Ирумамицин, образуемый Streptomyces roseoflavus ина-1278 Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Ирумамицин, образуемый Streptomyces roseoflavus ИНА-1278

О. А. ЛАПЧИНСКАЯ, Г. С. КАТРУХА, Л. П. ТЕРЕХОВА, Е. Г. ГЛАДКИХ, В. В. КУЛЯЕВА, В. В. ПОГОЖЕВА, Г.И.ОРЛОВА, А. С. ТРЕНИН, Г. Б. ФЕДОРОВА

НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Irumamicin Produced by Streptomyces roseoflavus INA-1278

O. A. LAPCHINSKAYA, G. S. KATRUKHA, L. P. TEREKHOVA, E. G. GLADKIKH, V. V. KULYAEVA, V. V. POGOZHEVA, G. I. ORLOVA, A. S. TRENIN, G. B. FEDOROVA

G. F. Gause Institute of New Antibiotics, Moscow

Представлено микробиологическое описание штамма Streptomyces roseoflavus ИНА-1278 — нового продуцента макролид-ного противогрибкового антибиотика ирумамицина. Ирумамицин 1278, образуемый новыш продуцентом, по противоми-кробной активности отличается от ирумамицина, образуемого известным мировыш продуцентом Streptomyces subflavus subsp. irumaensis subsp. nov. AM-3603.

Ключевые слова: макролидный антибиотик, штамм-продуцент, противогрибковая активность.

The strain Streptomyces roseoflavus INA-1278 is described as a new irumamicin producer. Irumamicin 1278 is different by the antifungal activity from irumamicin produced by the world-known strain Streptomyces subflavus subsp. Irumaensis subps. nov. AM-3603.

Key words: macrolide, producer, antifungal activity.

Введение

Согласно программе систематического скрининга новых продуцентов среди актиномицетов как основного источника практически значимыгх биологически активных соединений и селекции на повышение биосинтетической активности почвенных культур, в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе был получен штамм Streptomyces roseoflavus ИНА-1278, образующий антибиотик с выраженной антифун-гальной активностью in vitro [1].

На основании совокупности изученных методами масс-спектрометрии и спектроскопии 1Н, 13С, ЯМР, MS, IR физико-химических свойств и при использовании базы данных природных биологически активных веществ (BNPD), разработанной Я. Берди (Венгрия), антибиотик ИНА-1278 был отнесен к 20-членным макролидам группы ирумамицина [2, 3] и практически оказался идентичен ирумамицину.

В настоящей статье представлены результаты микробиологического изучения штамма-продуцента Streptomyces roseoflavus ИНА-1278, а также данные по биосинтезу и анализу некоторых свойств ирумамицина 1278 в сравнении с проти-

© Коллектив авторов, 2015

Адрес для корреспонденции: 119021 Москва, Б.Пироговская, д. 11, стр. 1. НИИНА им. Г. Ф. Гаузе

вогрибковым антибиотиком ирумамицином, образуемым известным мировым продуцентом Streptomyces roseoflavus.

Материал и методы

Штамм-продуцент Streptomyces roseoflavus ИНА-1278 получен из почвенной культуры ступенчатой селекцией на повышение биосинтетической активности с применением N-ме-тил-№-нитро-К-нитрозогуанидина с последующим высевом мутагенизированной популяции спор на агаровые среды, содержащие антибиотики (эритромицин, блеомицин, стрептомицин, фузидин) в качестве селективных агентов.

Микробиологическое изучение культурально-морфоло-гических и физиолого-биохимических свойств штамма ИНА 1278 проводили на диагностических средах, принятых в лабораторной практике для описания актиномицетов [4].

Биосинтез ирумамицина осуществляли при двухстадий-ной ферментации в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл в 100 мл питательной среды на круговой качалке, 220 об/мин при 28°С.

Культуру продуцента выращивали на агаровой среде № 2 Гаузе при 37°С в течение 5—7 сут. Полученными агаровыми блочками 0,5 см2 засевали колбы с посевной средой № 2 Гаузе (с бульоном Хоттингера). В колбы с ферментационной средой вносили 7—10% 48-часового посевного материала. Длительность культивирования составила 96—120 ч.

Содержание ирумамицина в ферментационной жидкости определяли после экстракции бутанолом (1:1) с использованием метода ТСХ на пластинках Kieselgel 60 «Merck» в системе органических растворителей гексан—ацетон (1:1) с биоавтографическим проявлением по тест-культуре Aspergilus niger INA 00760, инокулированной в агар № 2 Гаузе после 18 ч инкубирования при 37°С.

Таблица 1. Культурально-морфологические признаки штамма ИНА-1278

Агаровая среда

Рост воздушного мицелия

Цвет мицелия

Растворимый пигмент

воздушного

субстратного

№ 1 Гаузе

Овсяная

Чапека

Глюкозо-аспарагиновая

Линденбайна (глицерин-нитратная) Красильникова СР-1 № 2 Гаузе

Треснера (с пептоном и лимоннокислым железом)

+++ ++ +++ + +++ ++

Серовато-белый до розоватого (Д-3, Р-2) Бледно-буроватый (Б-6) Беловатый

(Д-3) Желтоватый (Ж-1) Беловато-кремовый (Д-3, Соо6)

Нет роста Беловато-розоватый (Д-3, Г-3)

Бледно-буроватый

(Б-4) Серовато-желтый (Д-3, Ж-1) Буровато-желтоватый (Д-4) Бледно-буроватый (Б-4) Желтовато-кремовый (Б-6)

Беловато-кремоватый (Д-3, Б-6)

Меланоидные пигменты не образует

Слабый светло-желтый (Д-4) нет

Примечание. */ ( + + + ) - хороший; ( + + ) - умеренный; ( + ) - слабый.

нет

нет

нет

нет

Выделение и химическую очистку субстанции ирумами-цина 1278 проводили по специально разработанной схеме многостадийного процесса экстракции и колоночной хроматографии, а также аналитических методов характеристики физико-химических свойств биосинтетического продукта, подробно описанных ранее [1].

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) (мкг/мл) в отношении различных микробных культур определяли добавлением полученного ирумамицина в убывающих концентрациях к среде № 2 Гаузе.

Использовались тест-культуры Aspergillus niger INA 00760, ки INA 00760, Candida albicans Ки INA 00763 — из шток-образцов коллекции НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Bacillus subtilis АТСС 6633.

Результаты и обсуждение

Микробиологическое описание штамма ИНА-1278 проводили на следующих диагностических средах: минеральном агаре № 1 Гаузе, органическом агаре № 2 Гаузе, глюкозо-аспараги-новом агаре и сахарозо-нитратном агаре (среда Чапека), глюкозо-нитратном агаре (среда Красильникова), глицерин-нитратном агаре (среда Линденбайна). На диагностических средах определяли цвет воздушного и субстратного мицелия, наличие растворимых пигментов — на среде Треснера с пептоном и лимоннокислым железом. Для оценки цветов мицелия использовали шкалы Бондарцева и Праузера. Споровый посевной материал 10-дневной культуры штамма, выращенной на глицерин-нитратной агаровой среде Линденбайна, высевали на скошенный агар; инкубировали при 28°С в течение 7—21 сут.

Штамм ИНА-1278 характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками (табл. 1).

Морфологические признаки. Цепочки спор прямые, извилистые, поверхность спор гладкая.

Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на агаре № 2 Гаузе штамм подав-

ляет рост грамположительных бактерий и дрож-жеподобных грибов.

По культурально-морфологическим характеристикам штамм-продуцент ИНА-1278 соответствует типовой культуре Streptomyces roseoflavus ЛгаИ951 (одобренный список, 1980), для которой известно образование флавомицина и ряда структурно связанных с ним аминогликозидных антибиотиков. Известным мировым продуцентом ирумамицина является таксономически другая культура актиномицета S.subflavus 8иЪ8р. 1гитаеш18 8иЪ8р. иоу. АМ-3603 [2].

Физиолого-биохимические свойства штамма ИНА-1278. Типичный аэроб. Растёт при (24—45)°С, оптимум роста 28°С и в диапазонах значений рН (5,0-10,0) с оптимумом роста при рН 7,0. Желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимоннокислым железом. Устойчив к №С1 (3,5 %) при росте на среде № 2 Гаузе.

Отношение к углеводам: хорошо использует фруктозу, мальтозу, рамнозу; умеренно глюкозу, арабинозу, лактозу, слабо использует сахарозу, сорбит, маннит, не использует раффинозу и целлюлозу при росте на средах с неорганическим источником азота.

Биосинтез ирумамицина: осуществлялся в жидкой питательной среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода (%: глюкоза — 3,0; соевая мука 3,0; MgSO4 — 0,4; №С1 — 0,5; СаС03 — 0,3) с максимальным накоплением антибиотика в мицелии продуцента к 96 ч ферментационного процесса при завершении роста культуры и сохраняющимся до 120 ч культивирования (рН 7,6—7,8).

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 2. Физико-химические свойства ирумамицина 1278 и антибиотика ирумамицина

Свойства Ирумамицин 1278 Антибиотик ирумамицин [2]

Брутто-формула (Мол. масса)

Мол. масса. Метод MALDI-TOF (m/z) UV-VIS спектр (EtOH), lmax, нм ИК-спектр (KBr), vmax, см-1

C41H65NO12 (763)

786,4 (M+Na)+ 802,4 (M+K)+ 232

3456; 2968-2856; 1720; 1603; 1381; 1075; 973 +40° (c 1,0, CHCl3)

ТСХ (8102), ^гв системе:

гексан—хлороформ—метанол (5:1:1) этилацетат—гексан (1:1) бензол—ацетон (1:1) Качественная реакция: нингидрин

анисовый альдегид + Н28О4 (КН4)804 + КН4Н804 + нагревание Растворимость:

0,3 0,87 0,63

C41H65NO12 (763) С 65,7; H 8,54, N 1,95%

232

3400; 2960-2920; 1700; 1590;1330; 1073 + 12° (с 1,0,CHCl3)

0,4 0,87 0,84

легко растворим

нерастворим

Ацетон, этилацетат, низшие спирты, толуол, диэтиловый эфир Гексан, вода

Ацетон, этилацетат, метанол, этанол, бензол, DMSO, диэтиловый эфир Гексан, вода

[а]20

D

+

Таблица 3. Сравнительная антимикробная активность ирумамицина 1278 in vitro

Тест-микроорганизм _МПК, мкг/мл_

ирумамицин l278 ирумамицин [2]

Candida albicans 100

Ки INA 00763 4,2

Aspergillus niger 100

INA 00760 0,2

Ки INA 00760 0,3

B.subtilis АТСС 6633 12,5 н/а

Ирумамицин 1278, полученный из мицелия продуцента в виде хроматографически очищенного белого кристаллического порошка, по основным физико-химическим свойствам идентичен известному антибиотику ирумамицину (табл. 2).

При этом существуют незначительные различия в хроматографическом поведении (значения Rf) в двух из трёх использованных системах растворителей (гексан—хлороформ—метанол; бензол—ацетон), а также в показателях угла вращения.

В противоположность этому, весьма существенны различия ирумамицинов по противоми-кробной активности in vitro (табл. 3).

Превосходство ирумамицина 1278 по противогрибковой активности выражается в более чем десятикратно меньших значениях МПК для A.niger и для Candida albicans. Отличительным признаком ирумамицина 1278 является также наличие умеренной антибиотической активности в отношении грамположительной тест-культуры B.subtilis.

Полученные результаты указывают на целесообразность развития исследований по уточнению и детализации пространственной структуры иру-мамицина 1278, не выявленные возможные отличия которой определяют существенный сдвиг в биологической активности природного макролид-ного соединения, образуемого новым продуцентом. Одновременно с этим, обоснованно изучение его лечебных свойств in vivo, перспективность которых при грибковых инфекциях подтверждается

данными о сопоставимости in vitro противогрибкового эффекта ирумамицина 1278 в отношении A.niger с амфотерицином В [6].

Ирумамицин 1278, являясь типичным макро-лидным соединением, представляет также исследовательский интерес с точки зрения новых тест-моделей для обнаружения возможных фармакологических свойств, многообразие и медицинская значимость которых характерны для макролидных антибиотиков.

Заключение

Проведено микробиологическое описание культурально-морфологических и физиолого-би-охимических свойств штамма S.roseoflavus ИНА-1278 — продуцента противогрибкового макро-лидного антибиотика ирумамицина, известным продуцентом которого является культура актино-мицета S.subflavus.

При идентичности химических структур иру-мамицинов, образуемых двумя таксономически различными актиномицетами, ирумамицин нового продуцента существенно отличается по показателям противомикробной активности in vitro.

Полученные данные указывают на необходимость развития исследований по уточнению и детализации пространственной ориентации структуры ирумамицина 1278 и по определению возможной медицинской значимости его противогрибкового эффекта in vivo.

ЛИТЕРАТУРА

1. Shashkov A.C., Tsvetkov D.E, Lapchinskaya O.A., Kulyaeva V.V. et al. Structure, 1H and 13C NMR spectra, and biological activity of the antibiotic INA-1278 related to irumamicin and produced by the experimental Streptomyces sp. strain No. 1278. Chem Bull Int Ed 2011; 60: 11: 2412-2417.

2. Omura S., Tanaka Y., Takahashi Y. et al. Irumamicin, an antifungial 20-membered macrolide produced by Streptomyces. Taxonomy, fermentation and biological properties. J Antibiot 1984; 37:12: 1572—1578.

3. Omura S., Tanaka Y., Nakagawa A. et al. Irumamicin, a new antibiotic active against phytopathogenic fungi. J Antibiot 1982; 82: 2: 256—257.

4. Chirling E.B., Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species. Int J Syst Bacteriol 1966; 16: 313—340.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Латинская О.А. — д. б. н., зав. лабораторией; НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Катруха Г.С. — д. х. н., профессор, сотрудник НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Терехова Л.П. — д. б. н., профессор, зав. лабораторией, НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Гладких Е.Г. — к. б. н., старший научный сотрудник НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

5. Гаузе Г.Ф., Преображенская М.Н., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель акгиномицетов. М.:1984; Наука, 130. / Gauze G.F., Preobrazhenskaja M.N., Sveshnikova M.A., Terehova L.P., Maksimova T.S. Opredelitel' aktinomicetov. M.:1984; Nauka, 130. [in Russian]

6. Тренин А.С., Латинская О.А., Куляева ВВ. и др. ИНА-1278 — антибиотик из группы ирумамицинов, обладающий высокой противогрибковой активностью. Современная микология в России. Том 3. Материалы III Съезда микологов России. М.: 2012; 355. / Trenin A.S., Lapchinskaja O.A., Kuljaeva V.V. i dr. INA-1278 — antibiotik iz gruppy irumamicinov, obladajushhij vysokoj protivo-gribkovoj aktivnost'ju. Sovremennaja mikologija v Rossii. Tom 3. Materialy III S#ezda mikologov Rossii. M.: 2012; 355. [in Russian]

Куляева В.В. — к. б. н., старший научный сотрудник НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Погожева В.В. —научный сотрудник НИИНА им. Г. Ф. Га-узе, Москва

Орлова Г.И. — к. б. н., научный сотрудник НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Тренин А.С. — д. б. н., руководитель сектора НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Федорова Г.Б. — к. б. н., старший научный сотрудник НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, Москва