CC BY
99
УДК 561.284 602.44
Подбор условий глубинного культивирования
Р1ежо(т ostreatus
Е. В. АНТОНЦЕВА1, С. С. СОРОКИН2, Д. О. ТЕРЕНТЬЕВ3, В. А. СЕДЫХ4, канд. техн. наук М. М. ШАМЦЯН5
[email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)
Произведен подбор условий глубинного культивирования гриба Р. о^геаи для получения наибольшего выхода биомассы. Для выращивания грибов глубинным методом были выбраны источники углерода и азота, в качестве замены глюкозе и пептону в составе стандартной среды. Кроме того, был изучен рост Р. ostreatus на средах с различными начальными значениями рН и при различных скоростях растворения кислорода. В результате были определены значения рН и степень аэрации среды культивирования, обеспечивающие наибольший выход биомассы. В качестве источника углерода выбраны цельносмолотая ржаная мука и пшеничная мука второго сорта, в качестве источника азота выбрана соевая мука. Биомасса Р. ostreatus может быть использована для получения р-глюкан содержащих препаратов, применяемых в качестве самостоятельных БАВ или функциональной добавки для обогащения молочных и других пищевых продуктов.
Ключевые слова: Р1ешОш ostreatus, Р-глюканы, глубинное культивирование, источники углерода, источники азота, питательная среда.
Информация о статье:
Поступила в редакцию 20.11.2018, принята к печати 17.01.2019 ао1: 10.17586/1606-4313-2019-18-1-34-38 Язык статьи — русский Ссылка для цитирования:
Антонцева Е. В., Сорокин С. С., Терентьев Д. О., Седых В. А., Шамцян М. М. Подбор условий глубинного культивирования Pleurotus Ostreatus // Вестник Международной академии холода. 2019. № 1. С. 34-38.
Selection of conditions for submerged cultivation of Pleurotus ostreatus
Е. V. ANTONTCEVA1, S. S. SOROKIN2, D. O. TERENTYEV3, V. A. SEDYKH4, Ph. D. М. M. SHAMTSYAN5
'[email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Saint-Petersburg State Institute of Technology
The aim ofthis study was to select the conditions for submerged cultivation to obtain the highest yield of biomass. For the submerged cultivation various carbon and nitrogen sources were used as a replacement for glucose and peptone in the composition of the basic medium. Also, the growth of P. ostreatus was studied on media with different initial pH values and at the different dissolution rates of oxygen. As a result, the pH value and aeration level of the cultivation medium providing the highest biomass yield were determined. Medium rye flour or dark wheat flour were selected as a source of carbon, soy flour was selected as the source of nitrogen. Submerged biomass ofP. ostreatus can be usedfor obtaining p-glucan-containing preparations used as BAS or functional supplements for the fortification of dairy and other food products. Keywords: Pleurotus ostreatus, P-glucans, submerged cultivation, sources of carbon, sources of nitrogen, nutrient medium.
Article info:
Received 20/11/2018, accepted 17/01/2019 DOI: 10.17586/1606-4313-2019-18-1-34-38 Article in Russian For citation:
Antontceva E. V., Sorokin S. S., Terentyev D. O., Sedykh V. A., Shamtsyan M. M. Selection of conditions for submerged cultivation of Pleurotus ostreatus. VestnikMezhdunarodnoi akademii kholoda. 2019. No 1. p. 34-10.
Введение
Pleurotus ostreatus или вешенка обыкновенная, является ценным диетическим продуктом, плодовые тела которого употребляются в пищу, производятся
в промышленном масштабе во многих странах мира. Также, благодаря широкому спектру биологически активных веществ, нашел широкое применение в медицине.
В наших предыдущих исследованиях были продемонстрированы гиполипидемическое и гипохолестероль-ное действия вешенки обыкновенной [1]. К тому же, P. ostreatus известен своими иммуномодулирующим, про-тивоаллергенным, противоопухолевым, противовоспалительным, антиоксидантным, антибактериальным, ан-типролиферативным, пребиотическим и радиопротекторным действиями [2-8].
Особое внимание следует уделить р-глюканам, которые являются структурными полисахаридами клеточных стенок грибов и проявляют значительную биологическую активность. р-глюканы встречаются во многих организмах: злаковых культурах, водорослях, бактериях, грибах и дрожжах [3]. В-глюканы дрожжей и грибов имеют разветвленное строение (рис. 1). Основная цепь макромолекулы состоит из остатков р-Э-глюкопираноз, соединенных р-1-3-гликозидными связями. К этой цепи в положениях 6 присоединяются боковые ответвления, частота и размер которых вариабельны [9].
Как уже известно, Р-глюканы, выделенные из бази-диомицетов, при включении в состав обычных ежедневно употребляемых пищевых продуктов, могут придать им различные профилактические и функциональне свойства, такие как иммуностимулирующее, гиполипидемическое, противоопухолевое, противовоспалительное и гипогликемическое свойства [10]. Полисахариды, выделенные из культуры гриба Р. ostreatus, могут быть использованы для разработки новых функциональных продуктов и нутрицевтиков [11].
Функциональные продукты — это классические пищевые продукты, в состав которых включаются биологически активные вещества, придающие им новые полезные для здоровья человека свойства. Функциональные продукты, обогащенные р-глюканами могут повысить качество жизни человека при систематическом употреблении. В нашем предыдущем исследовании мы изучали возможность использования грибных полисахаридов, содержащих р-глюканы, для создания функциональных продуктов на основе ферментированных молочных продуктов [12]. Возможно создание и других функциональных продуктов с включением р-глюка-нов, таких как шоколад или хлеб. Так, например, изучалось влияние грибных р-глюканов, используемых в качестве добавки к муке на реологические свойства теста при производстве хлеба [13]. Планируются исследования по включению Р-глюканов в различные кондитерские изделия. В целом р-глюканы можно включать в любые матричные структуры, так как препарат представляет собой водорастворимый порошок. При этом надо учиты-
CH2OH
Рис. 1. Структурная формула ß-1,3/1,6-D-глюкана Fig. 1. Structural formula of ß-1,3/1,6-D-glucan
вать его влияние на цвет продукта, так как он имеет собственный природный пигмент.
Препараты р-глюканов могут использоваться в медицине в качестве иммуностимулирующих агентов. Например, некоторые исследования показали, что Р-глюка-ны Р. ostreatus эффективны в борьбе с инфекциями дыхательных путей у детей с хроническими респираторными заболеваниями [2, 14, 15].
Помимо выращивания вешенки в виде плодовых тел, возможно ее культивирование глубинным способом. Метод глубинного культивирования позволяет получать гомогенную биомассу, что упрощает выделение продукта, а также обеспечивает стабильность свойств готового продукта и его относительную стандартизацию [16]. Одной из наиболее распространенных питательных сред для культивирования базидиомицетов является полусинтетическая глюкозо-пептонная среда. Состав питательной среды имеет важное значение для культивирования. Выход биомассы, биосинтетическая активность продуцента и конечная стоимость продукта сильно зависит от состава среды. Например, было изучено влияние источника углерода на свойства и антиоксидантную активность экзополисахаридов, полученных из культуры Trametes robiniophila [17]. В другом исследовании проверялось влияние температуры и состава питательной среды на рост мицелия двух видов грибов рода Pleurotus (Р. ostreatus и Р. cystidiosus) [18]. Из литературного источника известно, что органические соединения азота лучше всего подходят для культивирования гриба Р. о&1теа1ж. Наиболее широко используемым источником азота является пептон, а на втором месте — мочевина.
Цель данной работы — подобрать состав среды и режим аэрации, обеспечивающие наибольший выход биомассы. Полученная глубинным способом биомасса гриба Р. ostreatus может использоваться в качестве источника полисахаридов, выделяемых с помощью последовательных спиртовых и водных экстракций [10].
Экспериментальная часть
Объектом исследования стала культура гриба Pleurotus ostreatus. Культура базидиомицета Р. ostreatus (Jacq.) Р. Китт была взята из коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета).
Данная культура изначально выращивалась на стандартной глюкозо-пептонной питательной среде. Состав питательной среды представлен в табл. 1.
Начальное значение рН среды, до стерилизации, было равно 6,5.
Для определения влияния аэрации среды на синтез биомассы, вешенку культивировали в колбах с различными объемами жидкой питательной среды: 50, 100, 150 и 200 мл. Во всех случаях глубинное культивирование проводилось в течение 7 сут на роторной качалке с частотой вращения 230 мин-1 при температуре 28-30 оС. Объем вносимого посевного материала составлял 10% от объема жидкой среды в колбах Эрленмейера.
Скорость растворения кислорода в колбах составляла 4,4; 3,0; 1,8 и 1,2 г/ (лхч) для объема среды равного 50, 100, 150 и 200 мл, соответственно.
O
O
n
По окончании культивирования, мицелий P. ostreatus отделяли от нативного раствора путем фильтрования через бумажный фильтр. Влажную биомассу высушивали в сушильном шкафу при температуре 50 оС. Массу полученного сухого грибного мицелия определяли гравиметрически.
Для изучения влияния различных начальных значений рН питательной среды гриб P. ostreatus культивировали на средах с pH: 5; 6; 6,5; 7 и 7,5. Начальные значения рН питательных сред доводили до нужных значений путем добавления к стандартной среде определенных количеств HCl или NaOH. Объем стандартной глюко-зо-пептонной среды для глубинного культивирования составлял по 100 мл в каждой колбе.
Для изучения роста культуры P. ostreatus на питательной среде с различными источниками углерода и азота модифицировалась стандартная глюкозо-пептонная питательная среда (табл. 1). В качестве источников углерода вместо глюкозы были взяты ржаная цельнозерновая мука, цельносмолотая ржаная мука, пшеничная мука первого сорта, пшеничная мука второго сорта, кукурузная мука, картофельный крахмал и соевая мука. Концентрации источников углерода в средах были эквивалентны содержанию глюкозы 15 г/л.
В качестве источника азота вместо пептона использовались мочевина, NaNO3, NH4NO3, (NH4) 2SO4 и соевая мука в количествах, эквивалентных содержанию азота
в исходной среде. Остальные компоненты и их количества соответствовали, указанным в табл. 1.
Все эксперименты проводились в трех повторностях. Стандартные отклонения были рассчитаны и включены в графическое представление данных. Результаты были обработаны статистически с помощью программы Microsoft Office Excel.
Обсуждение результатов
Концентрация кислорода в среде оказывает значительное влияние на биосинтез биомассы грибами [19]. Так как р-глюканы являются полисахаридами клеточной стенки грибов, то их количество напрямую зависит от выхода биомассы. Таким образом синтез Р-глюканов зависит от скорости растворения кислорода в среде культивирования. Изучено влияние скорости растворения кислорода в питательной среде на выход биомассы P. ostreatus. Результаты этих исследований показаны на рис. 2.
Из представленных на рис. 2 данных видно, что наибольший выход биомассы P. ostreatus наблюдается при выращивании культуры при режиме аэрации, обеспечивающем скорость растворения кислорода 4,4 г/(лхч)
Выход биомассы P. ostreatus при росте на полусинтетической глюкозо-пептонной среде с различными начальными значениями рН, представлен на рис. 3.
Из полученных результатов видно, что при значении рН среды меньше 6, накопление биомассы культурой P. ostreatus уменьшается; в диапазоне значений рН среды от 6 до 7, культура демонстрирует хороший рост и лучший рост наблюдается при значении рН 7,5.
Выявлено, что источник углерода влияет на метаболизм грибных культур и их биосинтетическую активность. Так как в нашем случае целевым продуктом являются полисахариды клеточной стенки, важным параметром культивирования будет концентрация биомассы, накопление которой, прежде всего, зависит от источника углерода. Кроме того, задача заключалась в том, чтобы заменить глюкозу на недорогой источник углерода, что увеличило бы экономическую эффективность процесса. Рост культуры P. ostreatus на питательной среде с различными источниками углерода показан на рис. 4.
Таблица 1
Состав питательной среды
Table 1
Composition of nutrient media
Компонент питательной среды Концентрация, г/л
Глюкоза 15
Пептон 2,5
Дрожжевой экстракт 2,0
КИ2Р04 0,6
К2НР04 0,4
MgSO4 0,5
№С1 0,5
CaC12 0,05
_
■ta ■
1,2 1,8 3,0 4,4
Скорость растворения кислорода, г/(л*ч)
5 -4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1
0,5 0
5 6 6,5 7 7,5
Начальное значение pH питательной среды
Рис. 2. Выход биомассы P. ostreatus при разных скоростях растворения кислорода Fig. 2. The yield of biomass at the different level of oxygen dissolution
Рис. 3. Зависимость выхода биомассы P. ostreatus
от начальных значений рН питательной среды Fig. 3. Influence of pH on yield of P. ostreatus biomass
12
10
2 —
Hl
Г-Н
2 3 4 5 6 Источник углерода
7
ю 3
2 3 4
Источник азота
Рис. 4. Выход биомассы P. ostreatus при выращивании на средах с различными источниками углерода: 1 — глюкоза, 2 — ржаная цельносмолотая мука, 3 — цельнозерновая ржаная мука, 4 — пшеничная мука первого сорта, 5 — пшеничная мука второго сорта, 6 — кукурузная мука, 7 — крахмал,
8 — соевая мука Fig. 4. Yield of P. ostreatus biomass by growing on media with different carbon source: 1 — glucose, 2 — rye wholemeal flour,
3 — wholemeal rye flour, 4 — wheat flour of the first grade, 5 — wheat flour of the second grade, 6 — corn flour, 7 — starch, 8 — soy flour
Все источники углерода, которые использовались в эксперименте, обеспечивали более высокий выход биомассы, по сравнению с глюкозой. Исходя из этих данных, глюкоза может быть заменена более дешевым источником углерода, что также увеличит выход продукта. Наибольший выход биомассы наблюдался при выращивании грибной культуры на средах, где в качестве источника углерода использовались цельнозерновая ржаная мука и пшеничная мука второго сорта.
Второй по важности компонент питательной среды — источник азота. Рост культуры P. ostreatus на питательной среде с различными источниками азота показан на рис. 5.
Из полученных данных видно, что пептон возможно заменить неорганическими источниками азота. Наибольший выход биомассы наблюдался на среде с соевой мукой в качестве источника азота.
Выводы
В результате проведенного исследования выявлено, что для глубинного культивирования P. ostreatus рекомендуются следующие условия:
— продолжительность культивирования 7 дней;
— скорость аэрации 3,3-4,0 г/ (лхч);
— начальное значение рН среды культивирования
7,5.
Для культивирования P. ostreatus предлагается использовать питательную среду следующего состава (г/л): цельнозерновая ржаная мука или пшеничная мука второго сорта — 20; соевая мука — 4,4; дрожжевой экстракт — 2; KH2PO4-0,6; K2HPO4-0,4; MgSO4-0,5; NaCl — 0,5; CaCl2-0,05.
Глубинная биомасса P. ostreatus может быть использована для получения препарата ß-глюканов, используемого в качестве функциональной добавки для обогащения молочных продуктов и других традиционных пищевых продуктов.
Рис. 5. Влияние различных источников азота в питательной среде на выход биомассы P. Ostreatus. Источник азота: 1 — пептон, 2 — мочевина, 3 — NaNO3,4 — NH4NO3, 5 — (NH) SO, 6 — соевая мука Fig. 5. Influence of different nitrogen source on P. ostreatus growing. Nitrogen source: 1 — pepton, 2 — urea, 3 — NaNO3, 4 — NHNO,, 5 — (NH) SO,, 6 — soy flour
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Литература/References
Shamtsyan M., et al. Hyperlipidemic and hypocholesterolic action of submerge cultured mushrooms. Journal of Hygienic Engineering and Design. 2014. Vol. 7. P. 96-99. Bashir K. M., Choi J. S. Clinical and physiological perspectives of P-glucans: The past, present, and future. International journal of molecular sciences. 2017. Vol. 18. No 9. P. 1906. DOI: 10.3390/ ijms18091906
Friedman M. Mushroom polysaccharides: chemistry and antiobesity, antidiabetes, anticancer, and antibiotic properties in cells, rodents, and humans. Foods. 2016. Vol. 5. No 4. P. 80. DOI: 10.3390/foods5040080
Kozarski M., et al. Antioxidants of edible mushrooms // Molecules. 2015. Vol. 20. No 10. p. 19489-19525. DOI: 10.3390/ molecules201019489
Facchini J. M., et al. Antitumor activity of Pleurotus ostreatus polysaccharide fractions on Ehrlich tumor and Sarcoma 180. International journal of biological macromolecules. 2014. Vol. 68. P. 72-77. DOI: 10.1016/j. ijbiomac. 2014.04.033 Du B., et al. An insight into anti-inflammatory effects of fungal beta-glucans. Trends in Food Science & Technology. 2015. Vol. 41. No 1. P. 49-59. DOI: 10.1016/j. tifs. 2014.09.002 Llauradó G. et al. Haematopoiesis radioprotection in Balb/c mice by an aqueous mycelium extract from the Basidiomycete Pleurotus ostreatus mushroom. Natural product research. 2015. Vol. 29. No 16. P. 1557-1561. DOI: 10.1080/14786419.2014.983918 Radzki W., et al. Effect of processing on the content and biological activity of polysaccharides from Pleurotus ostreatus mushroom. LWT-FoodScience and Technology. 2016. Vol. 66. P. 27-33. DOI: 10.1016/j. lwt. 2015.10.016
9. Феофилова Е. П. Мицелиальные грибы как источники получения новых лекарственных препаратов с иммуномоду-лирующей, противоопухолевой и ранозаживляющей активностями // Иммунопатология, аллергология, инфекто-логия. 2004. № 1. С. 27-32. [Feofilova E. P. Mycelial fungi as sources of new drugs with immunomodulatory, antitumor, and wound healing activity. Immunopathology, allergology, infectious diseases. 2004. No. 1. P. 27-32. (in Russian)]
10. Giavasis I. Bioactive fungal polysaccharides as potential functional ingredients in food and nutraceuticals //Current
6
5
8
4
6
4
2
0
0
5
6
7
8
Opinion in Biotechnology. 2014. Т. 26. С. 162-173. DOI: 10.1016/j. copbio. 2014.01.010
11. Gargano M. L., et al. Medicinal mushrooms: Valuable biological resources of high exploitation potential. Plant Biosystems-An International Journal Dealing with all Aspects of Plant Biology. 2017. Vol. 151. No 3. P. 548-565. DOI: 10.1080/11263504.2017.1301590
12. Antontceva E., et al. Influence of Pleurotus ostreatus preparations on fermentation products of lactic acid cultures. Journal of Hygienic Engineering and Design. 2018. Vol. 22. С. 47-52.
13. Frioui M., et al. Rheological influence of (1-3) (1-6) mushrooms P-Glucan, used as flour substitution in bakery industry. Proceedings of the 45th International Symposium on Agricultural Engineering, Actual Tasks on Agricultural Engineering, 21-24 February 2017, Opatija, Croatia. — University of Zagreb, Faculty of Agriculture, 2017. P. 377-384.
14. Jesenak M., et al. Immunomodulatory effect of pleuran (P-glucan from Pleurotus ostreatus) in children with recurrent respiratory tract infections. International Immunopharmacology. 2013. Vol. 15. No 2. P. 395-399. DOI: 10.1016/j. intimp. 2012.11.020
Сведения об авторах
Антонцева Екатерина Валерьевна
старший преподаватель кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета), 190013, Россия, Санкт-Петербург, Московский проспект, 26, [email protected]
Сорокин Сергей Сергеевич
аспирант кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета), 190013, Россия, Санкт-Петербург, Московский проспект, 26, [email protected]
Терентьев Данил Олегович
магистрант кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета), 190013, Россия, Санкт-Петербург, Московский проспект, 26, [email protected]
Седых Виктория Александровна
магистрант кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета), 190013, Россия, Санкт-Петербург, Московский проспект, 26, [email protected]
Шамцян Марк Маркович
к. т. н., доцент кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета), 190013, Россия, Санкт-Петербург, Московский проспект, 26, [email protected]
15. Pasnik J., et al. Preventive effect of pleuran (P-glucan from Pleurotus ostreatus) in children with recurrent respiratory tract infections-open-label prospective study. Current Pediatric Research. 2017. Vol. 21. No 1. P. 99-104.
16. Giavasis I., Biliaderis C. G. Microbial polysaccharides. Functional food carbohydrates. CRC Press, 2006. P. 178-224.
17. Zhang H., et al. Effect of carbon source on properties and antioxidant potential of exopolysaccharides produced by Trametes robiniophila (Higher Basidiomycetes). International journal of medicinal mushrooms. 2015. Vol. 17. No 2. P. 179186. DOI: 10.1615/IntJMedMushrooms. v17. i2.90
18. Hoa H. T., Wang C. L. The effects of temperature and nutritional conditions on mycelium growth of two oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus and Pleurotus cystidiosus). Mycobiology. 2015. Vol. 43. No 1. P. 14-23. DOI: 10.5941/ MYCO. 2015.43.1.14
19. Wang L., et al. Bioprocessing strategies to improve heterologous protein production in filamentous fungal fermentations. Biotechnology advances. 2005. Vol. 23. No 2. P. 115-129. DOI: 10.1016/j. biotechadv. 2004.11.001
Information about authors
Antontceva Ekaterina Valeryevna
Assistant Professor of Department of Technology of Microbiological Synthesis Saint-Petersburg State Institute of Technology, 190013, Russia, Saint-Petersburg, Moskovsky prospect, 26, [email protected]
Sorokin Sergey Sergeevich
Postgraduate Student of Department of Technology of Microbiological Synthesis Saint-Petersburg State Institute of Technology, 190013, Russia, Saint-Petersburg, Moskovsky prospect, 26, [email protected]
Terentyev Danil Olegovich
Undergraduate of Department of Technology of Microbiological Synthesis Saint-Petersburg State Institute of Technology, 190013, Russia, Saint-Petersburg, Moskovsky prospect, 26, [email protected]
Sedykh Viktoriya Aleksandrovna
Undergraduate of Department of Technology of Microbiological Synthesis Saint-Petersburg State Institute of Technology, 190013, Russia, Saint-Petersburg, Moskovsky prospect, 26, [email protected]
Shamtsyan Mark Markovich
PhD, Associate professor of Department of Technology of Microbiological Synthesis Saint-Petersburg State Institute of Technology, 190013, Russia, Saint-Petersburg, Moskovsky prospect, 26, [email protected]
