CC BY
113
УДК 619:616-097
Подготовка иммунных спленоцитов мышей линии balb/c для получения моноклональных антител специфичных к белкам кардиомаркерам характерных для инфарктного состояния
Г.О Картабаева., магистрант, А.Н. Джангулова, магистрант, А.И. Газизова, д.б.н., профессор, А.С. Сыздыкова, м.т.н. Казахский Агротехнический Университет имени Сакена Сейфуллина, г.Астана, Республика Казахстан
gauhar [email protected]
Инфаркт миокарда (ИМ) является одной из основных причин смертности во многих странах мира. Поэтому ранняя дифференциальная диагностика и лечение больных с подозрением на нестабильную стенокардию и острый инфаркт миокарда, как основных проявлений острого коронарного синдрома (ОКС), приобретают особую актуальность для клинической медицины.
Кардиомаркеры играют очень важную роль в диагностике острого инфаркта миокарда. Экспресс-тесты для ранней диагностики острого инфаркта миокарда (ОИМ) приобретают всё более широкое распространение в клинике. На первом месте по популярности находятся тропонины (I и Т), кардиомаркеры, которые в настоящее время играют ключевую роль в диагностике ОИМ и входят в список критериев универсального определения инфаркта миокарда.
Тропонины - это довольно крупные белки, с молекулярной массой 37 кДа (тропонин I) и 24 кДа (тропонин Т). Содержание этих двух белков в миокарде достаточно высокое и составляет для тропонина Т около 5 мг/г, а для тропонина I приблизительно 10 мг/г [3]. В миокарде эти белки в основном существуют в связанной форме, но небольшие количества также находятся в цитоплазме в свободной форме: 2,8-4,1% для тропонина I и 6-8% для тропонина T. Исследования показывают, что у здоровых людей уровень тропонинов в крови чрезвычайно низок и даже выраженная ишемия без некроза кардиомиоцитов не приводит к повышению их концентрации в кровотоке.
За последние 20 лет мировая медицина достигла больших успехов в лечении сердечно-сосудистых заболеваний, и ИМ в том числе.Такие методы, как тромболитическая терапия, реперфузия сердечной мышцы, баллонная ангиопластика во многих случаях позволяют восстановить кровообращение в сердечной мышце и спасти жизнь больного. Эффективность этих методов решающим образом зависит от времени между моментом возникновения острой сердечной недостаточности и началом проведения лечебных мероприятий.
Каждый час задержки значительно снижает вероятность положительного исхода. Поэтому большую роль в успешном лечении ИМ играет своевременная постановка диагноза. В результате выполнения работы будет разработана отечественная тест-система для
диагностики инфарктного состояния человека, предназначенная для выявления специфических биомаркеров.
Методы и материалы. В работе использовались лабораторные мыши линии Balb/c. химические и биологические препараты: Troponin T и I, среда RPMI-1640, пируват натрия, 7,5 %-ный бикарбонат натрия, Hepes, L-глютамин, 2-меркаптоэтанол, пристан, полный и неполный адъюванты Фрейнда, фетальная сыворотка плода коровы (СПК), полиэтиленгликоль (ПЭГ), препараты для проведения иммуноферментного анализа.
При проведении исследований применялись серологические, иммунохимические, биотехнологические и другие методы.
Результаты исследований
Иммунизация линейных мышей проводилась с целью получения иммунных лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела к исходному антигену, в данном случае к сердечным тропонинам. Лимфоциты необходимы для слияния с миеломными клетками, позволяющими получить штаммы гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела. Моноклональные антитела являются основными реагентами при конструировании теста для экспресс-диагностики инфаркта миокарда.
Иммунизацию мышей проводили по длительной схеме, включающей в себя четырехкратное парентеральное введение препарата в дозе 50 мкл с адъювантом Фрейнда в течение 8-ми недель с двухнедельными перерывами.
Таблица 1 - Схема иммунизации мышей линии Ба!Ь/ос препаратами сердечного Тропонина._
Дни иммунизации Адъюванты Доза, мкл Способ иммунизации
1 Полный адъювант Фрейнда 100 Внутрибрюшинно
14 Неполный адъювант Фрейнда 100 Внутрибрюшинно
17 Отбор крови для тестирования
28 ФСБ 100 Внутрибрюшинно
42 ФСБ 100 Внутрибрюшинно
45 Отбор крови для тестирования
50 Без адъюванта 50 Внутривенно
53 Отбор крови для тестирования
Как видно из таблицы 1, схема иммунизации предусматривала парентеральное введение 100 мкл препарата с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, компоненты тщательно смешивали до образования однородной суспензии. На 14-й день иммунизацию продолжили путем введения такого же количества препарата с неполным адъювантом Фрейнда. На 17-й день проводили отбор крови для проведения тестирования. В результате тестирования было
выявлено содержание специфических антител в сыворотках крови в титре 1:400, 1:800.
На 28-й и 42-й день иммунизации препарат вводили в смеси с фосфатно-солевым буфером. По окончании производили отбор крови для тестирования, в результате которого выявили наличие специфических антител в титрах 1:3200 и 1:6400. Было принято решение провести реиммунизацию внутривенно без добавления адъювантов. Тестирование выявило наличие антител в титрах 1:6400 и 1:12800.
Выделение иммунных спленоцитов проводили в стерильных условиях путем вымывания В-лимфоцитов методом перфузии из селезенки иммунизированных мышей. Затем произвели подсчет клеток в камере Горяева.
Заморозку клеток проводили в фетальной сыворотке плода с 1%-ным содержанием ДМСО и помещали в сосуды Дюара с жидким азотом.
Таким образом, в результате выполнения данного этапа исследований отработаны оптимальные схемы иммунизации мышей линии Balb/с препаратами сердечного тропонина I и Т и получены иммунные спленоциты мышей, продуцирующие специфические антитела к данным препаратам. Иммунные спленоциты будут использованы для получения гибридных штаммов продуцентов моноклональных антител и создания ИХА-тестов для диагностики ОИМ.
