ПОДХОД К ПОИСКУ ПРОДУЦЕНТОВ АНТИБИОТИКОВ, ПРЕОДОЛЕВАЮЩИХ ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

DOI: 10.37489/0235-2990-2021-66-7-8-4-12 Оригинальная статья/Original Article

Подход к поиску продуцентов антибиотиков, преодолевающих лекарственную устойчивость микроорганизмов

М. В. ДЕМЬЯНКОВА12, В. С. САДЫКОВА1, А. А. ГЛУХОВА1, Т. А. ЕФИМЕНКО1, Ю. В. БОЙКОВА1, Н. Д. МАЛКИНА1, В. Г. КОРМИЛИЦИНА2, С. О. ШАРАПЧЕНКО2, И. Г. СУМАРУКОВА1, Б. Ф. ВАСИЛЬЕВА1, Т. Д. ИВАНКОВА1, Л. П. ТЕРЕХОВА1, Н. И. ГАБРИЭЛЯН2, *О. В. ЕФРЕМЕНКОВА1

1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

2 ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В. И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

Approach to Searching for the Producers of Antibiotics That Overcome Drug Resistance of Microorganisms

MARIYA V DEMIANKOVA12, VERA S. SADYKOVA1, ALLA A. GLUKHOVA1,

TATIANA A. EFIMENKO1, YULIYA V. BOYKOVA1, NATALIA D. MALKINA1,

VICTORIA G. KORMILITSINA2, SOFYA O. SHARAPCHENKO2, IRINA G. SUMARUKOVA1,

BYAZILYA F. VASILIEVA1, TATIANA D. IVANKOVA1, LARISSA P. TEREKHOVA1,

NINA I. GABRIELYAN2, OLGA V EFREMENKOVA1 *

1 Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

2 Academician V. I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Moscow, Russian Federation

Резюме

В настоящее время проблема устойчивости к антибиотикам оппортунистических и патогенных микроорганизмов является чрезвычайно актуальной. Чтобы найти новые эффективные природные антибиотики, необходимо активизировать процесс поиска. При поэтапном отборе наиболее перспективных продуцентов нами была введена стадия определения антибиотической активности культуральной жидкости исследуемых природных штаммов в отношении клинических изолятов госпитальных микроорганизмов с множественной устойчивостью к антибиотикам медицинского назначения. Определение видовой принадлежности потенциальных продуцентов позволяет выбрать тех продуцентов конкретного вида, которые отличаются по антимикробному спектру активности от описанных в литературе. Были отобраны четыре штамма актиномицетов, которые проявляли активность в отношении устойчивых клинических изолятов дрожжей Candida albicans, C.famata, C. arapsilosis и Cryptococcus neoformans, а именно: Nocardia soli ИНА 01217, Streptomyces bottropensis ИНА 01214, S.chromofuscus ИНА 01211 и S.netropsis ИНА 01190. Штамм N.soli ИНА 01217 также проявляет антибиотическую активность против грамотрицательной бактерии Escherichia coli ATCC 25922. Эти штаммы продуцентов актиномицетов были отобраны для последующих химических исследований образованных ими противомикробных соединений.

Ключевые слова:устойчивость к антибиотикам; поиск антибиотиков; противогрибковые; актиномицеты

Для цитирования: Демьянкова М. В., Садыкова В. С., Глухова А. А., Ефименко Т. А., Бойкова Ю. В., Малкина Н. Д., Кор-милицина В. Г, Шарапченко С. О., Сумарукова И. Г, Васильева Б. Ф., Иванкова Т. Д., Терехова Л. П., Габриелян Н. И, Ефременкова О. В. Подход к поиску продуцентов антибиотиков, преодолевающих лекарственную устойчивость микроорганизмов. Антибиотики и химиотерапия. 2021; 66: 7-8: 4-12. doi: 10.24411/0235-2990-2021-66-7-8-4-12.

Abstract

Currently, the problem of antibiotic resistance of opportunistic and pathogenic microorganisms is extremely urgent. In order to find new effective natural antibiotics, it is necessary to intensify the search process. In the gradual selection of the most promising producers, we introduced the stage of determining the antibiotic activity of the culture fluid of the studied natural strains against the clinical isolates of hospital microorganisms with multiple resistance to medical antibiotics. Determining the species affiliation of potential producers allows to select those producers of a particular species that differ in the antimicrobial spectrum of activity from those described in the literature. Four strains of actinomycetes that showed

© Коллектив авторов, 2021

*Адрес для корреспонденции: Большая Пироговская улица, 11, стр. 1, НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе, г. Москва, Российская Федерация, 119021. E-mail: mary_bunny@mail.ru

© Team of Authors, 2021

"Correspondence to: 11/1 Bolshaya Pirogovskaya st., Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, 119021 Russian Federation. E-mail: mary_bunny@mail.ru

activity against resistant clinical isolates of yeast Candida albicans, C.famata, C.parapsilosisand Cryptococcus neoformans were selected, namely: Nocardia soli INA 01217, Streptomyces bottropensis INA 01214, S.chromofuscus INA 01211 and S.ne-tropsis INA 01190. The N.soli INA 01217 strain also shows antibiotic activity against the Gram-negative bacterium Escherichia coli ATCC 25922. These strains of actinobacterial producers were selected for subsequent chemical studies of the antimicrobial compounds formed by them.

Keywords: antibiotic resistance; searching for antibiotics; antimycotics; actinobacteria

For citation: Demiankova M. V., Sadykova V. S., GlukhovaA. A., Efimenko T. A., Boykova Y. V., Malkina N. D., Kormilitsina V. G., Sha-rapchenko S. O, Sumarukova I. G., Vasilieva B. F., Ivankova T. D., Terekhova L. P., Gabrielyan N. I., Efremenkova O. V. Approach to searching for the producers of antibiotics that overcome drug resistance of microorganisms. Antibiotiki i Khimioter=Antibiotics and Chemotherapy. 2021; 66: 7-8: 4-12. doi: 10.24411/0235-2990-2021-66-7-8-4-12.

Применение антибиотиков в медицине началось в 1940-х, но одновременно стали выявляться микроорганизмы, устойчивые к антибиотикам. С годами проблема устойчивости (резистентности) усугублялась и в настоящее время стала угрожающей. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), к 2050 г. мировая смертность от инфекционных заболеваний, не поддающихся антибактериальной терапии, составит 10 млн человек в год и выйдет на одно из первых мест наряду с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями [1, 2].

Решение проблемы антибиотикорезистент-ности должно быть комплексным, включающим контроль за применением антибиотиков (в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности), разработку новых схем лечения и профилактики инфекционных заболеваний, создание пула резервных антибиотиков. Задача поиска новых эффективных природных антибиотиков весьма актуальна.

Примерно из 30 000 природных антибиотиков только 200-220 используются в медицине, но их эффективность вследствие распространения резистентных форм условно-патогенных и патогенных микроорганизмов неуклонно снижается. Актиномицеты производят около трети известных антибиотиков. Эта группа бактерий была хорошо изучена в 1950-1970 гг., но в настоящее время количество выявленных продуцентов новых антибиотиков у актиномицетов меньше, однако потенциал актиномицетов ещё не исчерпан. В частности, в период с 2000 по 2017 гг. в медицинскую практику были введены только два новых природных антибиотика — даптомицин и фидаксомицин, которые оба продуцируются актиномицетами [3, 4].

Традиционно процесс разработки новых природных антибиотиков состоит из нескольких этапов: выделение штаммов предполагаемых продуцентов из природной среды, разработка условий культивирования, определение спектра антимикробной активности, идентификация видов продуцентов, выделение и химическая идентификация продуцируемых веществ, доклинические и клинические исследования. В данной работе описан подход к поиску продуцентов при-

родных антимикробных соединений, включающий определение активности в отношении резистентных форм клинических изолятов до выделения, очистки и химических исследований. Цель такого подхода — отбор наиболее перспективных продуцентов для химического изучения с целью повышения вероятности выявления продуцентов новых антибиотиков, преодолевающих устойчивость условно-патогенных и патогенных микроорганизмов к современным медицинским антибиотикам. Объектами исследования являются актиномицеты, и основная задача заключается в выявлении продуцентов антимикотиков, активных в отношении резистентных штаммов условно-патогенных дрожжей.

Материал и методы

Объекты исследования. Актиномицеты выделены из почв Московской и Рязанской областей, а также Краснодарского края. Штаммы депонированы в Коллекции культур ФГБНУ «НИИНА им. Г. Ф. Гаузе (акроним коллекции ИНА).

Культуральные среды. Агаровые среды для роста и идентификации актиномицетов, а также жидкие культуральные среды, разработаны для продуцентов антибиотиков в ФГБНУ «НИИНА» им. Г. Ф. Гаузе [5].

Условия культивирования. Для хранения и поддержания всех микроорганизмов использовали среду №2 Гаузе. Актиномицеты инкубировали при 28°C в течение 10-12 сут. Другие бактериальные тест-штаммы инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°C; исключение составлял штамм Leu-conostoc mesenteroides ВКПМ-4177, который инкубировали при 28°C. Грибные тест-штаммы Aspergillus niger ИНА 00760 и Sac-charomyces cerevisiae ИНА 01129 инкубировали при 28°C в течение 48 и 24 ч, соответственно.

Погружённое культивирование актиномицетов проводили в две стадии на роторных качалках со скоростью вращения 200 об/мин. Использовали колбы Эрленмейера объёмом 750 мл со 150 мл культуральной среды. На первой стадии использовали жидкую среду № 2 Гаузе, которую засевали кусочком агаровой среды размером примерно 1 см2 с поверхностным ростом актиномицета. После 4 сут культивирования для второй стадии полученную культуральную жидкость в количестве 5 мл вносили в колбы со свежей средой. Отбор проб для определения антибиотической активности проводили на четвёртый и седьмой день роста.

Определение антимикробной активности. Коллекционные штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, а также клинические изоляты микроорганизмов с различной устойчивостью к антибиотикам, использовали для определения антимикробной активности. Идентификацию клинических изолятов и их чувствительность к антибиотикам проводили на автоматизированном бактериологическом анализаторе Siemens MicroScan Walk Away —

Таблица 1. Видовая идентификация актиномицетов на основании анализа гена 16S рРНК Table 1. Species identification of actinomycetes based on the analysis of 16S rRNA genes

Вид, штамм ДНК, по Процент совпадения Номер депонирования в базе данных GenBank

Streptomyces antibioticus ИНА 01148 1357 99,1 —

S.netropsis ИНА 01190 1356 100 MK496650

S.chromofuscus ИНА 01211 1340 97,1 MK496648

S.hydrogenans ИНА 01212 1357 100 MK238399

S.bottropensis ИНА 01214 1374 99,5 MK496651

S.hydrogenans ИНА 01215 1366 99,3 MK496652

Nocardia soli ИНА 01217 1355 99,4 MK496654

S.lusitanus ИНА 01218 1366 95,6 MK496655

S.peucetius ИНА 01255 1360 99 —

S.chartreusis ИНА 01259 1363 IÖÖ

96 Plus System. Антимикотическую чувствительность дрожжевых клинических изолятов проводили с использованием тест-сис-темы FUNGITEST™ (BIO-RAD, Франция). Антибиотическую активность актиномицетов в культуральной жидкости определяли методом диффузии в агар. Для этого по 100 мкл аликвот культуральной жидкости вносили в лунки диаметром 9 мм в агаризованной среде, инокулированной тестируемыми штаммами. После инкубирования в течение 20-24 ч измеряли диаметры зон задержки роста тест-штаммов как показатель антибиотического действия.

Видовая идентификация актиномицетов. Для видовой идентификации оценивали строение спороносцев, поверхность спор, пигментацию воздушного и субстратного мицелия, а также пигмент, выделяющийся в среду. Для мик-роскопирования использовали световой микроскоп Мик-мед-6 (ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия). Споры актиномицетов исследовали на сканирующем электронном микроскопе JE0L-6060A (JEOL, Токио, Япония) с вольфрамовым катодом. Платину распыляли на образцы, напыляли в установке в установке JFC-1600 (JEOL, Япония). Последовательность гена 16S рРНК также учитывали для идентификации видов. Для выделения ДНК использовали трёхсуточную культуральную жидкость. Выделение геномной ДНК из биомассы актиномицетов осуществляли с использованием набора DNeasy PowerSoil (Qiagen, Hilden, Германия). ПЦР гена 16S рРНК проводили с использованием набора реагентов PCR Master Mix (содержит ДНК-полимеразу Taq; Thermo Scientific, Калифорния, США) и универсальных бактериальных праймеров 27f (aga gtt tga tcc tgg ctcag) и 1492r (tac ggy tac ctt gtt acg act t). ПЦР проводили в Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, США) по программе: (1) 94°C в течение 5 мин, (2) 30 циклов с чередующимися температурными интервалами — 94°C в течение 1 мин, 51°C в течение 1 мин, 72°C в течение 2 мин, (3) 72°C в течение 7 мин. Анализ продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в 1% ага-розном геле (с использованием TBE трис-боратного буфера) при напряжённости электрического поля 7,6 В/см. Очистку продуктов ПЦР осуществляли переосаждением ДНК в мягких условиях с использованием 0,125 М ацетата аммония в 70% этаноле. Нуклеотидные последовательности определяли методом Сэнгера в генном анализаторе Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems, Массачусетс, США). Программу Mega 7 использовали для сборки нуклеотидных последовательностей. Полученные последовательности сравнивали с нуклеотидными последовательностями гена 16S рРНК штаммов актинобактерий из баз данных GenBank (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и Ribosomal Database Project (https://rdp.cme.msu.edu/).

Результаты и обсуждение

Для поиска антимикотиков анализировали 10 штаммов актиномицетов, которые, по пред-

варительным данным, проявляют противогрибковую активность против тест-штаммов Saccha-romyces cerevisiae ИНА 01129 и/или Aspergillus niger ИНА 00760. Была проведена идентификация видов на основе сравнения последовательностей ДНК анализируемых штаммов-продуцентов с последовательностями в базах данных. Часть последовательностей была депонирована в GenBank (табл. 1).

По морфологическим признакам видовая идентификация этих штаммов соответствует результатам генного анализа [6, 7]. Все штаммы были выделены из разных образцов почвы. Два штамма S.hydrogenans несколько отличаются друг от друга по количеству спор в цепочках и характере соединения спор, однако оба штамма соответствуют описанию вида (рисунок).

При глубинном культивировании спектры антимикробной активности определяли в отношении шести коллекционных тест-штаммов. Помимо противогрибковой активности все 10 штаммов проявляли активность против грамположитель-ных бактерий, включая 6 штаммов, активных против метициллинорезистентного штамма Staphylococcus aureus (MRSA), и 9 штаммов против Leuconostoc mesenteroides с высоким уровнем устойчивости к ванкомицину (512 мкг/мл). Кроме того, было показано, что три штамма активны против грамотрицательной бактерии (E.coli ATCC 25922). Среды, при росте на которых наблюдали самый высокий уровень противогрибковой активности, также приведены в табл. 2.

На следующем этапе работы была определена антимикотическая активность культуральной жидкости актиномицетов в отношении клинических изолятов дрожжей (табл. 3). Было обнаружено, что, за исключением трёх штаммов (S.anti-bioticus ИНА 01148, S.chartreusis ИНА 01259 и S.peucetius ИНА 01255), остальные семь актиномицетов активны в отношении клинических изоля-тов дрожжей, устойчивых к медицинским анти-микотикам. Штамм S.hydrogenans ИНА 01215 проявляет противогрибковую активность для всех клинических изолятов, т. е. он активен in

Сравнение спор и спороносцев двух штаммов S.hydrogenans, выращенных на соевой агаровой среде в течение 12 сут: ИНА 01212 (a, b) и ИНА 01215 (с, d).

Comparison of spores and spore carriers of two S.hydrogenans strains (grown on soy agar medium for 12 days): ИНА 01212 (a, b) and ИНА 01215 (с, d).

vitro, когда шесть медицинских противогрибковых препаратов неэффективны. Ранее нами было показано, что другой штамм этого вида, ИНА 01212, также образует противогрибковые антибиотики и подавляет рост фитопатогенных грибов [8].

Актиномицеты как продуценты антибиотиков представляют собой хорошо изученную группу микроорганизмов. Основное количество антибиотиков, образуемых актиномицетами, было описано в 1950-80 гг. После выяснения видовой принадлежности и спектров антимикробной активности мы сравнили полученные результаты с данными литературы по изучаемым видам (табл. 4, 5).

При сравнении данных литературы и полученных результатов были отобраны пять штаммов актиномицетов, которые относятся к видам, для которых определённая антимикробная активность была ранее неизвестна: N.soli ИНА 01217

(активность в отношении грамотрицательных бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов), S.botropensis ИНА 01214 и S.netropsis ИНА 01190 (активность в отношении дрожжей и мицелиаль-ных грибов), S.chromofuscus ИНА 01211 (активность против дрожжей), S.peucetius ИНА 01255 (активность против мицелиальных грибов) (см. табл. 5). Четверо из них проявили противогрибковую активность против устойчивых клинических изолятов дрожжей: N.soli ИНА 01217, S.bot-tropensis ИНА 01214, S.chromofuscus ИНА 01211 и S.netropsis ИНА 01190 (см. табл. 3, 5). Мы считаем эти четыре штамма перспективными для химического изучения образуемых антигрибковых антибиотиков.

Из табл. 5 следует, что актиномицет N.soli ИНА 01217 ингибирует рост грамотрицательных бактерий, хотя мы не нашли информации об этом в литературе. Антимикробные соединения, ак-

Таблица 2. Спектры антимикробной активности культуральной жидкости актиномицетов, выращенных в разных жидких средах Table 2. Spectra of culture liquid antimicrobial activity of actinomycetes grown in different liquid media

Актиномицеты Тест -штаммы

Виды, штаммы рост на средах, оптима- Saccharomyces Aspergillus Bacillus Staphylococcus Leuconostoc Escherichia

льных для проявления cerevisme niger subtilis aureus mesenteroides coli

противогрибковой активности РИА 259 ИНА 00760 ATCC 6633 ИНА 00761 (MRSA) ВКПМ B-4177 ATCC 25922

Streptomyces antibioticus ИНА 01148 D (5339) +++ +++ ++++ ++++ ++++ -

S.netropsis И HA 01190 В (A4) ++++ +++ +++ ++++ +++ ++

S.chromofuscus ИНА 01211 В (A4) +++ ++++ +++ - ++++ -

S.hydrogenans И HA 01212 С (Suc), F (330) ++++ ++++ +++ - ++ -

S.bottropensis И HA 01214 Е (6613) - +++ +++ ++ ++ -

S.hydrogenans ИНА 01215 С (Suc), D (5339) ++++ ++++ +++ - - -

Nocardia soli И HA 01217 F (330) ++++ ++++ - ++++ ++++ +++

S.lusitanus И HA 01218 В (A4) - +++ - - ++++ -

S.peucetius ИНА 01255 D (5339) - +++ +++ ++++ ++++ ++

S.chartreusis ИНА 01259 С (Suc) - ++ ++ +++ ++ -

Примечание. Здесь и в табл. 3: зоны подавления роста тест-штаммов (мм) как показатель интенсивности антибиотической активности: «-» — нет активности; «+» — < 10; «++» — 11-15; «+++» — 16-20; «++++» — >20.

Note. Here and in Table 3: Areas of test strains' growth inhibition (mm) as an indicator of the intensity of antibiotic activity: «-» — no activity; +» — < 10; «++» — 11-15; «+++» — 16-20; «++++» — >20.

Таблица 3. Противогрибковая активность культуральной жидкости актиномицетов в отношении клинических изолятов дрожжей Table 3. Antifungal activity of actinomycete culture broth against clinical yeast isolates

3: —{

о

-H

s

о

гп 2

s

NO

О

NO

Ol CTl

I

oo

Актиномицеты Клинические изоляты дрожжей

Виды, штаммы рост на средах, оптима- Candida Candida Candida Candida Cryptococcus Candida

льных для проявления albicans albicans famata parapsilosis neoformans neoformans

противогрибковой активности 5430 6503 6311 6314 6392 7248

Streptomyces antibioticus ИНА 01148 D (5339) - - - - - -

S.netropsis ИНА 01190 В (A4) ++ - - ++ ++ +++

S.chromofuscus ИНА 01211 В (A4) +++ +++ ++ ++ - ++

S. hydrogenans ИНА 01212 С (Suc), F (330) +++ +++ +++ ++++ - ++

S.bottropensis ИНА 01214 Е (6613) - - - - ++++ -

S. hydrogenans ИНА 01215 D (5339) +++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++

Nocardia soli ИНА 01217 F (330) ++++ ++++ - ++++ ++++ -

S.lusitanus ИНА 01218 В (A4) +++ +++ - +++ - +

S.peucetius ИНА 01255 D (5339) - - - - - -

S.chartreusis ИНА 01259 С (Suc) - - - - - -

R — антимикотики, к которым MCZ, KET, AB 5FC, ITR, 5FC, MCZ, KET, MCZ, ITR, FLU AB

устойчивы клинические изоляты* ITR, FLU FLU ITR, FLU

I — антимикотики, к которым - ITR MCZ, KET - KET MCZ, ITR, FLU

клинические изоляты проявляют

промежуточный уровень

чувствительности*

S — антимикотики, к которым 5FC, AB 5FC, MCZ, AB AB 5FC, AB 5FC, KET

чувствительны клинические изоляты* KET, FLU

Примечание. * —антимикотики медицинского назначения: 5FC — 5-фторцитозин; АВ — амфотерицин В; MCZ — миконазол; КЕТ — кетоконазол; ITR — итрако-назол; FLU — флуконазол.

Note. * —Antimycotics for medical purposes: 5FC — 5-fluorocytosine; AB — amphotericin B; MCZ — miconazole; KET—ketoconazole; ITR — itraconazole; FLU — fluconazole.

Таблица 4. Антибиотики, ранее описанные у представителей исследуемых видов Table 4. Antibiotics previously described in representatives of the studied species

Виды Антибиотики Ссылки

название чувствительные микроорганизмы

Nocardia soli ТИОлактомИцин Грамположительные бактерии 9, 10

Streptomyces Олеандомицин Грамположительные и грамотрицательные бактерии 11, 12

antibioticus

Симициклиноны Грамположительные бактерии 13

Актиномицин D Грамположительные и грамотрицательные бактерии, 14

дрожжи, мицелиальные грибы Боромицин Грамположительные бактерии 15

S.bottropensis Боттромицин Грамположительные бактерии 1б

Олигомициновые Мицелиальные грибы 17

антибиотики, 44-гомоолигомицин A (NK86-0279 II)

_и B (NK86-0279 I)__

S.chartreusis Шартрезин Грамположительные бактерии, 18

в том числе возбудитель туберкулеза Кальцимицин (A23187) Грамположительные бактерии и мицелиальные грибы 19 S.chromofuscus Гербоксидиен Умеренная активность против 20

гриба Phytophthora megasperma var. glycine Антрациклины SM-173A Грамположительные бактерии, 21, 22

(= аранциамицин) включая Mycobacterium sp. и Staphylococcus sp.

_и SM-173B_=_

S.hydrogenans Актиномицин D Грамположительные и грамотрицательные бактерии, 8, 23

мицелиальные грибы

S.lusitanus Цианоциклины A-D Цианоциклин А проявляет широкий спектр 24, 25

антимикробной и противоопухолевой активности Нафтиридиномицин Грамположительные и грамотрицательные бактерии 2б 7-хлортетрациклин, Грамположительные и грамотрицательные бактерии 27 тетрациклин

Антимицин B2 Умеренная активность против грамположительных 28

и грамотрицательных бактерий N-десметилнафтири- Грамположительные и грамотрицательные бактерии 2б диномицин

S.netropsis Нетропсин Грамположительные и грамотрицательные бактерии 29

S.peucetius Адриамицин Грамположительные и грамотрицательные бактерии 30-32

и дауномицин

тивные в отношении грамотрицательных бактерий и образованные этим штаммом, также целесообразно идентифицировать.

Обсуждение

Распространение резистентных форм в популяциях патогенных микроорганизмов постоянно увеличивается. По данным Американского общества инфекционных заболеваний, в 2009 г. было выявлено семь видов бактерий, в популяциях которых были широко распространены штаммы с множественной устойчивостью к антибиотикам [33]. В 2017 г. Всемирная организация здравоохранения представила список патогенных микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам, состоящий из 12 видов, чтобы обозначить приоритеты в исследованиях и разработке новых и эффективных методов лечения антибиотиками. ВОЗ оценила темпы и масштабы распространения резистентных патогенов как серьёзную глобальную угрозу для человечества [34]. Условно-патогенные и патогенные грибы не входят в этот список, но их растущее распространение также очевидно [35,

36]. В связи со сложившейся ситуацией поиск новых противогрибковых антибиотиков является важной задачей. Несмотря на внедрение молекулярных методов поиска новых антибиотиков in vitro, общий результат незначителен [33-39]. Использование традиционных схем работы с продуцентами антибиотиков требует совершенствования, например, отбора наиболее перспективных продуцентов на ранних этапах отбора. Актиноми-цеты и грибы остаются основным источником новых биологически активных соединений [3, 40]. Актиномицеты разных видов выделяются из природы с разными частотами. Например, продуцент даптомицина выделяют из почвы с частотой один на десять миллионов, эритромицин — один на миллион, ванкомицин — один на сто тысяч, хло-рамфеникол — один на десять тысяч, а стрептомицин, актиномицин D и стрептотрицин — менее одного на тысячу [41]. В связи с этим нам представляется важной идентификация вида после обнаружения антибиотической активности у природного штамма, выделенного в культуру.

Вторым важным обстоятельством мы считаем определение антимикробной активности не

Таблица 5. Сравнение антимикробной активности исследуемых штаммов с опубликованными данными по соответствующим видам

Table 5. Comparison of the antimicrobial activity of the studied strains with published data concerning the corresponding species*

Виды, штаммы Активность против разных групп Активность против разных групп

микроорганизмов, изученных микроорганизмов (по литературным во время настоящего эксперимента данным; табл. 4)

грам+ грам- дрожжи грибы грам+ грам- дрожжи грибы

Streptomyces antibioticus INA 01148 • o о • • • • •

S.netropsis ИНА 01190 • • д д • • нд нд

S.chromofuscus ИНА 01211 • о д • • о о •

S.hydrogenans ИНА 01212 • о • • • • • •

S.bottropensis ИНА 01214 • о д д • о о о

S.hydrogenans ИНА 01215 • о • • • • • •

Nocardia soli ИНА 01217 • д д д • о о о

S.lusitanus ИНА 01218 • о • • • • • •

S.peucetius ИНА 01255 • • о д • • о о

S.chartreusis ИНА 01259 • о о • • нд нд •

Примечание. «•» — антимикробная активность оценена против, по меньшей мере, одного исследованного штамма данного вида; «°» — антимикробная активность не обнаружена ни в одном из изученных штаммов данного вида; «Д» — антимикробная активность данного вида была впервые установлена в отношении по крайней мере одного из протестированных штаммов или клинических изолятов в ходе данного эксперимента; «нд» — нет данных.

Note. «•» — antimicrobial activity has been evaluated against at least one tested strain of the given species; «°» — antimicrobial activity was not detected in any of the studied strains of the given species; «Д» — the antimicrobial activity of the species was first established against at least one of the tested strains or clinical isolates during this experiment; (Нд) — no data.

только в отношении коллекционных тест-штаммов, но и клинических изолятов с определённым спектром устойчивости к медицинским антибиотикам. При выделении штаммов актиномицетов из природы и культивировании на разработанных средах процент продуцентов варьируется от 15 до 50%. Этот разброс зависит не только от биоразнообразия природного источника, но также и от опыта исследователя, который при выборе клонов актиномицетов может, основываясь на морфологических характеристиках, идентифицировать и отклонить некоторые хорошо описанные виды, которые продуцируют хорошо известные антибиотики. Продуценты противогрибковых антибиотиков составляют около 1/5 от общего числа штаммов-продуцентов, то есть 3-10% от выделенных природных актиномицетов. Соответственно, 10 штаммов продуцентов антимикоти-ков, активных против двух тестируемых штаммов грибов, были отобраны приблизительно из 330-100 природных изолятов актиномицетов.

Литература/References

1. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2013. Available online: http://www.cdc.gov/dru-gresistance/threat-report-2013.

2. O'Neill J. The Review on Antimicrobial Resistance. Tackling drug-resistant infections globally: Final report and recommendations, 2016. Available online: http://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20 paper_with%20cover.pdf.

3. Berdy J. Thoughts and facts about antibiotics: Where we are now and where we are heading. J Antibiot. 2012; 65: 385-395.

4. Ефименко Т.А.; ТереховаЛ.П.;Ефременкова O.B. Современное состояние проблемы антибиотикорезистентности патогенных бактерий. Анибиотики и химиотер. 2019; 64: 5-6, 64-68. [Efimenko ТА., Terekhova L.P., Efremenkova O.V.Current state the problem of antibiotic resistance of pathogens. Antibiotiki i Khimioter. 2019; 64 (5-6): 64-68. (in Russian)]

5. GlukhovaAA, Karabanova A.A., YakushevA.V., SemenyukI.I., Boykova Y.V., MalkinaN.D., Efimenko TA, Ivankova T.D., TerekhovaL.P., Efremen-

Благодаря сотрудничеству академического института и клинического центра мы смогли определить 4 самых обнадёживающих продуцентов для химических исследований с целью изыскания новых антибиотиков.

Заключение

Актиномицеты по-прежнему являются важными объектами поиска новых антибиотиков. Для повышения эффективности поиска мы считаем целесообразным отбирать потенциальные продуценты антибиотиков на основе видовой принадлежности с учётом предыдущих научных публикаций по соответствующим видам, а также активности, продемонстрированной изученными штаммами в отношении клинических изолятов с множественной устойчивостью к антибиотикам.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

kova O.V.Antibiotic Activity of Actinobacteria from Digestive Tract of Millipede Nedyopus dawydoffiae (Diplopoda). Antibiotics (Basel). 2018; 7: 4: 94. doi: 10.3390/antibiotics7040094.

6. ValagurovaE.V., Kozyritskaya V.E., lutinskaya GA.Actinomycetes of Strep-tomyces genus. (in Russian) Publisher «Scientific Book»: Kiev, Ukraine, 2003; 1-645.

7. Goodfellow M., Kämpfer P., Busse H.-J., Suzuki K., Ludwig W., Whitman W.B. feds.). Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd ed.; SpringerVerlag, New York, USA; 2012; 5: A: 376-419, 1455-1768.

8. Demiankova M.V., Kalashnikova E.A., Glukhova A.A., Ivankova T.D., Terekhova L.P., Boykova Y.V., Efimenko T.A., Efremenkova O.V.Activity of the strain Streptomyces hydrogenans against phytopathogenic fungi. Open Acc J Envi Soi Sci (OAJESS). 2018; 1: 5:103-105, doi:10.32474/0A-JESS.2018.01.000121.

9. Brown M.S., Akopiants K., Resceck D.M., McArthur HA.I, McCormick E, ReynoldsKA. Biosynthetic Origins of the natural product, thiolactomycin: A unique and selective inhibitor of type II dissociated fatty acid synthases. J Am Chem Soc. 2003; 125 (34): 10166-10167. doi: 10.1021/ja034540i.

10. Fulmer T. Fatty acid synthase II (FASII) pathway. Science-Business exchange 2009, 2, 11, 430-430. doi: 10.1038/scibx.2009.430.

11. TatsutaK., Gunji H, Tajima S., IshiyamaT., Imai S., Okuyama S, Fukatsu S. Biosynthetic studies on oleandomycin by incorporation of the chemically synthesized aglycones. J Antibiot. 1990; 43: 909-911. doi: 10.7164/anti-biotics.43.909.

12. Vilches C., Hernandez C., Mendez C., Salas J.A. Role of glycosylation and deglycosylation in biosynthesis of and resistance to oleandomycin in the producer organism, Streptomyces antibioticus. J Bact. 1992; 174: 1: 161-165. doi: 10.1128/jb.174.1.161-165.1992.

13. SchimanaJ., FiedlerH.-P., Groth I., SubmuthR., Beil W., WalkerM.,Zeeck A. Simocyclinones, novel cytostatic angucyclinone antibiotics produced by Streptomyces antibioticus Tü 6040. I. Taxonomy, fermentation, isolation and biological activities. J Antibiot. 2000; 53 (8): 779-787. doi: 10.7164/antibiotics.53.779.

14. Hollstein U. Actinomycin. Chemistry and mechanism of action. Chem Rev. 1974; 74 (6): 625-652. doi: 10.1021/cr60292a002.

15. Hütter R., Keller-Schierlein W., KnüselF., Prelog V., Rodgers G. C. The metabolic products of microorganisms. Boromycin. Helvetica Chimica Acta. 1967; 50 (6): 1533-1539.

16. Waisvisz J.M., van derHoeven M.G., van Peppen J, Zwennis W.C.M. Bot-tromycin. I. A new sulfur-containing antibiotic. J Am Chem Soc. 1957; 79 (16): 4520-4521. doi: 10.1021/ja01573a072.

17. Yamazaki M., Yamashita T., Harada T., Nishikiori T., Saito S., Shimada N., Fujii A. 44-Homooligomycins A and B, new anti-tumor antibiotics from Streptomyces bottropensis producing organisms, fermentation, isolation, structure elucidation and biological properties. J Antibiot. 1992; 45 (2): 171-179. doi: 10.7164/antibiotics.45.171.

18. Leach B.E., Calhoun K.M., Johnson LeRoy E., Teeters C.M., Jackson W.G. Char-treusin, a new antibiotic produced by Streptomyces chartreusis, a new species. J Am Chem Soc. 1953; 75 (16): 4011-4012. doi: 10.1021/ja01112a040.

19. Wu Q., Liang J., Lin S., ZhouX., Bai L., DengZ., WangZ. Characterization of the biosynthesis gene cluster for the pyrrole polyether antibiotic cal-cimycin (A23187) in Streptomyces chartreusis NRRL 3882. Antim Agent Chem. 2011; 55 (3): 974-982. doi: 10.1128/AAC.01130-10.

20. Miller-Wideman M., Makkar N., Tran M., Isaac B., Biest N., Stonard R. Herboxidiene, a new herbicidal substance from Streptomyces chromo-fuscus A7847. Taxonomy, fermentation, isolation, physico-chemical and biological properties. J Antibiot (Tokyo). 1992; 45 (6): 914-921. doi: 10.7164/antibiotics.45.914.

21. FujiwaraA., TazoeM., Hoshino T., Sekine Y., FujiwaraM. Structural studies of an antracyclinone antibiotic SM-173B produced by Streptomyces chro-mofuscus SM-173. Symposium on the Chemistry of Natural Products, symposium papers. 1979; 22: Abstr. No. 59: 448-455.

22. Akiko F., Mitsuhiko F., Tatsuo H., Yuzuru S., Masaaki T. Antibiotic SM-173B. Patent US 4206129, June 3, 1980.

23. Kulkarni M., Gorthi S., Banerjee G., Chattopadhyay P. Production, characterization and optimization of actinomycin D from Streptomyces hy-drogenans IB310, an antagonistic bacterium against phytopathogens. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2017, 10, 69-74. doi: 10.1016/j.bcab.2017.02.009.

24. Hayashi T., Noto T., Nawata Y., Okazaki H., Sawada M., Ando K. Cy-anocycline A, a new antibiotic. Taxonomy of the producing organism, fermentation, isolation and characterization. J Antibiot (Tokyo). 1982; 35 (7): 771-777. doi: 10.7164/antibiotics.35.771.

Информация об авторах

Демьянкова Мария Владимировна — м. н. с., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

Садыкова Вера Сергеевна — зав. лаб. таксономического изучения и коллекции культур микроорганизмов, зам. директора ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

Глухова Алла Алексеевна — н. с., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

Ефименко Татьяна Александровна — с. н. с., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

Бойкова Юлия Вадимовна — н. с., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

25. Gould S.J., He W, ConeM.C. New cyanocyclines from a cyanide-treated broth of Streptomyces lusitanus. J Nat Prod. 1993; 56 (8): 1239-1245. doi: 10.1021/np50098a006.

26. Kluepfel D, Baker H. A., Piattoni G., Sehgal S. N., Sidorowicz A., Singh K, Vezina C. Naphthyridinomycin, a new broad-spectrum antibiotic. J Antibiot (Tokyo). 1975; 28 (7): 497-502. doi: 10.7164/antibiotics.28.497.

27. Villax I. Process of fermentation of chlortetracycline and tetracycline antibiotics. Patent US 3401088 A. Sept., 10, 1968.

28. Han Z, Xu Y., McConnell O, Liu L, Li Y., Qi S, Huang X., Qian P. Two an-timycin a analogues from marine-derived actinomycete Streptomyces lusitanus. Mar Drugs. 2012; 10 (3): 668-676. doi: 10.3390/md10030668.

29. FinlayA.C., HochsteinF.A., SobinBA, Murphy F.X Netropsin, a New antibiotic produced by a Streptomyces. J Am Chem Soc. 1951; 73 (1): 341-343. doi: 10.1021/ja01145a113.

30. Arcamone F., Cassinelli G., Fantini G., Grein A., Orezzi P., Pol C., Spalla C. Adriamycin, 14-hydroxydaimomycin, a new antitumor antibiotic from S.peucetius var. caesius. Biothecnology and Bioengineering, 1969; 11 (6) 1101-1110. doi: 10.1002/bit.260110607.

31. Grein A, Spalla C, Di Marco A, Canevazzi G. Descrizione e classificazione di un attinomiceti (Streptomyces peucetius sp. nova) produttore di una sostanza attivita antitumorale: La daunomicina. (in Italian) G Microbiol. 1963; 11: 109-118.

32. Guilfoile P.G., Hutchinson C.R. A bacterial analog of the mdr gene of mammalian tumor cells is present in Streptomyces peucetius, the producer of daunorubicin and doxorubicin. PNAS. 1991; 88 (19): 8553-8557. doi: 10.1073/pnas.88.19.8553.

33. BoucherH.W., TalbotG.H., BradleyJ.S., EdwardsJ.E., GilbertD, RiceL.B., Scheld M, Spellberg B., Bartlett J. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! Clin Infect Dis. 2009; 48 (1): 1-12. doi: 10.1086/595011.

34. Tacconelli E, Magrini N, World Health Organisation. 2017, Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. Available on line: https://www.who.int/ medicines/publications/WHO-PPL-Short_Summary_25Feb-ET_NM_WHO.pdf

35. Beardsley J., Halliday C.L., Chen S.C-A, Sorrell T.C. Responding to the emergence of antifungal drug resistance: perspectives from the bench and the bedside. Future Microbiol. 2018, 13, 10, 1175-1191. doi: 10.2217/fmb-2018-0059.

36. Fisher M.C., Hawkins N.J., Sanglard D., Gurr S.J. Worldwide emergence of resistance to antifungal drugs challenges human health and food security. Science. 2018; 360 (6390): 739-742. doi: 10.1126/science.aap7999.

37. Butler M.S., Cooper M.A. Antibiotics in the clinical pipeline in 2011. J Antibiot. 2011; 64 (6): 413-425. doi: 10.1038/ja.2011.44.

38. Butler M.S., Blaskovich MA, Cooper MA. Antibiotics in the clinical pipeline in 2013. J Antibiot. 2013; 66 (10): 571-591. doi: 10.1038/ja.2013.86.

39. Butler M.S., Blaskovich MA, Cooper MA. Antibiotics in the clinical pipeline at the end of 2015. J Antibiot. 2017; 70 (1): 3-24. doi: 10.1038/ja.2016.72.

40. Berdy J. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot. 2005; 58 (1): 1-26. doi: 10.1038/ja.2005.

41. Baltz R.H. Marcel Faber Roundtable: is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration? J Ind Microbiol Biotechnol. 2006; 33 (7): 507-513. doi: 10.1007/s10295-005-0077-9.

About the authors

Mariya V. Demiankova — Junior Researcher, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Vera S. Sadykova — Head of the Laboratory of Taxonomic Study and Collection of Microorganism Cultures, Deputy Director, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Alla A. Glukhova — Researcher, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Tatiana A. Efimenko — Senior Researcher, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Yuliya V. Boykova — Researcher, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Малкина Наталия Дмитриевна — н. с., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

Кормилицина Виктория Георгивна — лаборант-исследователь, ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В. И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

Шарапченко Софья Олеговна — лаборант- исследователь, ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В. И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

Сумарукова Ирина Георгиевна — н. с., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация Васильева Бязиля Ф. — н. с., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва Российская Федерация

Иванкова Татьяна Дмитриевна — м. н. с., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

Терехова Лариса Петровна — ведущий научный сотрудник, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

Габриэлян Нина Индзаровна — заведующая отделом, ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В. И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация Ефременкова Ольга Владимировна — заведующий сектора, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва, Российская Федерация

Natalia D. Malkina — Researcher, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Victoria G. Kormilitsina — Laboratory Assistant-Researcher, Academician V I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Moscow, Russian Federation

Sofya O. Sharapchenko — Laboratory Assistant-Researcher, Academician V I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Moscow, Russian Federation

Irina G. Sumarukova — Researcher, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Byazilya F. Vasilieva — Researcher, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Tatiana D. Ivankova — Junior Researcher, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Larissa P. Terekhova — Leading Researcher, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation

Nina I. Gabrielyan—Head ofDepartment, AcademicianV I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Moscow, Russian Federation

Olga V. Efremenkova — Head of the Sector, Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, Russian Federation