ПОИСК АНТАГОНИСТОВ МИКРОМИЦЕТА FUSARIUM SPOROTRICHIOIDES Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 632.937.1.05

ПОИСК АНТАГОНИСТОВ МИКРОМИЦЕТА FUSARIUM SPOROTRICHIOIDES

ANTIFUNGAL ACTIVITY OF FUSARIUM SPOROTRICHIOIDES ANTAGONISTS

И.И. Идиятов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Л.Р. Валиуллин, кандидат биологических наук, заведующий сектором, С.Р. Галлямова, младший научный сотрудник, В.В. Бирюля, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической

безопасности» (420075, г. Казань, ул. Научный городок 2)

Рецензент: М.Н. Мукминов, доктор биологических наук Казанского (Приволжского) федерального университета

Аннотация

Растительное сырье подвергается поражению различными микромицетами, среди которых велика доля грибов рода фузариум. В борьбе с грибковыми поражениями широкое распространение получили биологические методы защиты, наиболее перспективным в этом направлении является применение природных антагонистов. В рамках данной работы осуществили выделение микромицета Fusarium sporotrichioides из кормового сырья и чистых культур микроорганизмов из природных биотопов, исследовали противогрибковую активность выделенных микробов методами встречных культур, агаровых блоков, модифицированного штриха и отсроченного антагонизма. Активные штаммы обнаружили, используя каждый из них, однако характер взаимодействия антагониста и патогена в полной мере раскрывает анализ взаимодополняющих опытов. Методом встречных культур установили наличие фунгистатического алиментарного антагонизма во взаимоотношениях изолятов, условно обозначенных как СБ16, СБ17, СБ20 и СБ23, с микромицетом Fusarium sporotrichioides, ширина зоны роста мицелия гриба была ниже контроля на 64,6; 64,3; 65,7; 63,0 и 68,8%, соответственно. Фунгистатическим антибиотическим антагонизмом обладали изоляты СБ10 и СБ15, следовательно, им был характерен синтез веществ, обладающих ингибирующим развитие мицелия действием. Метод агаровых блоков показал наибольшую активность изолятов СБ1, СБ10, СБ15, СБ16 и СБ20, которая составила,

соответственно, 1,39±0,04, 1,33±0,17, 2,21±0,19, 1,93±0,17 и 2,00±0,11. Наибольшую зону задержки роста патогена при постановке опыта по методу модифицированного штриха имели изоляты СБ16 и СБ17 (9,00±0,35мм и 13,00±0,35мм). Наибольшую фунгистатическую активность, выявленную по методу отсроченного антагонизма, проявили изоляты СБ1, СБ10, СБ12, СБ15, СБ16 и СБ20. Таким образом отобранные изоляты в перспективе могут служить основой для получения биофунгицидов, наиболее перспективными, проявившими антагонистический эффект в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides, для использования в качестве живых культур оказались условно обозначенные изоляты СБ17 и СБ23, противогрибковые вещества выделял СБ12, высокое противогрибковое действие в процессе роста и активность метаболитов показали изоляты СБ1, СБ10, СБ15, СБ16 и СБ20.

Ключевые слова: Fusarium sporotrichioides, природные биотопы, изоляты, антагонизм.

Summary

Vegetable raw material is exposed to various micromycete, among which a large proportion of Fusarium fungi. In the fight against fungal lesions, biological protection methods have been widely used, the most promising in this direction is the use of natural antagonists. Within the framework of this work, the micromycete Fusarium sporotrichioides was isolated from fodder raw materials and pure cultures of microorganisms from natural biotopes, the antifungal activity of the isolated microbes was determined by the methods of counter cultures, agar blocks, modified strokes and delayed antagonism. Active strains were found using any of them, however, the nature of the interaction of the antagonist and pathogen fully reveals an analysis of complementary experiments. The presence of fungistatic alimentary antagonism in the relationships of isolates conventionally designated as SB16, SB17, SB20 and SB23 with the micromycete Fusarium sporotrichioides was determined by the method of counter cultures, the width of the fungal mycelia growth zone was below the control by 64.6; 64.3; 65.7; 63.0 and 68.8%, respectively. Fungistatic antibiotic antagonism possessed isolates SB10 and SB15, therefore, it was characterized by the synthesis of substances that inhibit the development of mycelium action. The method of agar blocks showed the greatest activity of isolates SB1, SB10, SB15, SB16 and SB20, which were, respectively, 1.39 ± 0.04, 1.33 ± 0.17, 2.21 ± 0.19, 1.93 ± 0.17 and 2.00 ± 0.11. The largest zone of growth retardation of the pathogen in the formulation of the experiment using the modified stroke method was the isolates SB16 and SB17 (9.00 ± 0.35mm and 13.00 ± 0.35mm). The greatest fungistatic activity revealed by the method of delayed antagonism was shown by isolates SB1, SB10, SB12, SB15, SB16 and SB20. Thus, the selected isolates in the future can serve as a basis for obtaining bio fungicides, the most

2

promising ones showing an antagonistic effect against micromycete Fusarium sporotrichioides for use as living cultures were conditionally designated isolates SB17 and SB23, antifungal substances isolated SB12, a high antifungal effect during growth and the activity of metabolites showed isolates SB1, SB10, SB15, SB16 and SB20.

Keywords: Fusarium sporotrichioides, natural biotopes, isolates, antagonism.

Широкая повсеместная распространенность грибов Fusarium sporotrichioides и способность к продуцированию значительных количеств токсинов ставят их в ранг наиболее опасных фитопатогенов. Для этих микромицетов характерна высокая гетерогенность признаков, способность образовывать хламидоспоры, что позволяет существовать в различных условиях, на широком круге растений-хозяев. Фузариоз зерна ухудшает посевные качества семян, угнетает развитие корневой системы и стебля растений, снижает пищевые достоинства зерна и продуктов его переработки и поэтому во всем мире рассматривается как одно из наиболее вредоносных заболеваний сельскохозяйственных культур [1].

Бактерии-антагонисты в качестве агентов биологической защиты растений являются перспективной и безопасной альтернативой химическим средствам борьбы с фитопатогенными грибами, поскольку эффективно сдерживают их развитие и распространение, стимулируют рост растений, благотворно влияют на микробиологическое сообщество в почве.

Цель и методика исследований. В связи с изложенным целью работы явилось исследование антагонистической активности изолятов микроорганизмов выделенных из природных биотопов к грибам рода Fusarium sporotrichioides.

Исследование проводили на полевом штамме микромицета Fusarium sporotrichioides, выделенном с поверхности семян зерновых культур согласно методическим указаниям и ГОСТ [2, 3, 4]. Для отбора бактериальных штаммов взвесь из проб высевали на мясопептонный агар (МПА), культивировали при 370С до образования колоний, затем делали с них пересевы и выделяли чистые культуры. Антагонистическую активность изолятов определяли методами встречных культур, агаровых блоков, модифицированного штриха и отсроченного антагонизма.

Метод двойных (встречных) культур [5]. Культуру гриба и антагониста выращивали отдельно на агаризованной среде, затем простерилизованным сверлом вырезали блок с мицелием гриба и помещали в чашку Петри, на расстоянии 6 см от него штрихом наносили культуру антагониста. Контролем служил посев гриба без изолята. Чашки инкубировали в термостате при 260С, учет проводили на 5; 10; 15 и 30 сутки

3

культивирования. Отмечали рост тест - гриба и антагониста, характер их взаимодействия [6], зону ингибирования роста мицелия [7].

Метод агаровых блоков [8]. Выделенную микробную культуру засеяли на поверхность мясопептонного агара в чашке Петри и термостатировали при 370С до образования «сплошного газона». Затем стерильным пробочным сверлом вырезали из него блоки, которые переносили на предварительно засеянную тест - культурой гриба поверхность сусло - агара в другой чашке Петри. Тест-культуру засевали шпателем, агаровые блоки накладывали ростом вверх на равном расстоянии один от другого и от краев чашки, плотно прижимая к поверхности среды. Контролем служило культивирование гриба без микроба. Чашки инкубировали в термостате при температуре 260С. Учет опыта вели на 2; 4 и 7 сутки. По прошествии 7 суток культивирования измеряли диаметр зоны подавления роста мицелия в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Активность изолятов рассчитывали по формуле:

А=D/d,

где D - диаметр зоны задержки роста мицелия гриба, мм;

d - диаметр места нанесения культуры, 13,5 мм

Метод модифицированного штриха. Тест - культуру гриба выращивали в картофельном бульоне при 260С, постоянном перемешивании при 90 об./мин в течение 7 суток. В стерильные чашки Петри наливали расплавленный МПА, после его застывания стерильным скальпелем по диаметру чашки вырезали полоску шириной 1см, в образовавшийся желобок заливали расплавленный и остуженный до 450С сусло-агар с фильтратом тест - гриба. После застывания среды штрихами через всю площадь чашки, пересекая в перпендикулярном направлении желобок, наносили исследуемые изоляты. Контролем служили чашки с тест - культурой без изолятов. Чашки инкубировали в термостате при 260С в течение 7 суток. Результат учитывали по развитию тест-гриба.

Метод отсроченного антагонизма [8]. На сусло-агар бактериологической петлей наносили суточную культуру изолята и с целью накопления в среде продуцируемых метаболитов инкубировали в течение 48ч при температуре 370С. Выросшие колонии стерилизовали парами хлороформа в течение 30 мин, чашки подсушивали (для удаления остатков хлороформа), на поверхность среды заливали 6мл расплавленной и остуженной до 450С среды с 10 % суспензии тест - культуры гриба. Контролем служили чашки с тест -грибами без изолятов. После инкубации в термостате при температуре 260С в течение 7 суток оценивали антагонистическую активность по наличию или отсутствию роста тестируемых культур.

Фунгистатическую активность изолятов оценивали по степени ингибирования роста мицелия гриба и высчитывали по формуле [7, 9]:

I = (1 - А/Б)х100, %, где:

I - процент ингибирования;

А - количество колоний в опыте;

Б - количество колоний в контроле.

Статистическую обработку полученного цифрового материала осуществляли методом вариационной статистики с применением программы Microsoft Excel и критерия достоверности Стьюдента. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при p < 0,05.

Результаты исследований. После отбора проб кормов и проведения проб подготовки, образцы разложили в чашки Петри на сусло-агар и поместили в термостат при 260С, через 5 суток отмечали формирование колоний грибов. Интересующие колонии пересеяли в новые чашки для получения чистых культур (рис. 1).

Рис. 1. Культура микромицета Fusarium sporotrichioides Видовую идентификацию грибов провели по оценке совокупности культур альных и микроморфологических признаков. Строение микроструктур оценивали методом «блока» для просмотра морфологических структур в исходном, не разрушенном состоянии. Из культуры гриба стерильным скальпелем вырезали участок блока и поместили на предметное стекло, затем добавили каплю жидкости и накрыли покровным стеклом, препараты рассматривали при малом и большом увеличении светового микроскопа с целью просмотра макроконидий, установления типа конидиеносцев, способа образования конидий и хламидоспор.

Изоляты сапрофитных бактериальных штаммов выделили из проб почвы, ризосферы, вегетативных органов и семян зерновых культур (пшеницы, кукурузы), с последующей гомогенизацией проб в стерильном физиологическом растворе и культивированием при 370С на мясопептонном агаре (МПА). С отдельных выросших

колоний провели пересев в новые чашки Петри до выделения чистой культуры. В результате выделили 25 изолятов, которые условно обозначили как СБ1 - СБ25 (табл. 1).

Таблица 1

Изоляты сапрофитных бактерий, выделенные из проб

Изолят Источник

Isolate Source

СБ1 Ризосфера кукурузы

SB1 Rhizosphere of corn

СБ2 Почва

SB2 Soil

СБ3 Ризосфера пшеницы

SB3 Rhizosphere of wheat

СБ4 Почва

SB4 Soil

СБ5 Почва

SB5 Soil

СБ6 Ризосфера пшеницы

SB6 Rhizosphere of wheat

СБ7 Почва

SB7 Soil

СБ8 Почва

SB8 Soil

СБ9 Почва

SB9 Soil

СБ10 Вегетативные органы пшеницы

SB10 Vegetative organs of wheat

СБ11 Почва

SB11 Soil

СБ12 Почва

SB12 Soil

СБ13 Ризосфера кукурузы

SB13 Rhizosphere of corn

СБ14 Ризосфера кукурузы

SB14 Rhizosphere of corn

СБ15 SB15 Ризосфера кукурузы Rhizosphere of corn

СБ16 SB16 Ризосфера кукурузы Rhizosphere of corn

СБ17 SB17 Ризосфера кукурузы Rhizosphere of corn

СБ18 SB18 Ризосфера кукурузы Rhizosphere of corn

СБ19 SB19 Ризосфера кукурузы Rhizosphere of corn

СБ20 SB20 Вегетативные органы кукурузы Vegetative organs of corn

СБ21 SB21 Вегетативные органы кукурузы Vegetative organs of corn

СБ22 SB22 Вегетативные органы кукурузы Vegetative organs of corn

СБ23 SB23 Вегетативные органы кукурузы Vegetative organs of corn

СБ24 SB24 Почва Soil

СБ25 SB25 Почва Soil

Методом встречных культур установили, что по механизму противогрибкового действия изоляты бактерий поделились на обладающие высоким показателем подвижности и образующие стерильную зону антагонистического действия (рис. 2).

Из изолятов, обладающих подвижностью (табл. 2), высокая ингибирующая активность в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides проявилась у СБ16, СБ17, СБ20 и СБ23, на 10 сут совместного культивирования они занимали наибольшую площадь питательного субстрата чашки Петри, блокируя дальнейшее разрастание тест-культуры гриба, вблизи зоны нарастания мицелий патогена частично лизировался. Изоляты СБ1, СБ3, СБ11, СБ13 и СБ22 к 30 сут инкубации занимали половину площади чашки. Развитие изолятов СБ2, СБ6, СБ12, СБ24 и СБ25 тестовый микромицет ингибировал, разрастаясь на занимаемой ими площади.

Рис. 2. Антагонистическая активность изолятов в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides, установленная методом встречных культур (1 - контроль, 2 - СБ2, 3 - СБ15, 4 - СБ17)

Таблица 2

Антагонистическая активность изолятов, обладающих высоким показателем

подвижности, в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides

Изолят Isolate Рост мицелия патогена от посевного блока, мм Growth of mycelium of pathogen from seeding block, mm

Срок культивирования, сут Term of cultivation, day

5 10 15 30

Контроль Control 32,41±0,59 40,17±0,63 48,81±0,62 70,00±0,00

СБ1 SB1 28,17±0,43 29,33±0,67 30,35±0,65 31,00±0,35

СБ2 SB2 30,88±0,51 32,21±0,49 35,33±0,47 40,50±0,65

СБ3 SB3 29,00±0,35 32,33±0,67 34,17±0,63 36,20±0,45

СБ6 27,50±0,50 33,47±0,53 41,90±0,45 51,33±0,67

SB6

СБ11 SB11 26,17±0,43 28,33±0,47 27,87±0,43 35,43±0,37

СБ12 SB12 29,67±0,53 35,71±0,49 38,17±0,43 39,33±0,47

СБ13 SB13 25,33±0,47 27,17±0,43 29,00±0,50 30,41±0,49

СБ16 SB16 22,90±0,65 25,61±0,59 25,33±0,47 25,67±0,43

СБ17 SB17 21,00±0,50 22,60±0,35 23,17±0,43 24,00±0,65

СБ20 SB20 19,17±0,50 21,43±0,47 22,67±0,43 25,89±0,51

СБ22 SB22 23,41±0,49 26,90±0,65 29,17±0,43 30,00±0,35

СБ23 SB23 16,71±0,49 19,00±0,50 20,97±0,63 21,81±0,54

СБ24 SB24 30,67±0,43 35,33±0,67 39,00±0,35 44,93±0,57

СБ25 SB25 31,17±0,43 35,87±0,51 37,17±0,43 40,61±0,49

На 10 сут совместного культивирования изоляты образовывали стерильную зону шириной от 18,7 до 26,2мм, однако на 15 сут стерильной зоны между патогеном и изолятами СБ4, СБ9, СБ14, СБ18, СБ19 и СБ21 отмечено не было, зона ингибирования мицелия оставшихся изолятов составила 7,5-24мм. К 30 сут стерильную зону удержали лишь изоляты СБ10 и СБ15 (табл. 3).

Таблица 3

Антагонистическая активность бактериальных изолятов, образующих

стерильную зону в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides

Ширина зоны ингибирования, мм

Изолят Width of inhibition zone, mm

Isolate Срок культивирования, сут

Term of cultivation, day

9

10 15 30

СБ4 SB4 24,00±0,65 - -

СБ5 SB5 25,17±0,63 7,98±0,22 -

СБ7 SB7 24,83±0,57 8,33±0,47 -

СБ8 SB8 23,17±0,43 9,60±0,50 -

СБ9 SB9 24,00±0,35 - -

СБ10 SB10 20,61±0,49 23,37±0,43 24,75±0,45

СБ14 SB14 25,71±0,49 - -

СБ15 SB15 23,33±0,47 23,67±0,23 25,00±0,35

СБ18 SB18 19,00±0,35 - -

СБ19 SB19 21,37±0,43 - -

СБ21 SB21 22,50±0,35 - -

Методом агаровых блоков установили зону задержки роста микромицета и определили активность изолятов (рис. 3).

*>

4 5 ■

Рис. 3. Результаты исследования антагонистической активности изолятов к микромицету Fusarium sporotrichioides методом агаровых блоков: 1 - контроль, 2 - СБ1, 3 - СБ10, 4 - СБ15, 5 - СБ16, 6 - СБ20 Зона задержки роста микромицета Fusarium sporotrichioides отмечалась при совместном культивировании с 19 изолятами из 25 отобранных (табл. 4). При этом наибольшую зону образовывала культура СБ15 - 29,83±0,78мм, антагонистическая активность изолята была наибольшей в сравнении с остальными - 2,21. При инкубировании патогена с СБ1 зона задержки мицелия гриба составила 18,83±0,52мм, активность - 1,39, СБ10 - 18,00±0,55мм и 1,33, СБ16 - 26,08±0,36мм и 1,93, СБ20 -26,92±0,43 и 2,00, соответственно.

Таблица 4

Противогрибковое действие изолятов в отношении микромицета Fusarium

sporotrichioides, выявленное методом агаровых блоков

Изолят Isolate Зона задержки роста патогена, мм The pathogen growth retardation zone, mm Активность изолята Isolate activity

СБ1 SB1 18,83±0,52 1,39±0,04

СБ2 SB2 3,25±0,19 0,24±0,02

СБ3 SB3 4,00±0,32 0,30±0,02

СБ4 SB4 - 0

СБ5 SB5 3,42±0,17 0,25±0,01

СБ6 SB6 3,83±0,12 0,28±0,01

СБ7 SB7 - O

СБ8 SB8 - O

СБ9 SB9 3,08±0,17 0,23±0,02

СБ10 SB10 18,00±0,55 1,33±0,17

СБ11 SB11 3,58±0,17 0,27±0,02

СБ12 SB12 13,75±0,44 1,02±0,03

СБ13 SB13 12,00±0,32 0,89±0,11

СБ14 SB14 13,08±0,30 0,97±0,08

СБ15 SB15 29,83±0,78 2,21±0,19

СБ1б SB16 2б,08±0,3б 1,93±0,17

СБ17 SB17 12,17±0,б4 0,90±0,11

СБ18 SB18 - O

СБ19 SB19 - O

СБ20 SB20 2б,92±0,43 2,00±0,11

СБ21 SB21 11,08±0,2б 0,82±0,08

СБ22 SB22 12,92±0,48 0,9б±0,10

СБ23 SB23 5,58±0,33 0,41±0,03

СБ24

4,92±0,26 0,36±0,04

SB24

СБ25

- 0

SB25

Методом модифицированного штриха установили, что выделенные изоляты в той или иной степени обладали антагонистической активностью в отношении тест-культуры гриба (рис. 4).

Рис. 4. Подавление развития микромицета Fusarium sporotrichioides бактериальными изолятами (метод штриха, 7 сутки культивирования)

Зона задержки роста патогена к 7 сут совместного культивирования варьировала от 2,0 до 13,5мм (табл. 5). Наибольшую активность показали изоляты СБ16 и СБ17, зона задержки ими роста тестового штамма гриба составила, соответственно, 9,00±0,35мм и 13,00±0,35мм.

Таблица 5

Антагонизм изолятов к микромицету Fusarium sporotrichioides, установленный

методом штриха

Изолят Isolate Зона задержки роста, мм Area of growth retardation, mm

Срок культивирования Term of cultivation

2 сут 4 сут 7 сут

СБ1 SB1 5,00±0,35 3,83±0,20 4,17±0,20

СБ2 SB2 3,50±0,00 3,33±0,20 3,67±0,20

СБ3 SB3 4,17±0,20 2,67±0,41 4,00±0,00

СБ4 SB4 4,33±0,20 3,50±0,20 4,00±0,35

СБ5 SB5 4,00±0,35 3,67±0,20 4,17±0,20

СБ6 SB6 3,50±0,35 3,00±0,00 3,00±0,35

СБ7 SB7 2,67±0,20 2,00±0,00 2,00±0,00

СБ8 SB8 2,50±0,00 1,67±0,20 2,00±0,00

СБ9 SB9 3,17±0,20 3,00±0,00 3,00±0,00

СБ10 SB10 3,67±0,41 3,17±0,20 3,00±0,35

СБ11 SB11 5,00±0,00 5,00±0,00 4,33±0,20

СБ12 SB12 4,67±0,20 4,50±0,35 4,50±0,00

СБ13 SB13 4,17±0,20 4,17±0,00 4,50±0,35

СБ14 5,50±0,00 5,00±0,35 5,00±0,00

SB14

СБ15 SB15 5,67±0,20 5,17±0,20 5,50±0,00

СБ16 SB16 11,17±0,20 9,17±0,20 9,00±0,35

СБ17 SB17 9,33±0,20 11,83±0,20 13,00±0,35

СБ18 SB18 3,50±0,00 3,17±0,20 3,00±0,00

СБ19 SB19 4,00±0,35 5,00±0,00 5,00±0,00

СБ20 SB20 4,00±0,00 3,67±0,41 3,83±0,20

СБ21 SB21 3,17±0,20 4,00±,00 3,50±0,35

СБ22 SB22 2,50±0,00 3,67±0,20 4,00±0,00

СБ23 SB23 4,00±0,00 3,50±0,35 4,00±0,00

СБ24 SB24 4,33±0,20 3,50±0,35 3,50±0,00

СБ25 SB25 4,00±0,00 3,50±0,35 3,50±0,35

Оценку фунгистатического действия выделенных изолятов провели методом отсроченного антагонизма (рис. 5). При культивировании патогена на среде с инактивированными культурами бактерий 6 изолятов полностью задерживали рост гриба: СБ1, СБ10, СБ12, СБ15, СБ16 и СБ20.

Рис. 5. Результаты оценки фунгистатического действия изолятов в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides (1 - контроль, 2 - СБ1, 3 - СБ2, 4 - СБ10)

Активность оставшихся изолятов оценивали подсчетом количества выросших колоний микромицета и выражали степенью ингибирования роста патогена (рис. 6).

Степень ингибирования, % Degree of inhibition, %

120

100

80

Рис. 6. Фунгистатическая активность изолятов в отношении микромицета

Fusarium sporotrichioides

Наибольшую фунгистатическую активность в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides показали изоляты СБ1, СБ10, СБ12, СБ15, СБ16 и СБ20. Степень ингибирования развития гриба изолятом СБ14 была ниже на 11,9%, СБ22 - на 15,5%, СБ18 - 21,4% СБ13 и СБ21 - 22,6%. Минимальной фунгистатической активностью обладали изоляты СБ25, СБ4, СБ8, СБ18, СБ7 и СБ19, степень ингибирования патогена составляла 4,8-17,9%. Активность изолятов СБ2, СБ3, СБ5, СБ6, СБ9, СБ11 и СБ24 была от 25 до 40%, СБ23 - не превышала 50%.

В результате проведенных исследований из 25 бактериальных изолятов, выделенных из природных биотопов, наиболее эффективными антагонистами микроскопических патогенных грибов Fusarium sporotrichioides являются 8 штаммов (табл. 6).

Таблица 6

Скрининг изолятов, обладающих антагонистической активностью в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides

Изолят Isolate Метод оценки антагонистической активности Method for assessing antagonistic activity

Метод встречных культур Method of counter cultures Метод агаровых блоков Method of agar blocks Метод модифицированного штриха Method of modified stripe Метод отсроченного антагонизма Method of delayed antagonism

СБ1 SB1 + +

СБ2 SB2

СБ3 SB3

СБ4 SB4

СБ5 SB5

СБ6 SB6

СТ7 SB7

СТ8 SB8

CБ9 SB9

CT1G SB10 + + +

CБ11 SB11

СТ12 SB12 +

CБ13 SB13

CБ14 SB14

СТ15 SB15 + + +

CБ1б SB16 + + + +

СТ17 SB17 + +

CБ18 SB18

CБ19 SB19

CT2G SB20 + + +

CБ21 SB21

СТ22 SB22

CБ23 SB23 +

СБ24 SB24

СБ25 SB25

Примечание: «+» - наиболее выраженное действие

Анализируя данные по скринингу изолятов, обладающих антагонистической активностью в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides, полученные различными методами, можно сделать вывод о том, что активные штаммы обнаруживаются используя любой из них, однако полнота картины взаимодействия антагониста и патогена достигается постановкой нескольких взаимодополняющих опытов. Методом встречных культур установили характер взаимоотношений изолятов и патогена, степень ингибирования роста мицелия, ширину зоны роста гриба в присутствии антагониста, размер области диффузии веществ от блока изолята до мицелия гриба с образованием стерильной зоны. Так, наличие фунгистатического алиментарного антагонизма отмечали во взаимоотношениях изолятов СБ16, СБ17, СБ20 и СБ23. Фунгистатическим антибиотическим антагонизмом обладали изоляты СБ10 и СБ15, следовательно, им был характерен синтез веществ, обладающих ингибирующим мицелий гриба действием. Метод агаровых блоков позволил оценить зону подавления роста гриба, морфологические изменения культур при культивировании антагониста непосредственно на среде с патогеном. Противогрибковый эффект изолятов в данном случае отражал способность последних сохранить зону нанесения, наибольшей активностью отличились изоляты СБ1, СБ10, СБ15, СБ16 и СБ20. Метод модифицированного штриха, также как и метод встречных культур, показал способность изолятов к росту и выделению противогрибковых веществ на среде с патогеном, результат сокультивирования культур выражался в зоне задержки роста патогена, наибольшую зону задержки роста имели изоляты СБ16 и СБ17. Метод отсроченного антагонизма характеризовал фунгистатическую активность веществ, выделяемых изолятами, результат действия которых выражался в количестве колоний микромицета выросших на среде, содержащей инактивированные микроорганизмы, и индексом ингибирования его роста. Наибольшую фунгистатическую активность проявили изоляты СБ1, СБ10, СБ12, СБ15, СБ16 и СБ20.

Выводы. В результате исследования у выделенных из природных биотопов изолятов выявлено противогрибковое действие в отношении микромицета Fusarium sporotrichioides. Методом встречных культур антагонистический потенциал установили у СБ10, СБ15, СБ16, СБ17, СБ20 и СБ23, ширина зоны роста мицелия гриба была ниже контроля на 64,6; 64,3; 65,7; 63,0 и 68,8%, соответственно. Методом агаровых блоков

эффективность показали изоляты СБ1, СБ10, СБ15, СБ16 и СБ20, индекс их активности составлял 1,39±0,04, 1,33±0,17, 2,21±0,19, 1,93±0,17 и 2,00±0,11. Изоляты СБ16 и СБ17 показали эффективность при постановке опыта по методу модифицированного штриха, зона задержки ими роста тестового штамма гриба составила, соответственно, 9,00±0,35мм и 13,00±0,35мм. Степень ингибирования роста микромицета изолятами СБ1, СБ10, СБ12, СБ15, СБ16 и СБ20, выявленная по методу отсроченного антагонизма, составляла 100%. Скрининг противогрибковой эффективности показал, что из 25 изолятов наиболее эффективными оказались 8, из них 2 показали фунгистатическую алиментарную активность, 1 - антибиотическую, 5 изолятов обладали высоким противогрибковым действием в процессе роста и активностью метаболитов. Отобранные изоляты в перспективе могут служить основой для получения биофунгицидов.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» (Фонд содействия инновациям) в рамках выполнения Соглашения о предоставлении гранта на выполнение научно-исследовательских работ за №10244ГУ/2015.

Библиографический список

1. Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П., Левитин М.М., Новожилов К.В. Фузариоз зерновых культур // Приложение к журналу «Защита и карантин растений». 2011. № 5. 52 с.

2. Поликсенова В.Д., Храмцов А.К., Пискун С.Г. Методические указания к занятиям спецпрактикума по разделу «Микология. Методы экспериментального изучения микроскопических грибов» для студентов 4 курса дневного отделения специальности «G 31 01 01 - Биология». Мн.: БГУ, 2004. 36 с.

3 . «Методические указаниями по санитарно-микологической оценке и улучшению качества кормов» от 25.02.1985.

4. ГОСТ 13496.6-71 "Комбикорм. Метод выделения микроскопических грибов".

5. Лабораторный практикум по микробиологии. Учебно - методический комплекс. -Минск: УО «Белорусский государственный педагогический университет имени Максима Танка», 2012. 129 с.

6. Пестинская Т.В. О взаимоотношениях грибов обитающих в почве // Ботан. журн. 1958. Т. 43. № 9. С. 1270-1277.

7. Montealegre J.R., Reyes R., Perez L.M. et al. Selection of bioantagonistic bacteria to be used in biological control of Risoctonia solani in tomato // Electronic Journal of Biotechnology. 2003. Vol. 6. № 2. P. 116-127.

8. Егоров Н.С. Выделение микробов-антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности. М.: Изд-во МГУ, 1957. 78 с.

9. Обухов Ю.И., Разуваев А.В. Методы оценки эффективности биоцидной обработки текстильных материалов // Рынок легкой промышленности. 2010. №80.

10. Идиятов И.И., Валиуллина Д.А., Галлямова С.Р. Первичный скрининг микроорганизмов-антагонистов к микроскопическим грибам Aspergillus flavus и Fusarium sporotrichioides // Ученые записки КГАВМ. 2017. № 231 (III). С. 90-93.