CC BY
17
УДК 577.114.5, 57.03
Безяева А.Д., Красноштанова А.А.
ПОДБОР ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ И СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВКЛЮЧЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА В ХИТОЗАН-АЛЬГИНАТНЫЕ И ХИТОЗАН -ПЕКТИНОВЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ
Безяева Анастасия Дмитриевна - магистр 1-го года обучения кафедры биотехнологии; bezyaeva.nastasiya@gmail.com.
Красноштанова Алла Альбертовна - доктор химических, доцент, профессор кафедры биотехнологии; ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Россия, Москва, 125480, ул. Героев Панфиловцев, дом 20.
Получены хитозан-альгинатные микрочастицы, нагруженные доксорубицином и приведены их ключевые характеристики. Подобраны оптимальные условия для получения хитозан-пектиновых микрочастиц, нагруженных доксорубицином. Определена емкость микрочастиц по данному препарату и его степень сорбции в микрочастицы.
Ключевые слова: пероральная доставка лекарств, микрочастицы, хитозан, альгинат, пектин
SELECTION OF OPTIMAL CONDITIONS AND COMPARISON OF THE EFFECTIVENESS OF THE INCLUSION OF DOXORUBICIN IN CHITOSAN-ALGINATE AND CHITOSAN-PECTIN MICROPARTICLES
Bezyaeva A.D., Krasnoshtanova A.A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
Chitosan-alginate microparticles loaded with doxorubicin are obtained and their key characteristics are given. Optimal conditions for the production of chitosan-pectin microparticles loaded with doxorubicin were selected. The capacity of microparticles for this preparation and its degree of sorption into microparticles were determined. Key words: oral drug delivery, microparticles, chitosan, alginate, pectin
Введение
Пероральный способ введения лекарственных средств является наиболее предпочтительным в терапии за счет простоты и удобства применения, атравматичности введения терапевтического средства в организм, а также возможности введения больших доз лекарства [1]. Однако, несмотря на все преимущества перорального способа доставки лекарства, данный метод введения имеет ряд недостатков, ограничивающих его применение в терапии. Среди них можно выделить разрушение ряда высокомолекулярных молекул в среде ЖКТ, агрессивное воздействие ряда молекул на ЖКТ, низкую проницаемость эпителия кишечника для высокомолекулярных и гидрофильных соединений, а также сравнительно высокое время ожидания терапевтического эффекта [1,2].
При разработке систем пероральной доставки лекарств применяются различные подходы, в частности, использование носителей (например, микрочастиц) на основе мукоадгезивных полимеров [2,3]. При синтезе данных микрочастиц предпочтительно применять способные к гелеобразованию биополимеры, способные менять свою структуру в зависимости от изменения рН среды. Микрочастицы, синтезированные из данных полимеров, способны обеспечить защиту активному веществу при его транспорте через желудок и его высвобождение в нейтральной среде кишечника [3]. Перечисленными свойствами обладают такие полисахариды как альгинат, пектин, каррагинан, ксилан и т.д. [4]. Данные полимеры нетоксичны и биодеградируемые, что делает их перспективным
материалом для синтеза носителей для пероральной доставки. Для придания полисахаридным микрочастицам мукоадгезивных свойств применяются полиэлектролитные комплексы, образованные вышеупомянутыми полисахаридами и хитозана, биоразлагаемого нетоксичного полисахарида, мономерами которого являются D-глюкозамины и N-ацетил^-глюкозамины. Нахождение данного полисахарида в составе микрочастиц позволяет увеличить время пребывания и количество лекарственного средства в месте абсорбции, тем самым усиливая транспорт вещества через эпителий кишечника [3]. В данной работе в качестве структурообразующего полисахарида применяли альгинат и пектин.
Целью данной работы является определения условий наиболее эффективной нагрузки низкомолекулярных соединений в полисахаридные микрочастицы, определение емкости данных микрочастиц и степени сорбции вещества в них, а также сравнение эффективности применения хитозан-альгинатных и хитозан-пектиновых микрочастиц для включения в них низкомолекулярных соединений на примере доксорубицина.
Экспериментальная часть
Объектами данного исследования являлись: низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 200 кДа со степенью диацетилирования не менее 85% (Sigma-Aldrich); альгинат натрия с низкой вязкостью (ALDRICH Chemistry); яблочный пектин с молекулярной массой 12 кДа и степенью
метаксилирования 66% (CargШ); лиофилизат доксорубицина гидрохлорида («Тева»).
Для синтеза хитозан-альгинатных микрочастиц к 117,5 мл раствора пектина 0,063% весовых (pH 4,3) с помощью перистальтического насоса со скоростью 0,125 мл/мин по каплям вносили 7,5 мл раствора хлорида кальция 18 мМ. Раствор альгината натрия постоянно перемешивали на магнитной мешалке (800 об/мин). После полного внесения раствора хлорида кальция к полученной суспензии также при непрерывном перемешивании на той же скорости по каплям со скоростью 0,42 мл/мин помощью с помощью перистальтического насоса вносили 25 мл раствора хитозана 0,07% весовых (рН 4,6). Готовую суспензию перемешивали на магнитной мешалке (скорость не изменяли) в течение 30 минут для стабилизации полученных микрочастиц. Отделение микрочастиц от раствора производили методом центрифугирования при режиме 10000 об/мин 30 минут.
Для синтеза хитозан-пектиновых микрочастиц брали 117,5 мл раствора пектина 0,094% весовых (pH 4,3), 25 мл раствора хитозана 0,07% весовых 4,6) и 7,5 мл раствора хлорида кальция 22 мМ. Схема смешения исходных растворов аналогична вышеописанной для синтеза хитозан-альгинатных микрочастиц.
Для получения микрочастиц, нагруженных лекарственным веществом (в данной работе в качестве активного соединения использовался доксорубицин), его добавляли в исходный раствор структурного полисахарида (альгината или пектина).
Емкость полисахаридных микрочастиц по доксорубицину определяли с помощью измерения
концентрации вещества в надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования суспензии нагруженных микрочастиц. Концентрацию доксорубицина устанавливали по оптической плотности пробы при длине волны 475 нм против дистиллированной воды в качестве контроля [5].
В ходе предыдущих исследований были подобраны оптимальные условия синтеза микрочастиц, при которых их максимальный размер не превышал разрешенные для препаратов перорального введения 1000 мкм [6], дзетта-потенциал, характеризующий их тенденцию к слипанию, был выше порога слипания |27-29| мВ, и также достигалось наиболее полное связывание хитозана с микрочастицами (Таблица 1).
Для оценки эффективности применения полисахаридных микрочастиц в качестве носителя для пероральной доставки лекарств определялись емкость данных микрочастиц и степень сорбции вещества в них. В качестве терапевтического агента с низкой молекулярной массой в данной работе использовали доксорубицин. Для определения емкости микрочастиц по данному антибиотику при приготовлении суспензии микрокапсул в раствор структурного полисахарида вносили доксорубицин, варьируя его концентрацию в диапазоне 0,021 - 0,13 мг/мл (в отношении готовой суспензии микрочастиц). Количество вещества, не вошедшего в микрочастицы, определяли по надосадочной жидкости, измеряя концентрацию доксорубицина в нем. Отдельно был измерен фон - надосадочная жидкость, полученная после центрифугирования пустых ненагруженных микрочастиц. Данные по емкости микрочастиц и степени сорбции доксорубицина в них представлены в виде графиков (рис.1-4).
Таблица 1. Оптимальные условия получения микрочастиц полисахаридов и их характеристики
Структурообразующий полисахарид Альгинат Пектин
Концентрация структурообразующего полисахарида в растворе, % весовой 0,063 0,094
Концентрация СаСЪ в растворе, мМ 18 22
рН суспензии микрочастиц 4,3-4,4 4,3-4,4
Размер микрочастиц, нм 600-800 700-800
Дзетта-потенциал, мВ -(37±3) -(35±3)
Выход микрочастиц, мг/мл 0,236 0,303
О 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 Концентрация доксорубицина, мг/мл Рис. 1. Зависимость степени сорбции доксорубицина в хитозан-альгинатные микрочастицы от его концентрации в суспензии
О 0,05 0,1
Концентрация доксорубицина, мг/мл
Рис.2. Зависимость количества включенного в хит озан-ал ьгинатные микрочаст ицы доксорубицина от его концентрации в суспензии
100 90
so
i 70
щ 60 а. о
и л
X
<и с
<L> I-
50 40 30 20 10 0
О 0,05 ОД 0Д5
Концентрация доксорубицина, мг/мл
Рис. 3. Зависимость степени сорбции доксорубицина в хитозан-пектиновые микрочастицы от его концентрации в суспензии
Из полученных графиков звидно, что хитозан-альгинатные микрочастицы имеют большую ёмкость, чем хитозан-пектиновые (88,06 и 77,28 мг/г микрочастиц соответственно), но при этом меньшую степень сорбции как максимальную (40,02 и 69,41 % соответственно), так и ту, при которой достигается максимальная нагрузка микрочастиц (40,02 и 52,11 % соответственно).
Заключение
Получены хитозан-альгинатные и хитозан-пектиновые микрочастицы, не имеющие тенденцию к слипанию, диаметр которых составлял 600-800 нм. Получены нагруженные доксорубицином полисахаридные микрочастицы и определены оптимальные условия загрузки доксорубицина в них. Для хитозан-альгинатных микрочастиц концентрация доксорубицина, при которой нагрузка микрочастиц достигает 88,06 мг/г микрочастиц и степень 40,02 %, составляет 0,072 мг/мл суспензии. Для хитозан-пектиновых микрочастиц концентрация
доксорубицина, при которой нагрузка микрочастиц достигает 77,28 мг/г микрочастиц и степень 52,11 %, составляет 0,042 мг/мл суспензии. Определены емкость полисахаридных микрочастиц и их степень сорбции по доксорубицину. Хитозан-альгинатные микрочастицы по сравнению с хитозан-пектиновыми обладают большей емкостью, что ведет к меньшему требуемому количеству «балластного» носителя в препарате; но меньшей степенью сорбции, что приводит к потере лекарственного средства при его загрузке в микрочастицы. Полученные на данном этапе результаты не позволяют определить, какой из носителей наиболее предпочтителен для микрокапсулирования низкомолекулярных веществ, поскольку использование как хитозан-альгинатных, так и хитозан-пектиновых микрочастиц имеет
90
80
о
<и 70
э
=1 го X zr 60
ai X
3 — и 50
а X го
со о ю >' т ¡É 40
CG а.
1- о 30
<и и: Ъ
Г о 1 20
X Ч
^ о 10
0 0,05 ОД 0Д5
Концентрация доксорубицина, мг/мл Рис.4. Зависимость количества включенного в
хитозан-пектиновые микрочастицы доксорубицина от его концентрации в суспензии
преимущества и недостатки в сравнении друг с другом. В связи с этим требуется проведение дальнейших исследований, направленных на изучение мукоадгезионных свойств получаемых микрочастиц и их устойчивости в отношении протеолитических ферментов.
Список литературы
1. Кравченко И.А. Способы введения лекарственных препаратов в организм/ И.А. Кравченко: Астропринт, 2009. - 82 стр.
2. Michael Goldberg, Challenges for the oral delivert of macromolecules/ Michael Goldberg, Isabel Gomez-Orellana// Nature Publishing Group - 2003. - Vol. 2. - p. 289 - 295.
3. Kyeongsoon Park, Oral protein delivery: Current status and future prospect/ Kyeongsoon Park, Ick Chan Kwon, Kinam Park// Reactive & Functional Polymers. - 2011. - 71. - p. 280-287.
4. Микро- и наночастицы из альгината и хитозана для трансмуказальной доставки белка/ Е.А. Киржанова, М.А. Печенкин, Н.Б. Демина*, Н.Г. Балабушевич// Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия - 2016. - Т. 57. - № 2. - стр. 103 - 111.
5. Транспортная форма противоопухолевых препаратов доксорубицина и мелфалана на основе аполипопротеина А-I плазмы крови/ Р.А. Князев, Н.В. Трифонова, Л.М. Поляков// Журнал "Современные проблемы науки и образования". - 2016. - № 6.
6. Российская федерация. Министерство здравоохранения. Об утверждении правил изготовления и отпуска лекарственных препаратов для медицинского применения аптечными организациями, индивидуальными предпринимателями, имеющими лицензию на фармацевтическую деятельность N 751н от 26.10.2015 г.
