CC BY
63
УДК 612.017.12+591.441 +571.27+577.27
МЫШИНЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ИЗОФЕРМЕНТУ С ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА: ПО ЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
А.Ю. Галкин1'2, А.Б. Бесараб1, Ю.В. Горшунов3, В.Ф. Соловьева4, А.М. Дуган1
Национальный технический университет Украины «Киевский политехнический институт», Украина, г. Киев, пр. Победы, 37, [email protected] 2Украина,ООО «УА «ПРОФАРМА», г. Киев, ул. М. Котельникова, 1.
3Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институт городского хозяйства, Украина, г. Киев, ул. Урицкого, 35.
4Украинский научно-исследовательский институт питания, фармации и биотехнологии, Украина, г. Киев, ул. Чигорина, 18.
Получен оригинальный набор из 15 клонов гибридом, продуцентов моноклональных антител (МАТ) к изоферменту С пероксидазы хрена (ПХ), с использованием в качестве источника лимфоцитов мышей инбредных линий NZB и Balb/c. Проведено углубленное изучение биологических свойств антител: установлена их специфичность, константа аффинности и титр в культуральной жидкости. Синтезированы конъюгаты полученных МАТ с щелочной фосфатазой, позволившие провести сравнительную эпитопную характеристику антител. Полученные МАТ направлены к белковой части, углеводным остаткам, а также к простатической группе фермента. Углеводный компонент ПХ оказался более иммуногенным для мышей исследуемых линий. Полученные МАТ направлены к 5 эпитопным регионам на молекуле ПХ: 3 из них представлены антигенными детерминантами белкового происхождения и 2 имеют углеводную природу. Два эпитопных региона, направленных к полипептидной цепи (условно обозначены нами П1 и П2), имеют близкую пространственную локализацию и значительно более сильно отдаленные от третьего эпитопного региона аналогичной специфичности (П3). Каждый из двух эпитопных регионов, направленных к углеводным остаткам (П4 и П5), представлены двумя эпитопами. Антигенная детерминанта П3, сформированная полипептидной цепью, имеет близкую пространственную локализацию с эпитопным регионом П5 на углеводной части фермента. Две альтернативные методики определения константы аффинности МАТ (Friguet и Scatchard) являются сопоставимыми, при определении констант аффинности антител к ПХ (коэффициент линейной корреляции между константами аффинности, определенных различными методами, составил 0,90). Ил. 3. Табл. 4. Библиогр. 27 назв.
Ключевые слова: моноклональные антитела; гибридома; пероксидаза хрена; аффинность; эпитоп-ное картирование.
MOUSE MONOCLONAL ANTIBODIES TO HORSERADISH PEROXIDASE ISOENZYME C: OBTAINING AND STUDY OF BIOLOGICAL PROPERTIES
A.Yu. Galkin1'2, A.B. Besarab1, Yu.V. Gorshunov3, V.F. Solov'eva4, A.M. Dugan1
National Technical University of Ukraine "Kiev Polytechnic Institute", 37, Peremohy Ave., Kiev, Ukraine, [email protected] 2 UA "PRO-PHARMA" LLC, 1, M. Kotelnikova St., Kiev, Ukraine
Research and Design-Technological Institute of Municipal Economy, 35, Uritskogo St., Kiev, Ukraine
4 Ukrainian Research Institute of Nutrition, Pharmacy and Biotechnology, 18, Chigorina St., Kiev, Ukraine
Original set of 15 clones of hybridomas producers of monoclonal antibodies (mAbs) to horseradish peroxidase isoenzyme C (using as a source of lymphocytes of mice of inbred strains NZB and Balb/c) was ob-
tained. A study of the biological properties of the antibodies (specificity, affinity constant and titer in culture) was realized. Conjugates of obtained mAbs with alkaline phosphatase were synthesized, and it allowed performing comparative epitope characterization of the resulting set of mAbs. Obtained mAbs are directed to the protein part, carbohydrate residues and enzyme prostatic group. Carbohydrate component of horseradish peroxidase is more immunogenic for mice of studied lines. Studied mAbs are directed to 5 epitopes regions of horseradish peroxidase molecule: 3 of them are protein origin antigenic determinants and 2 have carbohydrate nature. Two epitope regions, which are directed to the polypeptide chain (conditionally designated as P1, and P2), have similar spatial localization and much more distant from the third epitope region similar specificity (P3). Both epitope regions, which are directed to carbohydrate residues (P4, and P5), represented by two epitopes. P3 epitope which is formed by polypeptide chain has a close spatial localization of P5 epitope region (hydrocarbons of the enzyme). Two alternative methods for determining of the mAbs constants of affinity (Friguet, and Scatchard) are comparable (for determination of the affinity constants of antibodies to horseradish peroxidase): coefficient of linear correlation between the affinity constants defined by different methods was 0.90. 3 fig. 4 tables. 27 sources.
Key words: monoclonal antibodies; hybridomas; horseradish peroxidase; affinity; epitope mapping.
ВВЕДЕНИЕ
Пероксидазы относятся к ферментам класса оксидоредуктаз, катализируют реакции окисления широкого спектра субстратов перекисью водорода. Пероксидазы разделяются на два больших суперсемейства: животные и растительные. Последние в свою очередь включают три класса [5]. Изофермент С пероксидазы из корней хрена (horseradish peroxidase, ПХ) (КФ 1.11.1.7) является наиболее исследованным и используемым среди пероксидаз и рассматривается как модельный для третьего класса растительных пероксидаз. Фермент является гли-копротеином, молекула содержит простетиче-скую группу (Fe (!!!)-протопорферин-!Х), белковую глобулу, состоящую из 308 аминокислотных остатков, и 8 олигосахаридных цепей [6]. Молекулярная масса (м.м.) полипептидной цепи составляет около 34 кДа, а гликозилирован-ного белка - 44 кДа. Молекула ПХ содержит 4 дисульфидных связи и 2 иона кальция. Основной особенностью данной молекулы является наличие двух доменов и гемина в полости между ними [6]. Изоэлектрическая точка ПХ составляет 9,0, максимальная биологическая активность проявляется при рН 6-8 [5]. Данный фермент используют при разработке иммунологических тестов, биосенсоров и методов генной терапии, при создании маркеров для гистологических исследований, а также в биоорганическом синтезе [5,14,20,24,26]. Исследования структуры и механизмов действия ПХ, а также разработки в области иммунобиотехнологии иногда требуют наличия биореагентов - специфичных к ПХ антител. В данном случае наиболее адекватным является использование мо-ноклональных антител (МАТ) соответствующей специфичности, поскольку они в отличие от по-ликлональных сывороток характеризуются исключительной специфичностью и гомогенностью, а также возможностью получения практи-
чески неограниченных количеств. Идентичность изотипа и идиотипа МАТ от партии к партии обеспечивает воспроизводимость их качества, а следовательно и воспроизводимость аналитических методик [9].
Известен ряд работ по изучению антигенной структуры ПХ [10,12]. В рамках данных работ был проведен поиск линейных антигенных детерминант ПХ с использованием перекрывающихся синтетических гексапептидов-анало-гов соответствующих участков первичной последовательности фермента и поликлональных сывороток к ПХ (так называемая технология Рерэсап [2]). Был выявлен ряд линейных эпи-топов, расположенных в регулярных элементах вторичной структуры белка (альфа-спиралях): как внутри глобулы, так и на ее поверхности. Некоторые их эпитопов, входящие в состав неупорядоченных вторичных структур белковой молекулы, включали аминокислотные остатки, опосредующие биологическую активность фермента. Альтернативным методом изучения антигенной структуры биомолекул, позволяющим реализовывать прикладные задачи в области иммунологии и биотехнологии, является метод сравнительного эпитопного картирования, основанный на конкуренции различных МАТ, специфичных к заданному антигену [2]. Важным достоинством данного метода является его применимость к изучению антигенов различной природы, а также возможность выявления с его помощью как линейных, так и конформацион-ных антигенных детерминант.
Целью работы было получение новых мышиных моноклональных антител к изоферменту С пероксидазы хрена, изучение их биологических свойств, а также проведение сравнительного эпитопного картирования фермента при помощи полученных антител.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Иммунизация животных. Для иммунизации использовали мышей линий NZB и Balb/c: самок в возрасте 6-8 месяцев. Животных содержали в клетках при естественном освещении, температуре 20-22 °С; доступ к воде и пище был свободным. Исследования с животными проводили с соблюдением биоэтических норм [8].
В качестве иммуногена использовали пе-роксидазу хрена типа I (Sigma, США), представляющую собой обессоленную лиофильно высушенную субстанцию со специфической активностью 50-150 единиц/мг (при использовании пирогаллола в качестве субстрата). Первую иммунизацию проводили с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), последующие - с неполным адъювантом Фрейнда (ПАФ), для бустер-иммунизации использовали раствор иммуноге-на в физиологическом растворе. Для последовательных внутрибрюшных иммунизаций (0, 42-е, 56-е сутки) готовили эмульсию раствора иммуногена с адъювантом с финальной концентрацией 50 мкг на 100 мкл: ПХ растворяли в физиологическом растворе, добавляли аналогичный объем адъюванта и тщательно перемешивали до образования устойчивой эмульсии. Бустер-иммунизацию на 70-е сутки (50 мкг на 100 мкл) проводили в хвостовую вену мышей. На 4-е сутки после последней инъекции ПХ осуществляли гибридизацию спленоцитов селезенки мышей с клетками миеломы Sp 2/0.
Получение гибридом. Гибридизацию осуществляли с помощью полиэтиленгликоля 3500-3700 кДа (Sigma, США) по методике Kohler и Milstein [17] в модификации Lane и Koprowski [18]. Полученные клоны гибридом выращивали с помощью клеток питающего слоя (перитонеальные макрофаги) в полной ростовой среде [HY (Sigma, США) с 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Sigma, США)] с добавлением среды НАТ (Sigma, США). Клетки культивировали на 96-луночных планшетах для культур клеток (Costar, США). На 1012-е сутки растущие клоны тестировали на ПХ в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА). Положительными считали лунки, сигнал в которых в 2-3 раза превышал контроль конъюгата. Гибридомы из таких лунок пересаживали на 24-луночные планшеты с питающим слоем из перитонеальных макрофагов и культивировали в полной ростовой среде с добавлением среды НТ (Sigma, США), размножали и замораживали в среде, содержащей 50% сыворотки новорожденных телят (Sigma, США), 43% среды DMEM (Sigma, США), 7% ди-метилсульфоксида (Sigma, США). Отобранные культуральные жидкости использовали для определения специфичности МАТ, их титра и кон-
станты аффинности, а также изотипа. Специфичность МАТ проверяли в непрямом ТИФА при тестировании на нативный фермент, апо-фермент, химически модифицированный и ре-комбинантный (дегликозилированный) фермент. Отобранные клоны гибридом размораживали и клонировали несколько раз до полной стабильности по уровню синтеза антител. Клонирование осуществляли методом лимитирующих разведений на питающем слое из перито-неальных макрофагов в полной ростовой среде. Скрининг растущих клонов гибридом проводили на нативную ПХ в непрямом ТИФА. Гиб-ридомы, стабильно продуцирующие антитела, наращивали in vitro и для получения асцита вводили мышам, которые за 2 недели до того были праймованы вазелиновым маслом (0,5 мл внутрибрюшинно). Антитела выделяли из ас-цитной жидкости двукратным осаждением сульфатом натрия в концентрациях 18% и 16% (вес на объем) [15].
Твердофазный иммуноферментный анализ. Использовали три модификации ТИФА: прямой, непрямой и конкурентный анализ.
Прямой ТИФА использовали для установления специфичности полученных МАТ. На поверхности полистероловых планшетов высокой сорбционной емкости (Suzhou Conrem Biomedical Technology Co., Китай) иммобилизовали белок А стафилококка из раствора концентрацией 4 мкг/мл в 0,02 М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение ночи при температуре 4 °С (100 мкг/лунку). После промывки лунок планшета фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) с добавлением 0,05% твин-20, рН 7,2-7,4 (ФСБТ) в лунки вносили супернатанты гибридом. После инкубации в течение 1 ч при 37 °С и отмывания ФСБТ проводили детекцию связавшихся ПХ-специфических МАТ внесением в лунки раствора пероксидазы (10-7 М) в ФСБТ (100 мкл/лунку). Планшет инкубировали 1 ч при 37 °С, промывали ФСБТ и определяли активность связанного фермента добавляя суб-стратно-хромогенный раствор (3,3',5,5'-тетра-метилбензидин, 0,003% Н2О2, 0,15 М цитратный буфер, рН 5,0). После остановки ферментативной реакции измеряли оптическую плотность (ОП) раствора при длине волны 450 нм на спекторофотометре.
Непрямой ТИФА использовали для скрининга клонов гибридом и определения специфичности МАТ. На поверхности полистероло-вых планшетов для ИФА иммобилизовали ПХ (5 мкг/мл) в ФСБ, инкубировали с образцами содержащими МАТ. После отмывки проявляли образовавшиеся иммунные комплексы внесением конъюгата козьих поликлональных антител к иммуноглобулинам мыши с щелочной
фосфатазой (ЩФ). После внесения субстатно-хромогенной смеси (1 мг/мл л-нитрофе-нилфосфат, 1 М диэтаноламин и 0,5 М рН 9,8). После остановки ферментативной реакции измеряли ОП раствора при длине волны 405 нм на спекторофотометре.
Конкурентный ТИФА использовали для установления эпитопной специфичности полученных МАТ. ПХ в ФСБ в концентрации 5 мкг/мл на 96-луночные планшеты для ТИФА. Планшет инкубировали в течение ночи при 4 °С и дважды отмывали ФСБТ. Во все лунки планшета вносили исследуемые МАТ, конъюгиро-ванные с ЩФ. После чего в лунки разных рядов для конкуренции вносили МАТ других клонов в различных концентрациях: начинали с 0,4 мг/мл и каждый следующий раз разводили вдвое. В качестве контроля использовали разницу значений ОП конъюгата МАТ и ОП анализа при конкуренции одноименных МАТ. Дальнейшую процедуру проводили аналогично непрямому ТИФА.
Олределение аффинности антител проводили параллельно двумя методами. Метод Friguet с соавт. [13] заключался в следующем. Различные концентрации ПХ (от 10-9 до 10-6 моль/л) смешивали с образцами культу-ральных жидкостей, содержащих МАТ. Проинкубированные образцы (1 ч при 37 °С) переносили в 96-луночный планшет, предварительно сенсибилизированный ПХ. Далее осуществляли процедуру непрямого ТИФА. В качестве контроля использовали образцы культуральных жидкостей прежде не инкубированных с ПХ. Для построения калибровочных кривых с целью количественного определения антител использовали метод непрямого ТИФА в следующем исполнении. На поверхности планшетов иммобилизовали антиген из раствора с концентрацией 10 мкг/мл в карбонатном буфере рН 9,5 в течение ночи при 4 °С. После промывки лунок ФСБТ проводили раститровку МАТ с шагом ЛА, начиная с 5 мкг/мл. В качестве контрольных использовали лунки, в которые на данном этапе вносили ФСБТ. После инкубации в течение 30 мин при 37 °С и отмывки ФСБТ, детекцию связанных антител проводили, внося в лунки конъюгат антимышиных антител с ЩФ. Планшет инкубировали 1 ч при 37 °С, промывали ФСБТ и измеряли активность фермента в связанном конъюгате. Константу аффинности МАТ рассчитывали по уравнению, предложенному Бобровником и соавт. [1].
Метод Scatchard заключался в следующем. На поверхности планшетов сорбировали исследуемые МАТ в концентрациях 0,5, 1 и 2 мкг/мл в карбонатном буфере рН 9,5 в течение ночи при 4 °С, затем планшет отмывали
ФСБТ. В лунки добавляли раствор ПХ в концентрациях от 5 х 10-11 до 5 х 10-8 М, инкубировали
1 ч при 37 °С. После этого определяли активность фермента, который не связался с антителами на твердой фазе. Исходную концентрацию пероксидазы в лунках находили по предварительно построенному калибровочному графику. Количество фермента, связанного с анти-т е лами, определяли как разницу исходного и свободного (несвязанного) антигена. Значения констант рассчитывали как тангенсы угла наклона прямых в соответствующих координатах [21,23].
Определение изотипа МАТ. Изотип полученных МАТ определяли с использованием стандартного набора для изотипирования ИSO-
2 (Sigma, США). Изотипирование проводили с помощью антигенопосредованного ТИФА. Для этого в планшет сенсибилизированный ПХ вносили культуральные жидкости гибридом в шести повторах. Изотип определяли с помощью моноспецифических козьих сывороток. Типи-рующие антитела проявляли антикозьим конъ-югатом с ЩФ. Учет результатов проводили в соответствии с рекомендациями производителя.
Получение апо-пероксидазы (апоПХ) проводили по методике Yonetani [19]. К раствору пероксидазы (10 мг/мл в дистиллированной воде) добавляли раствор KF (1/10 от общего объема) в финальной концентрации 0,1 М. Смесь охлаждали до 4 °С и добавляли 1 М раствор HCl до рН 2,5. Через 10 с после этого проводили экстракцию гемина 2-кратным избытком ме-тилэтилкетона (по объему). Повторяли экстракцию еще 2 раза свежими порциями метилэтил-кетона. Все использованные реагенты предварительно охлаждали до 4 °С. Водный раствор, содержащий апоПХ, нейтрализовали до рН 7,0 с помощью 1 М раствора карбоната аммония, а затем обессоливали на колонке с сефадексом G-25. К полученному раствору апоПХ добавляли 0,01 М раствор CaCl2 до финальной концентрации 0,1 мМ и диализировали против ФСБ рН 7,4 при 4 °С в течение ночи.
Химическая модификация ПХ. Для получения пероксидазы с модифицированными глико-зидными остатками фермент (1 мг/мл) обрабатывали 10 мМ NaJ04 в 50 мМ ацетатном буфере рН 4,5 при 4 °С в течение 18 ч с последующей нейтрализацией 10-кратным ФСБ [16].
Получение конъюгата антител и ЩФ.
3 мкг ЩФ с активностью 1000 ед./мг (Sigma, США) растворяли в 100 мкл 0,1 фосфатного буфера, рН 6,8. Добавляли 300 мкл (концентрация 10 мг/мл) раствора очищенных антител. К смеси добавляли глутаровый альдегид в концентрации 1% и инкубировали 3 ч при темпера-
туре 20 °С. Смесь диализировали в течение ночи при 4 °С против фосфатного буфера с 0,05 М трис-НС1, 0,5 М №С1 и 1 мМ МдСЬ (рН 8,8). Активность полученного конъюгата составляла 600-700 ед./мг (определенная по методу [7]).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В результате двух гибридизации (со спле-ноцитами мышей линии NZB и Ва1Ь/с) было получено в каждом случае по 500 + 600 клонов гибридом. При первичном тестировании после гибридизации антитела к нативной ПХ были обнаружены во всех лунках семи планшетов. С целью выявления наиболее активных клонов гибридом культуральные жидкости при скрининге разбавляли в несколько раз, что позволяло значительно снизить фоновый сигнал. Таким образом, был отобран 41 клон (25 клонов гиб-
ридом от спленоцитов мышей линии NZB и 16 клонов гибридом от спленоцитов мышей линии Ва1Ь/с), которые имели наиболее высокие сигналы по результатам непрямого ТИФА. Все отобранные гибридомы были криоконсервиро-ваны, а культуральные жидкости оставлены для дальнейшего изучения. После повторного тестирования на нативную ПХ (нПХ) высокая активность МАТ подтвердилась для 26 клонов гибридом (табл. 1).
Для изучения специфичности МАТ на следующем этапе супернатанты отобранных клонов гибридом дополнительно тестировали на: апофермент (апоПХ), химически модифицированный (модПХ) и рекомбинантный (дегликози-лированный) фермент (рПХ). Анализ результатов исследования позволил разделить полученные МАТ на три группы специфичности:
I группа - 9 клонов характеризовались
Таблица 1
Характеристика моноклональных антител к пероксидазе хрена_
ОП в непрямом ТИФА при Константа
Группа Название МАТ тестировании на Титр в КЖ 1) аффинности^,
специ- Изотип 109 М-1 Эпитоп
фичности нПХ апоПХ модПХ рПХ метод Рг1дыв1 метод Бса^Иа^
Антитела, полученные на основе лимфоцитов мышей линии NZB
I 192В7 2,213 0,940 1,902 1,044 ^01 _2) - - -
I 192Р10 1,542 1,472 1,242 1,117 1 : 400 8,0 11,3 П1
I 193С7 1,466 1,561 1,334 1,241 1 : 400 8,0 9,0 П3
I 19308 1,455 1,348 1,247 1,051 1 : 200 4,0 5,5 -
I 196В7 2,071 2,119 1,815 1,091 ^01 1 : 800 16,0 20,0 П2
I 19604 1,099 0,901 0,970 0,900 !дм - - - -
II 197Е10 2,732 2,161 0,017 0,061 ^01 1 : 400 4,0 3,0 -
II 191С8 2,845 2,742 0,064 0,036 !д0э 1 : 400 8,0 4,2 П5.1
II 19105 2,341 2,048 0,050 0,099 !д02а 1 : 800 16,0 20,0 П4.2
II 19202 2,042 2,040 0,057 0,048 !дм - - - -
II 19306 1,127 1,066 0,051 0,083 ^01 1 : 200 4,0 2,7 -
II 194Н10 1,574 1,120 0,079 0,025 !д0э 1 : 800 20,0 12,7 П4.1
II 19505 1,943 1,777 0,033 0,045 1:1600 28,0 37,4 П4.1
II 196В5 1,777 1,029 0,015 0,030 ^01 1 : 200 4,0 3,8 -
II 197Р4 2,348 1,325 0,054 0,031 1 : 800 8,0 6,5 П5.1
III 195С10 2,324 0,220 1,042 0,072 ^2а - - - -
Антитела, полученные на основе лимфоцитов мышей линии Ва1Ь/с
I 21207 1,874 1,788 1,804 1,402 ^01 1 : 200 4,0 5,0 -
I 213В3 1,988 1,544 1,891 1,405 1 : 800 8,0 12,0 П1
I 213Р7 2,025 1,974 1,744 1,465 ^01 1 : 800 8,0 11,5 П2
II 211Р9 2,565 2,272 0,063 0,047 !д0э 1:1600 16,0 10,0 П4.2
II 212Н8 2,221 2,144 0,047 0,052 1:1600 20,0 28,5 П4.2
II 214С4 1,994 1,754 0,035 0,034 ^01 1 : 800 16,0 19,0 П4.2
II 215В8 1,758 1,621 0,073 0,136 ^01 1 : 400 16,0 17,5 П5.2
II 21507 1,533 1,602 0,035 0,055 ^01 1 : 800 20,0 18,2 П4.1
II 217С4 1,422 1,231 0,035 0,072 !дм - - - -
II 217011 1,987 1,673 0,054 0,065 ^2а 1 : 200 4,0 3,7 -
Примечание. 1 Представлены средние значения величин по результатам исследования супернатанов гибридом в 4-х повторах (р < 0,05). 2) Параметр не определяли.
положительными сигналами при тестировании на все варианты фермента (192В7, 192F10, 193C7, 193G8, 196B7, 196D4, 212G7, 213B3, 213F7);
II группа - 16 клонов характеризовались положительными сигналами при тестировании только на нативную ПХ (191С8, 19Ю5, 192D2, 193G6, 194И10, 195D5, 196B5, 197F4, 197E10, 211 F9, 212H8, 214C4, 215B8, 215G7, 217С4, 217D11);
III группа была представлена 1 клоном, который характеризовался положительными сигналами при тестировании на нативную и химически модифицированную ПХ (195С10).
Такие результаты указывают на три варианта групповой специфичности полученных МАТ: I группа антител направлена к белковой части антигена, II группа направлена к углеводным остаткам ПХ, а III группа характеризуются специфичностью к простатической группе фермента. Обращают на себя внимание результаты тестирования супернатанта гибридомы 192В7: при достаточно интенсивном сигнале на нативный антиген (ОП = 2,213) наблюдается довольно низкий сигнал на апоПХ (ОП = 0,940). Такие результаты, скорее всего, свидетельствуют о том, что эпитоп, к которому направлено МАТ 192В7, находится в непосредственной близости от простатической (геминовой) группы фермента. Сигнал в ТИФА при тестировании на апофермент значительно ниже ввиду, вероятно, локальных изменений пространственной организации полипептидной цепи в районе простатической группы после удаления последней.
Сравнение результатов тестирования МАТ, полученных от мышей разных линий, на различные варианты антигена позволило установить следующие закономерности. Вследствие обоих гибридизаций были получены МАТ специфичные к: 1) белковой части молекулы ПХ - I группа МАТ проявляла достаточно высокую активность при тестирование на все виды антигена: нативный, рекомбинантный, химически модифицированный и апоПХ; 2) углеводным остаткам фермента - II группа МАТ была активна только в отношении к гликозилированных форм антигена: нативной и апоПХ. Также следует отметить, что МАТ, полученные из спленоцитов мышей линии NZB (мАТмЖ) характеризовались более интенсивным сигналом на белковую часть антигена, по сравнению с аналогичными показателями для МАТ, полученных из сплено-цитов мышей линии Ва1Ь/с (МАТВа|Ь/с). В то же время МАТ различного происхождения характеризовались сопоставимой активностью к углеводной части антигена (рис. 1).
Для двух МАТ - 192В7 и 195С10 - мы провели дополнительное тестирование активности
в прямом ТИФА, чтобы установить степень их ингибирующего влияния на ферментативную активность пероксидазы. Полученные результаты (табл. 2) свидетельствуют о том, что МАТ 195С10 характеризуется выраженной ингиби-рующей активностью: ОП в непрямом ТИФА была крайне близка к ОП отрицательного контроля. В то же время, ингибирующие свойства МАТ 192В7 были не так сильно выражены. Такие результаты подтверждали наши предположения относительно специфичности МАТ 192В7 и 195С10.
Основываясь на литературных данных и собственном опыте [3,9,11,15,22] на следующем этапе проводили углубленное изучение свойств МАТ по следующим характеристикам: титр антител в культуральной жидкости (КЖ), аффинность МАТ и их изотип. Характеристика МАТ по первым двум критериям - титру и аффинности - давала возможность оценить перспективы использования таких МАТ в иммуноа-нализе. Изотип антител, с одной стороны, влияет на целесообразность использования МАТ в различных биоаналитических методах, а с другой - является важной предпосылкой для выбора следующего метода выделения и очистки МАТ. Так, например, белок А Staphylococcus aureus может быть использован для эффективной аффинной очистки мышиных антител изотипов IgG2a, IgG2b и IgG3 [19], а белок G - мышиных антител всех изотипов, кроме IgM [25].
Результаты определения изотипа полученных 26 МАТ представлены в табл. 1, а соотношение изотипов среди антител различного происхождения (МАТмЖ и МАТВа|Ь/с) и специфичности (I + III группы) приведены в табл. 3. Титр в культуральной жидкости, а также константу аффинности (по методу Friguet) определяли для всех МАТ, за исключением тех, которые характеризовались IgM изотипом из-за нетехнологичных условий последующей очистки и возможной перекрестной активности (192D2, 196D4, 217C4), и тех, для которых была подтверждена ингибирующая активность по отношению к ПХ из-за бесперспективности их дальнейшего использования в иммуноанализе (192В7, 195С10). Результаты соответствующих исследований приведены в табл. 1. Большинство исследованных МАТ (16 из 21) характеризовались достаточно высоким титром (> 1 : 400), почти половина из них (10 из 21) имела титр > 1 : 800. Следует отметить, что в целом титр МАТ коррелирован со значением константы аффинности: МАТ с высшим титром характеризовались высоким значением константы аффинности (для МАТ с титром <1:800 среднее значение Ка составляет 6,4 х 109 М-1, в то время, как для
а о с О
2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1
де„ □ ЫгВ □ Ва!Ь/о
1,769 1,813
1,641
1,39 1,418 1,424
1,074 1
нПХ апоПХ модПХ рПХ
А. Сравнение активности МАТ, направленных к белковой части ПХ
2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1
2,081 □ ЫгВ □ Ва!Ь/о
1 оок
1,757
1,701
нПХ
апоПХ
Б. Сравнение активности МАТ, направленных к углеводной части
ПХ
Рис. 1. Сравнительная характеристика активности МАТ, направленные к белковой и углеводной части ПХ (приведены средние значения величин по результатам исследования в 4-х повторах, р < 0,05)
Таблица 2
Результаты тестирования МАТ 192В7 и 195С10 в различных вариантах ТИФА_
нПХ модПХ
Название МАТ Непрямой ТИ- Прямой ТИ- Непрямой ТИ- Прямой ТИ-
ФА ФА ФА ФА
192В7 2,213 0,952 1,902 0,887
195С10 2,324 0,052 1,042 0,061
191С8 (положительный контроль) 2,845 1,958 0,064 0,027
196В7 (положительный контроль) 2,071 1,027 1,815 0,813
Отрицательный контроль (ФСБТ) 0,012 0,028 0,019 0,026
Примечание. Представлены средние значения величин ло результатам исследования в 4-х ло-вторах (р < 0,05).
МАТ с титром > 1 : 800 среднее арифметическое значение Ка составило 16,0 * 109 М-1). При анализе средних значений титра и констант аффинности МАТ различного происхождения и различной специфичности не было установлено каких-либо закономерностей.
Совокупность полученных данных - активность в ТИФА, изотип, титр и константа аффинности МАТ - использовалась нами для отбора клонов гибридом для их дальнейшего размораживания, клонирование, наращивания и накопления антител. Предпочтение отдавалось кло-
нам с высоким титром (> 1 : 400) и константой аффинности (> 8,0 х 10 М-1), а также интенсивным сигналом в непрямом ТИФА. Таким критериям соответствовали 15 МАТ: 191С8, 19Ю5, 192Р10, 193С7, 194Н10, 19505, 196В7, 197Р4, 211Р9, 212Н8, 213В3, 213Р7, 214С4, 215В8, 21507.
Клонирование гибридом осуществляли наиболее простым и эффективным способом -методом лимитирующих разведений. Все клоны прошли по 1 + 3 клонированию до почти полной стабильности по уровню синтеза специфических МАТ. Так при первом клонировании гибридом положительными оказались от 40 до 60% лунок. На втором и третьем клонировании доля положительных лунок составляла 90-100%. Такой ход событий, скорее всего, объясняется постепенной общей стабилизацией генома гибридных клеток после их криоконсервирования, в частности разблокировкой генов, отвечающих за синтез иммуноглобулинов. Изолированные положительные клоны с 96-луночного планшета пересаживали на 24-луночный, гибридомы под-
ращивали, замораживали и вводили в асцит мышам. На 7-10 день у животных накапливался асцит, который отбирали. Одна мышь в среднем давала до 10 мл асцитической жидкости. После выделения из асцитической жидкости МАТ использовали для синтеза конъюгатов с ЩФ, а также определение аффинности МАТ по альтернативному методу Scatchard [23].
Результаты расчета констант аффинности МАТ методом Scatchard приведены в табл. 1, а результаты сравнения констант аффинности определенных различными методами приведены на рис. 2. Для численной оценки корреляции полученных значений коэффициента аффинности нами использован линейный корреляционный анализ, который позволяет установить прямые связи между переменными величинами по их абсолютным значениям. Как известно, метод расчета коэффициента корреляциипо-строен таким образом, что если связь между признаками имеет линейный характер, коффи-циент Пирсона (г) точно устанавливает тесноту этой связи [4]. В этом случае коэффициент ли-
Таблица3
Сравнительная характеристика изотипов полученных МАТ
Изотипы МАТ МАТм2В МАТВа1Ь/с
все в том числе из все в том числе из
1 группы II группы III группы I группы II группы
!д01 5 (31,25%) 2 (12,5%) 3 (18,75%) 0 5 (50%) 2 (20%) 3 (30%)
Ig02a 4 (25%) 1 (6,25%) 2 (12,5%) 1 (6,25%) 2 (20%) 0 2 (20%)
3 (18,75%) 2 (12,5%) 1 (6,25%) 0 1 (10%) 1 (10%) 0
Ig0з 2 (12,5%) 0 2 (12,5%) 0 1 (20%) 0 1 (20%)
|дМ 2 (12,5%) 1 (6,25%) 1 (6,25%) 0 1 (10%) 0 1 (10%)
40
35
30
I-
о о
X ./е
5 1)25 ■& §
5 20
га ®>
£ =15
га
£ 10
о
5 -
0
Линейный коэффициент корреляции г = 0,90
П.
п.
□ Метод Friguet □ Метод Scatchard
# ^ чо* ^ ^ ^ л* А ^ & ^ ^
^ ч* ч* чсГ чч>4 ^ ^ ч«*> ч«$> ^ ^у ^ ^ ^ ^у ^ ^ ^
Названия МАТ
Рис. 2. Сравнение констант аффинности МАТ к ПХ, определенных различными методами
нейной корреляции между двумя выборками составил 0,90, что свидетельствует о достаточно высокой степени корреляции, так что можно считать методы Friguet и Scatchard сопоставимы при определении аффинности антител специфичных к ПХ.
Сравнительную эпитопную характеристику МАТ проводили с использованием конкурентного ТИФА. Результаты конкурирующего эффекта рассчитывались как процент снижения активности конъюгата МАТ в присутствии конкурирующего антитела. В таком варианте постановки конкурентного ТИФА полное или частичное снижение активности является показателем полного или частичного сходства эпитопной специфичности исследуемых МАТ. В тоже время сопоставимая с контрольной активность конъюгата МАТ указывала на различную с конкурирующим антителом эпитопную специфичность. Таким образом, в результате проведенных исследований для каждого МАТ был получен сравнительный эпитопный профиль из 14 вариантов конкуренции с другими антителами. Для облегчения анализа такого большого массива данных для сравнения профилей использовали корреляционный анализ по Браве-Пирсону. Степень сходства выражалась через коэффициент корреляции профилей при его статистической достоверности (р < 0,05). Высокие значения положительных коэффициентов корреляции между профилями (0,75 < г < 1,00) трактовались как свидетельство одинаковой эпитопной специфичности, меньшие значения (0,44 < г < 0,75) считались показателем перекрестных эпитопов, а статистически недостоверные коэффициенты (г < 0,44) расценивались как доказательство независимых, полностью отличных эпитопов.
Проведенная сравнительная эпитопная характеристика МАТ, показала, что исследуемые антитела направлены к пяти эпитопным регионам (ЭР) молекулы ПХ, условно обозначенных нами П1 + П5 (см. табл. 1 и табл. 4). Среди 5 МАТ, направленных к белковой части молекулы ПХ, 2 МАТ относятся к эпитопному региону П1 (ЭР-П1) (192F10, 213В3), 2 МАТ - к ЭР-П2 (2^7, 196В7) и 1 МАТ - к ЭР-П3 (193С7). Таким образом, в рамках каждого из эпитопных регионов П1 + П3 в данном исследовании было выявлено по одному эпитопу. Отметим, что ЭР П1 и П2 были представлены МАТ обоих вариантов происхождения (МАТмЖ и МАТВа|Ь/с), в то время как антитело 193С7 (относится к ЭР-П3) представляет собой МАТВа|Ь/с. Среди 10 МАТ, специфичных к углеводной части молекулы ПХ, 7 антител, взаимодействовали с ЭР-П4 (194Н10, 195D5, 2^7, 19Ю5, 21^9, 212Н8, 214С4) и 3 антитела взаимодействовали с ЭР-
П5 (191С8, 197F4, 215В8). Антитела, направленные к антигенным детерминантам на поверхности углеродных остатков фермента ПХ, характеризовались большей диверсификацией - каждый из данных ЭР (П4 и П5) содержал по 2 эпитопа (П4.1, П4.2 и П5.1, П5.2 соответственно).
Для оценки перекрестной реактивности между МАТ различных ЭР и эпитопов нами были рассчитаны средние арифметические значения коэффициентов корреляции между различными эпитопами и ЭР (рис. 3). Наибольшими значениями г характеризуются пары П4.1-П4.2 (г = 0,61) и П5.1-П5.2 (г = 0,52). Такие результаты свидетельствовали о перекрывании данных эпитопов, что и обусловило включение их в соответствующие ЭР. Коэффициент корреляции между П1 и П2 составил 0,42, что свидетельствует о весьма близкой по отношению друг к другу локализации антигенных детерминант П1 и П2. В то же время эпитопные регионы П1 и П2 значительно больше удалены от ЭР-П3, чем друг от друга: для пары П1-П3 г = 0,21, а для пары П2-П3 г = 0,15. Довольно интересными были результаты по оценке степени перекрывания эпитопов ЭР-П3 (направлены к белковой части молекулы ПХ) и ЭР-П5 (направлены к углеводным остаткам фермента). Коэффициент корреляции между ЭР-П3 и ЭР-П5 составляет 0,35. Очевидно, что в пределах линейной структуры полипептидной и полиуглеводной цепей, невозможно представить конкуренцию различных МАТ за место связывания антигенной детерминанты. Вместе с тем, при стериче-ской близости соответствующих эпитопов возможные пространственные ограничения при независимом друг от друга взаимодействии таких МАТ. Очевидно, именно такая ситуация и имеет место в случае антител, относящихся к ЭР-П3 и ЭР-П5. Отметим, что для других пар эпитопов и ЕЭР не обнаружено МАТ, которые засвидетельствовали значимый уровень перекрестной или конкурентной активности.
ВЫВОДЫ
1. При использовании двух инбредных линий мышей (NZB и Ва1Ь/с) получен оригинальный набор из 15 клонов гибридом - продуцентов высокоаффинных и специфичных МАТ к изоферменту С пероксидазы хрена. Проведено изучение биологических свойств антител: установлено их специфичность, константу аффинности и титр в культуральной жидкости, а также осуществлена сравнительная эпитопная характеристика антител.
2. Доказано, что полученные МАТ направлены к белковой части, к углеводным остаткам, а также к простатической группе фермента. Ус-
Эпитопные регионы и эпитопы П5 П5.2 215В8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 +1 +1 -
П5.1 197Р4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 + - 0,51
191С8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 - 0,91 0,52
П4 П4.2 214С4 1 1 1 1 1 1 +1 + + + - 0,07 0,08 0,19
212Н8 1 1 1 1 1 +1 1 +1 + + - 0,87 0,22 0,25 0,09
211Р9 1 1 1 1 1 +1 1 + + - 0 0,97 0,16 0,11 0,21
19Ю5 1 1 1 1 1 +1 +1 +1 - 0,95 0,92 0,98 0,14 0,17 0,06
П4.1 21507 1 1 1 1 1 + + - 0,65 0,91 0,71 0,89 0,11 0,09 0,10
195Р5 1 1 1 1 1 + - 0,91 0,50 0,42 0,37 0,61 0,21 0,17 0,09
194Н10 1 1 1 1 1 - 0,98 0,93 0,91 0,51 0,44 0,45 0,21 0,22 0,14
П3 П3 193С7 1 1 1 1 - 0,21 0,22 со сэ 0,20 0,07 0,13 0,16 0,32 0,40 0,34
П2 П2 196В7 1 +1 1 - 0,17 0,12 0,07 0,09 0,05 0,09 0,13 0,27 0,06 0,05 0,05
213Р7 1 1 - 0,97 0,12 0,08 0,07 0,17 0,15 0,16 0,13 0,17 0,07 0,04 0,09
Е с ю В ю 21 + - 0,34 0,49 0,12 0,12 0,04 0,30 0,20 0,13 0,17 0,08 0,17 0,08 0,05
192Р10 - 0,98 0,41 0,42 0,29 0,07 0,05 0,21 0,17 0,12 0,07 0,19 0,10 0,11 0,15
МАТ 192Р10 3 В ю 21 213Р7 196В7 193С7 194Н10 195й5 21507 19Ю5 211Р9 212Н8 214С4 191С8 197Р4 215В8
Эпитопы Е П2 П3 П4.1 П4.2 П5.1 П5.2
<ъ с
® <75
С о
з к с
01 а а о
а> s я s
a a
m о
0,70 т 0,60 0,50 40,40 0,30 0,20 0,10 0,00
] Коэффициент корреляции (r) для пар эпитопов r = 0,44
П.п.п
ЛУ S 4 A? S ^ К 4 Л? <<Р <<?<<? К^ К^ К^ Л? к"4 Л? <• 14 t'b k"4 <■ "
Г к <V .<хч А? .ас лС4 <V> К'4 пг .tv .tv1' ОУ .ПГ .Vх .оГ ПГ Л к-4 .Vх <V к-4 к-4 .о;4 .л;4 .л;4
N л'з ^ Л°> кЪ ,J> ,J> л*
,J> к> ,J> А?
^ \ • ^ ^ ч- ч- . ч- ч- ч- ч- ч- \
ow &
>• <SN <>"
Пары эпитопов (эпитопных регионов)
Рис. 3. Сравнение коэффициентов корреляции между различными эпитопами и
эпитопнымы регионами МАТ к ПХ
тановлено, что активность МАТ различного происхождения, направленных к углеводной части, выше по сравнению с МАТ, которые взаимодействуют с полипептидной цепью фермента, соответственно, углеводный компонент пероксидазы хрена является более иммуноген-ным для мышей линий NZB и Ва1Ь/с.
3. Установлено, что полученные МАТ направлены к 5-ти эпитопным регионам на молекуле пероксидазы хрена: 3 из них представлены антигенными детерминантами белкового происхождения и 2 имеют углеводную природу. Два из эпитопных регионов, направленных к полипептидной цепи (П1 и П2), имеют близкую пространственную локализацию и значительно более сильно отдалены от третьего эпитопного региона аналогичной специфичности (П3). Каж-
дый из двух эпитопных регионов, направленных к углеводным остаткам (П4 и П5), представлен двумя эпитопами. Антигенная детерминанта П3, сформированная полипептидной цепью, имеет близкую пространственную локализацию с эпитопным регионом П5 на углеводной части фермента.
4. Доказано, что две методики определения аффинности МАТ (Friguet и Scatchard) является сопоставимыми при определении констант аффинности антител к пероксидазе хрена.
5. Дальнейшие исследования могут быть направлены на разработку подходов к использованию МАТ к пероксидазе хрена в иммуноа-нализе и иммунобиотехнологии.
1. Бобровник С.А., Демченко M.A., Комиса-ренко C.B. Влияние полиреактивных иммуноглобулинов сыворотки крови на определение аффинности сывороточных антител // Украинский биохимический журнал. 2010. Т. 82, № 1. С.66-69.
2. Галкин А.Ю. Сравнительная характеристика методов эпитопного картирования антигенов протеиновой природы // Украинский биохимический журнал. 2014. Т. 86, № 4. С. 164177. (на украинском языке).
3. Галкин А.Ю., Дуган А.М. Сравнение схем иммунизации мышей линии Balb/c для получения моноклональных антител к IgM человека // Иммунология и аллергология. 2009. № 1. С.68-73. (на украинском языке).
4. Гмурман В.Е.. Теория вероятностей и математическая статистика. М.: Высшая школа,
ЖИЙ СПИСОК
2004. 479 с.
5. Захарова Г.С., Упоров И.В., Тишков В.И. Пероксидаза из корней хрена: моделирование свойств химической модификацией белковой глобулы и гема // Успехи биологической химии. 2011. Т. 51. С. 37-64.
6. Игнатенко О.В. Антигенная структура различных форм пероксидазы хрена: автореф. дис. ... 02.00.15, 03.00.04. М., 2001. 20 с.
7. Конструирование универсального био-тинсодержащего олигонуклеотидного диагно-стикума для выявления вириоидных заболеваний растений / Лебедева И.В. [и др.] // Биоорганическая химия. 1993. Т. 19, № 9. С. 984-904.
8. Научно-практические рекомендации по содержанию лабораторных животных и работы с ними / Ю.М. Кожемякин, А.С. Хромов, М.А. Филоненко, Г.А. Сайфетдинова. К.: Авиценна,
2002. 156 с. (на украинском языке).
9. Николаенко И.В., Шинкаренко Л.Н., Галкин А.Ю. Принципы, особенности и применение гибридомной технологии // Иммунология и аллергология. 2003. № 4. С. 7-17. (на украинском языке).
10. Упоров И.В, Егоров А.М. Моделирование пространственной структуры пероксидазы хрена (изофермент С) // Доклады РАН. 1997. Т. 356, № 5. С. 696-699.
11. Широбоков В.П., Николаенко И.В., Ко-паница Л.В. Панель моноклональных антител для внутритиповой дифференциации полиови-русов II типа // Микробиологический журнал. 1997. № 6. С. 27-35. (на украинском языке).
12. Ammosova T.N., Ouporov I.V., Rubtsova M.Yu. et al. Epitope mapping of horseradish peroxidase (isoenzyme C) // Biochemistry (Mosc). 1997. V. 62(4). P. 440-447.
13. Friguet B., Chaffote A., Djavadi-Ohaniance L. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay // J. Immunol. Meth. 1985. V. 77. P. 305-319.
14. Galkin O.Yu. Approaches to the synthesis of conjugates for enzyme immunoassay testsystems and evaluation of their use for diagnostics of infectious diseases // Украинский журнал клинической и лабораторной медицины. 2010. Т. 5, № 4. С. 54-60.
15. Goding J. Monodonal Antibodies: Principles and Practice. San Diego: Academic Press, 1996. 492 p.
16. Homan W.L., van Kalshoven H., Kolk A.H.J. Monoclonal antibodies to surface glycoconjugates in Chlamydomonas eugametos recognize strain-specific O-methyl sugars // Planta. 1987. V. 170. P. 328-335.
17. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures
of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. V. 256. P. 495-497.
18. Lane D., Koprowski H. Molecular recognition and the future of monoclonal antibodies // Nature. 1982. V.296. P.200-202.
19. Lindmark R., Thoren-Tolling K., Sjoquist J. // J. Immunol. Methods. 1983. V. 62 (1). P. 1-13.
20. Membrane targeted horseradish peroxidase as a marker for correlative fluorescence and electron microscopy studies / Li J. [u flp.j // Front. Neural. Circuits. 2010. V. 4. P. 1-10.
21. Rathanaswami P., Babcook J., Gallo M. High-affinity binding measurements of antibodies to cell-surface-expressed antigens // Analyt. Biochem. 2008. V. 373. P. 52-60.
22. Reimer C., Phillips D., Aloisio C. Evaluation of thirty-one mouse monoclonal antibodies to human IgG epitopes // Hybridoma. 1984. V. 3, 3. P. 263-275.
23. Scatchard G. The attractions of proteins for small molecules and ions // Ann. N.Y.Acad. Sci. 1949. V. 51. P. 660-672.
24. Shogren R.L., Willett J.L., Biswas A. HRPmediated synthesis of starch-polyacrylamide graft copolymers // Carbohydr. Pol. 2009. V. 75(1). P. 189-191.
25. Sjobring U., Bjorck L., Kastern W. Streptococcal protein G. Gene structure and protein binding properties // J. Biol. Chem. 1991. V. 266 (1). P. 399-405.
26. Tupper J., Stratford M.R., Hill S. In vivo characterization of horseradish peroxidase with indole-3-acetic acid and 5-bromoindole-3-acetic acid for gene therapy of cancer // Cancer Gene Ther. 2010. V. 17(6). P. 420-428.
27. Yonetani T. Studies on cytochrome c peroxidase. X. Crystalline apo-and reconstituted holoenzymes // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 5008-5013.
REFERENCES
1. Bobrovnik S.A., Demchenko M.A., Komisarenko S.V. Ukrains'kii biokhimichnyi zhurnal - Ukrainian Biochemical Journal, 2010, vol. 82, no. 1, pp. 66-69. (in Russ.)
2. Galkin A.Yu. Ukrains'kii biokhimichnyi zhurnal - Ukrainian Biochemical Journal, 2014, vol. 86, no. 4, pp. 164-177. (in Ukrain.)
3. Galkin A.Yu., Dugan A.M. Imunolohiya ta alerholohiya - Immunology and Allergology, 2009, no. 1, pp. 68-73. (in Ukrain.)
4. Gmurman V.E. Teoriya veroyatnostei i matematicheskaya statistika [Theory of Probability and Mathematical Statistics]. Moscow, Vysshaya shkola Publ., 2004, 479 p. (in Russ.)
5. Zakharova G.S., Uporov I.V., Tishkov V.I. Uspekhi biologicheskoi khimii - Biological Chemistry Reviews, 2011, vol. 51, pp. 37-64. (in Russ.)
6. Ignatenko O.V. Author's abstract of Dr. Sci. Biol. Thesis. Moscow, 2001. 20 p. (in Russ.)
7. Lebedeva I.V., Ivanovskaya M.G., Gurinovich T.I. [et al.] Bioorganicheskaya khimiya - Bioorganic Chemistry, 1993, vol. 19, no. 9, pp. 984-904. (in Russ.)
8. Kozhemyakin Yu.M., Khromov O.S., Filonenko M.A. [et al.] Naukovo-praktychni rekomendatsii z utrymannya laboratornykh tvaryn ta roboty z nymy [Scientific and practical advice on the keeping of laboratory animals and working with them]. Kiev, Avitsena Publ., 2002, 156 p. (in Ukrain.)
9. Nikolaenko I.V., Shynkarenko L.M., Galkin O.Yu. Imunolohiya ta alerholohiya - Immunology and Allergology, 2003, no. 4, pp. 7-17. (in Ukrain.)
10. Uporov I.V., Egorov A.M. Doklady RAN.
Biokhimiya - Reports of Russian Academy of Sciences. Biochemistry, 1997, vol. 356, no. 5, pp. 696-699.
11. Shyrobokov V.P., Nikolaenko I.V., Kopanytsya L.V. Mikrobiolohichnyi zhurnal- Microbiological journal, 1997, vol. 6, pp. 27-35. (in Ukrain.)
12. Ammosova T.N., Uporov I.V., Rubtsova M.Yu. [et al.] Biochemistry, 1997, vol. 62, no. 4, pp. 440-447.
13. Friguet B., Chaffote A., Djavadi-Ohaniance L. J. Immunol. Meth., 1985, vol. 77, pp. 305-319.
14. Galkin O.Yu. Ukrainian Journal of Chemical and Laboratory Medicine, 2010, vol. 5, no. 4, pp. 54-60.
15. Goding J. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. San Diego, Academic Press, 1996. 492 p.
16. Homan W.L., van Kalshoven H., Kolk A.H.J. Planta, 1987, vol. 170, pp. 328-335.
17. Tupper J., Stratford M.R., Hill S. Cancer
Gene Ther, 2010, vol. 17, no. 6, pp. 420-428.
18. Kohler G., Milstein C. Nature, 1975, vol. 256, pp. 495-497.
19. Lane D., Koprowski H. Nature, 1982, vol. 296, pp. 200-202.
20. Li J., Wang Y., Chiu S.L. [et al.] Front. Neural. Circuits, 2010, vol. 4, pp. 1-10.
21. Lindmark R., Thoren-Tolling K., Sjöquist J. J. Immunol. Methods, 1983, vol. 62, no. 1, pp. 113.
22. Rathanaswami P., Babcook J., Gallo M. Analyt. Biochem., 2008, vol. 373, pp. 52-60.
23. Reimer C., Phillips D., Aloisio C. Hybridoma, 1984, vol. 3, no. 3, pp. 263-275.
24. Scatchard G. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1949, vol. 51, pp. 660-672.
25. Shogren R.L., Willett J.L., Biswas A. Carbohydr. Pol., 2009, vol. 75, no. 1, pp. 189-191.
26. Sjöbring U., Björck L., Kastern W. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, no. 1, pp. 399-405.
27. Yonetani T. J. Biol. Chem., 1967, vol. 242, pp. 5008-5013.
Поступило в редакцию 24 ноября 2014 г.
