы Р450 1А1 осуществляют биоактивацию проканцерогенов, в частности бензапирена и некоторых других ПАУ. Тран-зиция аденина на гуанин в положении 2455 в 7 экзоне гена CYP1A1 приводит к замене изолейцина на валин в аминокислотной последовательности каталитического центра фермента, в результате чего продуцируется энзим с активностью в 2 раза выше исходной [15]. По литературным данным, полиморфизм А24550 гена CYP1A1 ассоциирован с повышенным риском развития рака мочевого пузыря [8].
Субстратами для CYP1А2 являются гетероциклические амины, ариламины и нитро-зоамины, пищевые мутагены, ПАУ. Под действием ПАУ и сигаретного дыма происходит индукция СУР1А2, сопровождающаяся заметным увеличением уровня мРНК и количества белка. Наиболее функционально значимыми полиморфизмами гена CYP1А2 являются CYP1A2*1D(T-2467delT) и CYP1A2*1F (163 А/С) [17]. Установлено, что полиморфизм 1 интрона гена CYP1A2*1F приводит к изменению каталитической активности фермента и увеличению его индуцибельности. Что же касается других вариантов этого гена, в частности CYP1A2*1D, то их функциональная значимость недостаточно ясна. По данным 8аеЬ8е (1999), выявлены ассоциации CYP1A2*1F с риском развития рака мочевого пузыря и толстого кишечника [18].
Цель работы: анализ возможных ассоциаций генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов CYP1A1(A2455G) и CYP1A2(С-163А и Т-2467delT) с поверхностными и инвазивными формами РМП.
Материал и методы
Анализ проведен на выборке больных (п=208) с диагнозом РМП, находившихся на стационарном лечении в РКОД и РКБ г. Уфы в период с 2006 по 2009 гг. Средний возраст больных составил 59,71± 6,21 года. Выборка была разделена на две группы: больные с поверхностным (п=104) и инвазивным (п=104) РМП.
Материалом для исследования служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови. Экстракцию ДНК осуществляли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Анализ полиморфного локуса генов проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для исследования транзиции генов применяли метод ПЦР/ПДРФ (полиморфизм длин рест-
рикционных фрагментов). Результаты ПЦР и ПДРФ анализировали путем электрофореза в 7 % полиакриламидном геле.
Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием статистической программы BIOSTAT.
Разницу в распределении частот генотипов между группами рассчитывали с использованием критерия х2 с поправкой Иэйт-са. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
Силу ассоциаций маркеров с риском развития РМП оценивали по значениям показателя отношения шансов (odds ratio, OR). OR>1.5 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с аллелем или генотипом («фактор риска»), OR<0.5 - как отрицательную ассоциацию («фактор устойчивости»).
Результаты
Данные по распределению частот генотипов и аллелей полиморфного локуса A2455G гена CYP1A1 и полиморфных вариантов С-163А и Т-2467delT гена CYP1A2 в группах больных поверхностным и инвазивным РМП представлены в таблице.
Сравнительный анализ общей выборки больных РМП выявил статистически значимые различия в распределении частот генотипов и аллелей полиморфного локуса A2455G гена CYP1A1 у больных в зависимости от клинического течения РМП (х2=6,13, df=2, р=0,047 и х2=4,17, df=1, р=0,04 соответственно). Выявлено, что частота встречаемости генотипа *1A*1A у больных с поверхностным РМП выше (67,31%), чем у больных инвазивными формами РМП (55,77%) (х2=2,46, df=1, р=0,12). Одновременно было показано, что в группе больных инвазивным РМП частота генотипа *2С*2С увеличена до 6,73% по сравнению с группой больных неинвазивным РМП (0,96%) (х2=3,25, df=1, р=0,07). Однако статистической значимости данные результаты не достигли. Вместе с тем частота аллеля *2С увеличена почти в 2 раза у больных с инвазивным РМП (25,48%) по сравнению с больными поверхностным РМП (16,83%) (OR=1,69 95%CI 1,02-2,80), а аллель *1A чаще выявляется в группе с поверхностным ростом (83,17% против 74,52% у лиц с инвазивным характером роста) (х2=4,17, df=1, р=0,04) (OR=0,59 95%CI 0,36-0,98).
Таблица
Распределение частот генотипов и аллелей генов СУР1Л1 и СУР1Л2 у больных РМП в зависимости от клинического течения заболевания
Генотипы и аллели Инвазивный РМП Поверхностный РМП х2 р ОЯ (95% СІ)
1 2 3 4 5 6
Полиморфный локус Л2455С гена СУР1Л1
*1Л*1Л 58 55,77±4,87 (45,70-65,50) 70 67,31±4,60 (57,41-76,19) 2.46 0.12 0.61 (0.34-1.12)
*1Л*2С 39 37,50±4,75 (28,20-47,53) 33 31,73±4,56 (22,95-41,58) 0.53 0.47 1.29 (0.7-2.38)
*2С*2С 7 6,73±2,46 (2,75-13,38) 1 0,96±0,96 (0,02-5,24) 3.25 0.07 7.43 (0.90-166.19)
*1Л 155 74,52±3,02 (68,03-80,29) 173 83,17±2,59 (77,38-87,99) 4.17 0.04 0.59 (0.36-0.98)
*2С 53 25,48±3,02 (19,71-31,97) 35 16,83±2,59 (12,01-22,62) 1.69 (1.02-2.80)
Полиморфный локус С163А гена СУР1Л2
*1Л*1Л 25 24,04±4,19 (16,20-33,41) 23 22,12±4,07 (14,57-31,31) 0.03 0.87 1.11 (0.56-2.23)
*1Л*1Б 38 36,54±4,72 (27,31-46,55) 37 35,58±4,69 (26,43-45,57) 0.0005 1.0 1.04 (0.57-1.91)
*1Р*1Р 41 39,42±4,79 (29,98-49,49) 44 42,31±4,84 (32,68-52,39) 0.08 0.78 0.89 (0.49-1.60)
*1Л 88 42,31±3,43 (35,51-49,33) 83 39,90±3,40 (33,20-46,90) 0.16 0.69 1.10 (0.73-1.66)
*1Р 120 57,69±3,43 (50,67-64,49) 125 60,10±3,40 (53,10-66,80)
Полиморфный локус Т-2467delT гена СУР1Л2
*1Л*1Л 31 29,81±4,49 (21,23-39,57) 53 50,96±4,90 (40,97-60,90) 8.81 0.004 0.41 (0.22-0.75)
*1Л*Ш 54 51,92±4,90 (41,91-61,83) 42 40,38±4,81 (30,87-50,46) 2.34 0.13 1.59 (0.89-2.87)
*Ш*Ю 19 18,27±3,79 (11,37-27,05) 9 8,65±2,76 (4,03-15,79) 3.34 0.07 2.36 (0.95-5.99)
*1Л 116 55,77±3,44 (48,74-62,63) 148 71,15±3,14 (64,48-77,21) 9.96 0.003 0.51 (0.33-0.78)
92 44,23±3,44 (37,37-51,26) 60 28,85±3,14 (22,79-35,52) 1.96 (1.28-3.00)
Примечание. Для наглядности серым цветом заштрихованы ячейки с достоверными различиями между сравниваемыми группами.
При сравнении выборок больных инвазивным и поверхностным РМП не обнаружено статистически достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей полиморфного локуса С-163А гена CYP1A2 (Х2=0,20, ^2, р=0,90 и х2=0,16, аГ=1, р=0,69 соответственно).
Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса Т-2467delT гена CYP1A2 выявил статистически значимые различия между выборками больных с учетом клинического течения заболевания (х2=10,83, df=2, р=0,004 и х2=9,96, ё!=1, р=0,003, соответственно). Частота аллеля *Ш у больных инвазивным увеличена почти в 2 раза (44,23%) по сравнению с больными поверхностным РМП (28,85%) (0Я=1,96 95%С1 1,283,00), напротив частота аллеля *^ выше у больных поверхностными (71,15% против 55,77% у больных инвазивными формами заболевания (0Я=0,51 95%С1 0.33-0,78). Гомозиготный генотип *^*^ встречался среди больных поверхностным РМП чаще (50.96%), чем среди больных инвазивным РМП
(29,81%) (х2=8.81, а^1, р=0,004). С другой стороны, частота генотипа увеличена
до 18,27% у больных инвазивными формами, в то время как у больных поверхностными формами РМП она составила 8.65%. Однако данный результат не достиг статистической значимости (х2=3,34, df=1, р=0,07).
Доказано, что у человека существует генетический контроль метаболизма, поэтому в зависимости от особенностей генома различные индивидуумы могут или сохранять устойчивость, или, наоборот, обнаруживать повышенную чувствительность к повреждающим агентам [7]. Предполагается, что индивидуальная предрасположенность к онкологическим заболеваниям также обусловлена различиями в детоксикации ксенобиотиков [10].
Имеются данные о том, что моноокси-генирование ксенобиотиков не всегда сопровождается их детоксикацией, а, наоборот, может приводить к биоактивации различных ксенобиотиков с превращением их в высокотоксичные метаболиты, которые, в свою оче-
редь, способны изменять активность редокс- формы промежуточных метаболитов, интен-
чувтсвительных внутриклеточных регулятор- сивно образующихся в процессе биоактива-
ных белков и факторов транскрипции, непо- ции ксенобиотиков под воздействием мутиро-
средственно связываться с нуклеиновыми ки- ванных генов, способствуют ангиогенезу. В
слотами и проявлять генотоксичность [3]. В результате этого будет наблюдаться быстрый
настоящее время ведутся исследования по рост снабжающих опухоль кровеносных со-
изучению ассоциаций полиморфизмов гена судов, которые способствуют прогрессии
CYP^1 с онкологической патологией. Так, опухоли и раннему метастазированию, что в
было показано, что аллель *2C полиморфного конечном итоге и обусловливает неблагопри-
локуса A2455G гена CYP^1 ассоциирует с ятный прогноз заболевания. Таким образом,
риском развития рака легких [11], рака моче- исследование полиморфизмов генов может
вого пузыря [8]. Нами также выявлена ассо- служить одним из важных методов определе-
циация аллеля *2C полиморфного локуса ния тактики лечения и прогнозирования про-
A2455G гена CYP1А1 с риском развития РМП грессии заболевания.
и инвазивных форм заболевания. Выводы
Pavanello S. с соавт. в 2005 году показа- Обнаружена ассоциация аллеля *1A поли, что присутствие у курильщиков хотя бы лиморфного локуса A2455G гена CYP1A1, ге-
одного аллеля 1D гена CYP1A2 увеличивает нотипа *1A*1A и аллеля *1A полиморфного
активность фермента CYP1A2, что, возможно, локуса Т-2467delT гена CYP1A2 с поверхност-
приводит к увеличению индукции CYP^2 ныи характером роста РМП.
компонентами табачного дыма и накоплению Установлено, что маркерами риска ин-
промежуточных высокотоксичных соедине- вазивного роста РМП являются наличие алле-
ний. ля *2С полиморфного локуса A2455G гена
Полученные ассоциации можно объяс- CYP1A1 и аллеля *1D полиморфного локуса нить тем обстоятельством, что реактивные Т-2467delT гена CYP1A2.
Сведения об авторах статьи
Викторова Татьяна Викторовна
д. м.н., профессор, зав. кафедрой биологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. e-mail:[email protected]
Измайлов Адель Альбертович
к.м.н., доцент кафедры урология с курсом ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росз-драва». Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, e-mail: [email protected]
Измайлова Светлана Михайловна
ассистент кафедры биологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава».
Адрес: 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3. e-mail: [email protected]
Павлов Валентин Николаевич
д. м.н., профессор, зав. кафедрой урологии с курсом ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава». Адрес: 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3. e-mail: [email protected] Ахмадишина Лейсан Зинуровна
Старший научный сотрудник Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, e-mail: [email protected],
Мустафин Артур Тагирович
к.м.н., ассистент кафедры урология с курсом ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава». Адрес: 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3. e-mail: [email protected]
Урманцев Марат Фаязович
Клинический ординатор кафедры урология с курсом ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава». Адрес: 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3
Загидуллин Алмаз Азатович
к.м.н., доцент кафедры урология с курсом ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росз-драва». Адрес: 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3. e-mail: [email protected]
Хризман Юрий Нусинович
Заведующий отделением онкоурологии РОД МЗ РБ. Адрес: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 73/1
ЛИТЕРАТУРА
1. Кулинский, В.И. Обезвреживание ксенобиотиков //Соросовский образовательный журнал. -1999. - №1. - С. 8-12.
2. Русаков, И.Г. Адъювантная внутрипузырная химиотерапия поверхностного рака мочевого пузыря / И.Г. Русаков, А.А. Быстров // Онкоурология.-2007.- №3.-С.43-45.
3. Ляхович, В.В., Активированные кислородные метаболиты в монооксигеназных реакциях / В.В. Ляхович, В.А. Вавилин, Н.К. Зенков, Е.Б. Меньщикова //Бюллетень СО РАМН .-2005.-Т.118, №4.-С.7-12.
4. Baranov V.S., Ivaschenko T., Bakay B. et al. Proportion of the GSTM1 0/0 genotipe in some Slavic populations and its correlation with cystic fibrosis and some multifactorial diseases// Hum.Genet.-1996.- Vol.97.- P.516-520.
5. Bjerregaard BK, Raaschou-Nielsen O.et al. Tobacco smoke and bladder cancer-in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition. Int J Cancer 2006; 119(10):2412—6.
6. Bol MG, Baak J, Buhr-Wildhagen S. et al. Reproducibility and prognostic variability of grade and lamina propria invasion in stages Ta, T1 urothelial carcinoma of the bladder. J Urol 2003; 169(4): 1291—4.
7. Buch S. et al. Polymorphisms at CYP and GST gene loci //Eur. J. Clin. Pharmacol. -2001. - Vol.57. - P553-555.
8. Brockmoller J.et al. Combined analysis of inherited polymorphisms in arylamine N-acetyltransferase 2, glutathione S-transferase M1 and T1, microsomal epoxide hydrolase, and cytochrome P 450 enzymes as midulatiors of bladder cancer risk// Cancer Research.- 1996; 56.-P.3915-3925.
9. Ferlay J, Bray F, Pisani P, Parkin DM. Globcan 2002, Cancer Incidence, Mortality andPrevalence Worldwide, IARC CancerBase No. 5, version 2.0. Lyon: IARCC Press, 2004.
10. Hatagima A. Genetic polymorphisms and metabolism of endocrine disruptors in cancer susceptibility // Cad. Saude. Publica. - 2002. - Vol.18, №2. - P. 357-77.
11. Kihara M., Noda K. Lung cancer risk of GSTM1 null genotype is enhanced in the presence of the GSTP1 mutated genotypein male Japanese smokens// Cancer Lett. - 1999. - Vol.137, №1. - P.53-60.
12.Lopez-Beltran A, Montironi R. Non-invasive urothelial neoplasms: according to the most recent WHO classification. Eur Urol 2004; 46(2):170—6.
13.0osterlinck W, Solsona E. et al. European Association of Urology. EAU guidelines on diagnosis and treatment of upper urinary tract transitional cell carcinoma. Eur Urol 2004; 46(2):147—154.
14.Pavanello S. et al. Influence of the genetic polymorphism in the 5’-noncoding region of the CYP1A2 gene on CYP1A2 phenotype and urinary mutagenicity in smokers// Mutation Research.-2005.- Vol. 587.-P.59-66.
15. Persson I., Johansson I., Ingelman-Sundberg M. In vitro kinetics of two human CYP1A1 variant enzymes suggested to be associated with interindividual differences in cancer susceptibility// Biochem Biophys Res Commun.- 1997. - Vol. 231.-№ 1.-P. 227-30.
16.Sauter G, Algaba F. et al. Tumours of the urinary system: non-invasive urothelial neoplasias. In: Eble JN, Sauter G, Epstein Jl, Sesterhenn I, eds. WHO classification of classification of tumors of the urinary system and male genital organs. Lyon: IARCC Press, 2004, R 29—34.
17. Sachse C. et al. Polymorphisms in the cytochrome P450 CYP1A2 gene (CYP1A2) in colorectal cancer patients and controls: allele frequencies, linkage disequilibrium and influence on caffeine metabolism//Br J Clin Pharmacol.- 2003.- Vol. 55(1). P. 68-76.
18. Sachse C, Brockmoller J, Bauer S, Roots I. Functional significance of a C>A polymorphism in intron 1 of the cytochrome P450 CYP1A2 gene tested with caffeine//Br J Clin Pharmacol.- 1999.- Vol. 47(4). P. 445-9.
19.Zeegers MP, Tan FE, Dorant E, van den Brandt PA. The impact of characteristics of cigarette smoking on urinary tract cancer risk: a meta-analysis of epidemiologic studies. Cancer 2000; 89(3):630—9.
