CC BY
168
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК Б1Б.Б2--00Б.Б:577.21
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ В РАЗВИТИИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
А.А. Измайлов1, Л.З. Ахмадишина2, С.М. Измайлова1, Т.В. Викторова1-2,
1ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет», г. Уфа,
2ФГБУН «Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук», г. Уфа
Измайлов Адель Альбертович - e-mail: izmailov75@mail.ru
Рак мочевого пузыря (РМП) занимает 9-е место среди всех злокачественных новообразований в мире. В 70% случаев впервые выявленный рак мочевого пузыря является неинвазивным, в 30% -инвазивным. Матриксные металлопротеазы в настоящее время активно исследуются как прогностические факторы при многих локализациях опухолевого процесса. Доказана важность продукции ММР-2 для реализации инвазии опухолевыми клетками. Был проведен анализ распределения частот полиморфных локусов предварительно отобранных генов MMP2 (-735C>T), MMP9 (-1562C>T и -2660A>G) и MMP12 (-82A>G) в группах больных раком мочевого пузыря и в контрольной выборке практически здоровых индивидов. Доказано, что генотип CT полиморфного локуса -735C>T гена MMP2 является маркером риска развития рака мочевого пузыря (р=0,002, OR=2,24, 95% CI 1,36-3,69).
Ключевые слова: рак мочевого пузыря, матриксные металлопротеиназы,
полиморфизм, онкомаркеры.
Bladder cancer takes 9th place among all malignancies in the world. In 70% of cases of newly diagnosed bladder cancer is non-invasive, 30% - invasive. Matrix metalloproteases are being actively investigated as prognostic factors in many locales cancer. The importance of MMP-2 products proved for implementing invasion by tumor cells. The frequency distribution analysis of the previously selected gene polymorphisms MMP2 (-735C> T), MMP9 (-1562S> T and -2660A> G) and MMP12 (-82A> G) was carried out in groups of patients with bladder cancer and healthy individuals . It was shown genotype CT -735C> T MMP2 is a marker of bladder cancer development risk of (p=0,002, OR=2,24, 95% CI 1,36-3,69).
Key words: bladder cancer, matrix metalloproteinases, oncomarkers, polymorphism.
Введение
Рак мочевого пузыря (РМП) занимает 9-е место среди всех злокачественных новообразований в мире. Ежегодно диагностируется более 330 000 новых случаев опухоли мочевого пузыря. В 70% случаев впервые выявленный рак мочевого пузыря является неинвазивным, в 30% - инвазивным. Опухоль мочевого пузыря становится причиной смерти 130 000 человек, многолетними наблюдениями показано, что мужчины болеют намного чаще женщин, соотношение между полами составляет 3,8:1 [1], что напрямую связано с основными средовыми факторами риска развития данной опухоли - курением и профессиональной вредностью. Основным внутренним фактором, наряду с другими, является генетическая предрасположенность.
В значительной степени прогноз результата лечения онкологических больных зависит от оценки вероятности развития метастазов. Около одной трети пациентов со злокачественными опухолями имеют до начала лечения неопределяемые метастатические поражения. Остальные больные через какое-то время после лечения вновь попадают в клинику с обнаруженными метастазами и рецидивами [2].
К сожалению, в распоряжении современного врача нет чётких критериев, позволяющих распознать новообразования с высоким метастатическим потенциалом.
Степень инвазивного роста и метастазирование опухолевых клеток определяются их способностью расщеплять
компоненты экстраклеточного матрикса - базальные мембраны и межтканевую строму, состоящую из различных структурных белков: коллагенов, эластинов, ламининов и т. д. Показано, что разрушать все структуры экстрацеллю-лярного матрикса могут только матриксные металлопротеиназы (ММП, MMP) [2]. Более того, установлено, что они играют критическую роль в опухолевом неоангиогенезе [3]. Матриксные металлопротеазы относятся к семейству металлопротеаз, у человека их описано 23. Металлопротеазы, в зависимости от субстратной специфичности, принято классифицировать на коллагеназы (MMP-1, -8 и -13), желатиназы (MMP-2, -9), стромелизины (MMP-3, -10, -11) и гетерогенную группу, включающую металлоэластазу (MMP-12), энамелизин (MMP-20), матри-лизин (MMP-7), эндометазу (MMP-26), эпилизин (MMP-28), внутримембранные металлопротеиназы отнесены к отдельному классу (MMP-14, 15, -16, -17, -24, -25). [4].
MMP-12 - малоизученная металлоэластаза, ее роль в опухолевой прогрессии не ясна, однако она была обнаружена в макрофагах, инфильтрирующих аденокарциному пищевода в 13 из 15 случаев. Доказана важность продукции ММР-2 для реализации инвазии опухолевыми клетками. Наблюдения in vitro были подкреплены исследованиями in vivo: так, более высокая экспрессия гена ММР-2 была обнаружена в инвазивной клеточной линии UCT-2, чем в атравматичной опухолевой линии UCT-1. Трансфекция гена ММР-2 в клетки линии MYU3L увеличивала их
▲1
SSM
метастатический потенциал, в то время как трансфекция гена Т1МР-2 в клетки высокометастатической линии LMC19 понижала метастатический потенциал этих клеток [5]. В ряде исследований было показано, что присутствие больших количеств активной ММР-2 связано с инвазив-ным раком молочной железы и карциномой легкого [6-7]. Согласно литературным данным, выявлена корреляция между экспрессией ММР-2 и наличием метастазов в лимфатических узлах у больных раком гортани [8]. Экспрессия ММР9 повышена в тканях, где идет процесс ремоделиро-вания и ангиогенеза, а также в тканях прогрессирующих опухолей [9-10].
Матриксные металлопротеазы в настоящее время активно исследуются как прогностические факторы при многих локализациях опухолевого процесса. Все вышесказанное определяет актуальность изучения полиморфных локусов генов ММР2 (-735С>Т), ММР9 (-1562С>Т и -2660А^) и ММР12 (-82А^) и оценки их взаимосвязи с риском развития злокачественных новообразований мочевого пузыря.
Цель исследования: провести анализ распределения частот полиморфных локусов предварительно отобранных генов ММР2 (-735С>Т), ММР9 (-1562С>Т и -2660А>С) и ММР12 (-82А>С) в группах больных раком мочевого пузыря и в контрольной выборке практически здоровых индивидов. Проведение данного анализа позволит доказать, что генотип СТ полиморфного локуса -735С>Т гена ММР2 является маркером риска развития рака мочевого пузыря (р=0,002, OR=2,24, 95% С1 1,36-3,69).
Материал и методы
Материалом для молекулярно-генетического анализа послужили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови стандартным фенольно-хлороформным методом. Группу исследования составили 250 больных раком мочевого пузыря. Средний возраст больных составил 60,93±11,32 года. Индекс курения для курильщиков составил 29,37±14,61 пачек/лет. Все больные находились на стационарном лечении в урологических отделениях клинических больниц г. Уфы: Республиканской клинической больнице им. Куватова, Республиканском онкологическом диспансере и клинике БГМУ, и были прооперированы в период с 2005 по 2014 год. В соответствии с Международной классификацией Европейской ассоциации урологов [1] обследованные больные РМП были разделены на две группы в зависимости от клинической формы заболевания: мышечно-инвазивная и мышечно-неинвазивная.
Контрольную группу составили 267 человек, жители Республики Башкортостан, отобранные по возрасту, полу и этнической принадлежности, без хронических заболеваний мочеполовой системы в анамнезе. Средний возраст составил 56,12+8,57 года. Индекс курения для курильщиков составил 20,79+15,11 пачек/лет.
Анализ полиморфных вариантов генов проводили методом ПЦР-ПДРФ. Условия проведения ПЦР, последовательности праймеров описаны в таблице 1.
Результаты амплификации оценивали при помощи вертикального электрофореза в 6-8%-м полиакриламидном геле (исходное соотношение акриламида и метиленбиса-криламида 29:1) при напряжении 200-300 В (10 В/см).
В качестве буфера использовали трис-боратный буфер (ТВЕ). По окончании электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,1 мкг/мл) в течение 15 мин и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для идентификации аллелей использовали маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н. «100 bp DNA ladder» («Сибэнзим»).
Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакетов статистических программ, SNPstats [4]. Вычисляли средние величины количественных показателей и их стандартные ошибки (M±m). При сравнении частот качественных признаков использовали критерий х2. Анализ ассоциации проводили с использованием расчета показателя отношения шансов (OR). При всех использованных методах анализа статистически значимыми считали различия при р<0,05.
ТАБЛИЦА 1.
Тип полиморфизма, последовательности праймеров и номенклатура аллелей анализируемых ДНК-локусов
Ген Полиморфизм Праймеры 5'-3' (эндонуклеаза рестрикции) Аллели (размер фрагментов, п.о.) Ссылка
MMP12 -82A>G rs2276109 5'-GAGATAGTCAAGGGATGATATCAG-3' 5'-AAG AGC TCC AGA AGC AGT GG-3' Pvu II A -199 G - 175 + 24 Joos et at., 2002
MMP2 -735C>T rs2285053 5'-ATAGGGTAAACCTCCCCACAT T-3' 5'-GGTAAAATGAGGCTGAGACCT G-3' HinfI C - 300 T - 254 + 46 Armstrong et at., 2007
MMP9 -1562C>T rs3918242 5-TTCGTGACGCAAAGCAGA-3' 5-AGCAGCCTCCCTCACTCCT-3' SphI C - 560 T- 300 +260 Joos et at., 2002
MMP9 2660A>G, R279Q rs17576 5'-AATTCACCCTCCCGCACTCT-3' 5'-GTTTTGGGGGCCAATACATGA-3' SmaI A - 397 G - 173 + 224 Ganter et at., 2005
Результаты и их обсуждение
Проведён анализ распределения частот полиморфных локусов предварительно отобранных генов ММР2 (-735С>Т), ММР9 (-1562С>Т и -2660А>С) и ММР12 (-82А>С) в группах больных раком мочевого пузыря и в контрольной выборке практически здоровых индивидов. Данные распределения частот генотипов и аллелей приведены в таблице 2.
Проведен анализ однонуклеотидного полиморфизма -735С>Т гена ММР2 у пациентов с РМП и в контроле (таблица 2). Сравнительный анализ группы больных РМП и контрольной группы по распределению частот генотипов, но не аллелей данного полиморфного локуса, выявил статистически значимые различия между группами. Так, у больных РМП по сравнению с контрольной группой обнаружено статистически значимое повышение частоты гете-розигот СТ (27,9% и 14,7%, соответственно, р=0,002, OR=2,24, 95% С1 1,36-3,69). Частота гомозигот СС, напротив, выше в группе контроля по сравнению с больными (81,6% и 70,6%, соответственно, р=0,01) (таблица 2).
Проведен анализ однонуклеотидных замен -2660А>С и -1562С>Т гена ММР9 у больных РМП и группы контроля (таблица 2).
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
ТАБЛИЦА 2.
Распределение частот полиморфных вариантов генов металлопротеаз в группах РМП и практически здоровых индивидов
Ген, полиморфный локус Редкий аллель | Генотипы, аллели Больные раком мочевого пузыря, абс. (%) Практически здоровые индивиды, абс.(%) х2 P
GG/AG/AA 3/42/205 3/39/225 0.48 0.79
MMP12 -82A>G rs2276109 G (1.2016.80/82.00) (1.12/14.61/84.27)
G/A 48/452 45/489 0.30 0.58
(9.60/90.40) (8.43/91.57)
TT/TC/CC 3/55/139 9/36/199 12-75 0.002
MMP2 -735C>T rs2285053 T (1.52/27.92/70.56) (3.69/14.75/81.56)
T/C 61/333 54/434 4-37 0.07
(15.48/84.52) (11.07/88.93)
TT/TC/CC 2/32/211 2/43/211 1-37 0.50
MMP9 -1562C>T rs3918242 T (0.82/13.06/86.12) (0.78/16.80/82.42)
T/C 36/454 47/465 0.88 0.35
(7.35/92.65) (9.18/90.82)
GG/GA/AA 33/116/89 31/108/120 4-4 0.13
MMP9 2660A>G rs17576 G (13.87/48.74/37.39) (11.97/41.70/46.33)
G/A 182/294 170/348 2-95 0.09
(38.24/61.76) (32.82/67.18)
Сравнение группы больных РМП и контрольной группы здоровых индивидов не выявило статистически значимых различий по распределению частот генотипов и аллелей полиморфного локуса -1562С>Т. Также не выявлено статистически значимых различий по распределению частот генотипов и аллелей полиморфного локуса -2660А^ гена ММР9 (таблица 2).
Анализ полиморфного локуса -82А^ гена ММР12 в группах пациентов с РМП и контроле статистически значимых различий по распределению частот генотипов и аллелей не выявил (таблица 2).
Одно из первых мест в регуляции выделения MMPs занимают специфические тканевые ингибиторы (TIMPs), которые связываются с активной формой MMPs, и только баланс между тканевыми ингибиторами и MMPs обеспечивает нормальный гомеостаз в экстрацеллюлярном матриксе [11]. Кроме того, была показана определённая роль А1>рецептора в регуляции экспрессии MMPs [12-14]. Несмотря на то, что роль MMPs ещё не в полной мере изучена, не оставляет сомнений, что она выходит далеко за рамки участия в разрушении экстрацеллюлярного матрик-са. Эти протеазы сегодня рассматривают как ключевые регуляторы различных неопластических процессов, которые влияют на дифференцировку, пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток, способствуя выделению митогенных факторов из различных клеток и резервуаров экстрацеллюлярного матрикса. Выяснилось также, что ММР-9 может регулировать рост эпителиальных и эндоте-лиальных клеток путем влияния на основную мембрану [15]. Важна роль ММР-2 и ММР-9 в процессе микроваску-ляризации опухоли [16]. С экспрессией MMPs связано и перераспределение различных рецепторов адгезии. В настоящее время наиболее актуальным является изучение функций MMPs, являющихся потенциальными мишенями для воздействия ингибиторами с целью угнетения
ангиогенеза, торможения роста опухоли, уменьшения опухолевой инвазии и метастазирования. Хотелось бы также особо отметить, что протеолитические ферменты принимают участие на всех стадиях развития (регулируют процессы клеточной пролиферации, адгезии, миграции, дифференциации, ангиогенеза, апоптоза опухоли), а не только в процессе метастазирования. В то же время появляется всё больше доказательств в пользу того, что протеазы обладают и противоопухолевыми свойствами, более того, они могут действовать как опухолевые супрессоры, подавляя рост опухолевых клеток, ингибируя ангиогенез, стимулируя апоптоз и моделируя иммунный ответ. ^
ЛИТЕРАТУРА
1. http://www.uroweb.org/nc/guidlanes/online-guidlanes/
2. Клишо Е.В., Кондакова И.В., Чойнзонов Е.Л. Матриксные металлопроте-иназы в онкогенезе. Сибирский онкологический журнал. 2003. № 2. С. 62-71.
Klisho E.V., Kondakova I.V., Choynzonov E.L. Мatriksnye metalloproteinazy v onkogeneze. Sibirskiy onkologicheskiy zhurnal. 2003. № 2. S. 62-71.
3. Ганусевич И.И. Роль матриксных металлопротеиназ (ММП) при злокачественных новообразованиях. II. Участие ММП в ангиогенезе, инвазии и мета-стазировании опухолей. Онкология. 2010. Т. 12. № 2. С. 108-117.
Ganusevich I.I. Rol' matriksnykh metalloproteinaz (MMP) pri zlokachestvennykh novoobrazovaniyakh. II. Uchastie MMP v angiogeneze, invazii i metastazirovaniiopukholey. Onkologiya. 20101. T. 12. № 2. S.108-117.
4. Klein T., Bischoff R. Physiology and pathophysiology of matrix metalloproteases. Amino Acids. 2011. V. 41 (2). P. 271-290.
5. Kanayama H., Yokota K., Kurokawa Y. et al. 1998. Prognostic values of matrix metalloproteinase-2 and tissue in-hibitor of metalloproteinase-2 expression in bladder cancer. Cancer. № 82. Р. 1359-66.
6. Davies B., Miles D.W., Happerfield L.C. et al. Activity of type IV collagenases in benign and malignant breast disease. Br. J. Cancer. 1993. Vol. 67. P. 1126.
7. Zhou Y., Yu C., Miao X. et al. Functional haplotypes in the promoter of matrix metalloproteinase-2 and lung cancer susceptibility. Carcinogenesis. 2005. V. 26. № 6. P.1117-1121.
8. Kheradmand F., Rishi K. The Role of Proteinases in Airway Remodeling. New York: Dekker. 2003. P. 749-765.
9. Atkinson J.J., Senior R.M. Matrix metalloproteinase-9 in lung remodeling. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2003. V. 28. № 1. P. 12-24.
10. Hu Z., Huo X., Lu D. et al. Functional polymorphisms of matrix metalloproteinase-9 are associated with risk of occurrence and metastasis of lung cancer. Clin. Cancer Res. 2005. V. 11. № 15. P. 5433-5439.
11. Бережная Н.М. Роль клеток системы иммунитета в микроокружении опухоли. II. Взаимодействиклеток системы иммунитета с другими компонентами микроокружения. Онкология. 2009. Т. 11. № 2. С. 86-93.
Berezhnaya N.M. Rol' kletok sistemy immuniteta v mikrookruzhenii opukholi. II. Vzaimodeystvikletok sistemy immuniteta s drugimi komponentami mikrookruzheniya. Onkologiya. 2009. T. 11. № 2. S. 86-93.
12. Haque M., Francis J., Sehgal I. Aryl hydrocarbon exposure induces expression of MMP-9 in human prostate cancer cell lines. Cancer Lett. 2005. Vol. 159-166.
13. Caren M. Villano and Lori A. White. The Aryl Hydrocarbon Receptor-Signaling Pathway and Tissue Remodeling: Insights from the Zebrafish (Danio rerio) Model System. Toxicological sciences. 2006. № 92 (1). V. 1-4.
14. Tie-Li Peng, Jie Chen, Wei Mao, Xin Song and Min-Hu Chen. Aryl hydrocarbon receptor pathway activation enhances gastric cancer cell invasiveness likely through a c-Jun-dependent induction of matrix metalloproteinase-9. BMC Cell Biol. 2009. Р. 10-27.
15. Affara N.I., Coussens L.M. Proteolytic pathways: intersecting cascades in cancer development, in The Cancer Degradome. Proteases and Cancer Biology. 2008. Р. 157-182.
16. Ганусевич И.И. Роль матриксных металлопротеиназ (ММП) при злокачественных новообразованиях. I. Харктеристика ММП, регуляция их активности, прогностическое значение. 2010. С. 10-16.
Ganusevich I.I. Rol' matriksnykh metalloproteinaz (MMP) pri zlokachestvennykh novoobrazovaniyakh. I. Kharkteristika MMP, regulyatsiya ikh aktivnosti, prognosticheskoe znachenie. 2010. S. 10-16.
