CC BY
2810. Gladyshev Georgi P., The Principle of Substance Stability Is Applicable to All Levels of Organization of Living Matter Int. J. Mol. Sci. 2006; 7, pp. 98110 (PDF format, 130 K).
http ://www.mdpi.org/ij ms/papers/i7030098.pdf
11. Gladyshev G.P., Leonhard Euler's Methods and Ideas Live in the Thermodynamic Hierarchical Theory of Biological Evolution. International Journal of Applied Mathematics and Statistics, 2007, 11, pp. 52-68.
12. Gladyshev G.P., Thermodynamics of the origin of life, evolution, and aging, International Journal of Natural Science and Reviews. 2017. pp. 2-7. http://escipub.com/ijnsr-2018-01-1001/
13. Gladyshev G.P. Hierarchical thermodynamics explains the origin of life and its evolution, Norwegian Journal of development of the International Science, No 17/2018, pp. 27-35. ISSN 3453-9875 http://www.njd-iscience.com/archive/ http://www.nor-wegian-journal.com/wp-content/up-
loads/2018/05/NJD_17_3 .pdf
14. Gladyshev G. P. Chemical and biological evolution: the principle of substance stability in action, Norwegian Journal of development of the International Science No 17/2018, VOL.3, pp. 36-41. http://www.njd-iscience.com/archive/
15. Gladyshev G. P., Hierarchical Thermodynamics: Foundation of Extended Darwinism. Imperial Journal of Interdisciplinary Research (IJIR), 2017, Vol-3, Issue-2, ISSN: 2454-1362.
https://www. researchgate.net/publica-tion/314082150_Hierarchical_Thermodynam-ics_Foundation_of_Extended_Darwinism http://impe-rialjournals.com/in-dex.php/IJIR/article/view/4265/4085
16. Gladyshev G.P. Nature Tends to Maximum Stability of Objects in all Matter Hierarchies. Imperial Journal of Interdisciplinary Research (IJIR) Vol-3, Is-sue-3, 2017 . https://www.onlinejour-nal.in/IJIRV3I3/327.pdf
17. Gladyshev G.P. J Thermodyn Catal , 2017, 8: 2 DOI: 10,4172 / 2157-7544.100018, Life - A Complex Spontaneous Process Takes Place against the Background of Non-Spontaneous Processes Initiated by the Environment.
https://www.omicsonline.org/open-access/life--a-complex-spontaneous-process-takes-place-against-the-background-of-nonspontaneous-processes-initiated-by-the-environment-2157-7544-1000188.php?aid=91824
18. Gladyshev G. P. On the thermodynamics of a high-energy phosphate pool in biochemistry, Norwegian Journal of development of the International Science No 18/2018, VOL.2, pp. 18 - 21. http://www.njd-iscience.com/archive/
OBTAINING CHITOZAN-ALGINATE MICROPARTICLES LOADED WITH 5-FLUORORACIL AND FOLIIC ACID AS A SUBSTANCE FOR COMPLEX PREPARATION FOR CHEMOTHERAPY
Kuznetsova D.
Master student of D.Mendeleev University of Chemical Tecnology of Russia
Krasnoshtanova A.
Doctor of chemical sciences, associate professor, professor of the department of biotechnology
of D.Mendeleev University of Chemical Tecnology of Russia
ПОЛУЧЕНИЕ ХИТОЗАН-АЛЬГИНАТНЫХ МИКРОЧАСТИЦ, НАГРУЖЕННЫХ 5-ФТОРУРАЦИЛОМ И ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТОЙ КАК СУБСТАНЦИИ ДЛЯ КОМПЛЕКСНОГО
ПРЕПАРАТА ДЛЯ ХИМИОТЕРАПИИ
Кузнецова Д.А.
магистрант РХТУ имени Д.И. Менделеева Красноштанова А.А.
д.х.н., доцент, профессор кафедры биотехнологии РХТУ имени Д.И. Менделеева
Abstract
In this article the conditions for the incorporation of 5-fluorouracil and folic acid into chitosan-alginate mi-croparticles were selected and the release of drugs in a medium simulating the acidity of the gastrointestinal tract was investigated. Аннотация
В работе подобраны условия включения 5-фторурацила и фолиевой кислоты в хитозан-альгинатные микрочастицы и исследовано высвобождение лекарственных препаратов в среде, моделирующей кислотность желудочно-кишечного тракта.
Keywords: chemotherapy, alginate, chitosan, microparticles, folic acid, 5-fluorouracil.
Ключевые слова: химиотерапия, альгинат, хитозан, микрочастицы, фолиевая кислота, 5-фторура-
цил.
Онкологические заболевания в настоящее патологий, причём с каждым годом количество лю-время являются одной из самых распространенных дей, страдающих злокачественными новообразова-
ниями, неуклонно растет. Наиболее широко используемым способом лечения пациентов с онкологическими заболеваниями является химиотерапия, принцип которой основан на введении в организм сильнодействующих лекарственных препаратов, которые уничтожают раковые клетки или ингиби-руют их развитие.
В общей статистике онкологических заболеваний колоректальный рак, или рак толстой кишки занимает 4-е место среди наиболее часто выявляемых злокачественных опухолей. Ежегодно рак толстой кишки диагностируется более чем у 1 млн человек, смертность от данного вида рака составляет около 50%, причем, примерно в 70% случаев опухоль возникает в ободочной кишке, в 30% случаев - в прямой кишке [1]. Особенно высокий уровень заболеваемости наблюдается в США, Европе и России [2].
Наиболее эффективными противоопухолевыми препаратами при данной патологии до настоящего времени остаются фторпроизводные пиримидина, в частности фторурацил. Механизм действия фторурацила заключается в непосредственной блокаде фермента тимидилат-синтазы, который лимитирует реакцию синтеза пи-римидиновых оснований. Препарат вводится внутривенно, как правило, совместно с фолинатом кальция - восстановленной фолиевой кислотой. Фолинат кальция стабилизирует присоединение фторурацила к тимиделатсинтазе, что позволяет улучшить ингибирование синтеза ДНК. Результаты исследований показали, что комбинация этих препаратов в послеоперационном периоде у больных колоректальным раком 2-ой и 3-ей стадий улучшает безрецидивную и общую выживаемость [3].
Наиболее удобным с точки зрения качества жизни пациентов является пероральноее введение лекарственных средств.
Однако пероральное введение 5-фторурацила вызывает многочисленные нежелательные побочные эффекты. Известно, что препарат 5-фторура-цила может вызывать повреждение слизистой на всем протяжении пищеварительного тракта. Антагонисты фолиевой кислоты могут вызывать уменьшение числа митозов в эпителиальных клетках и снижать степень абсорбции ксилозы и других нут-риентов. Пероральное введение 5-фторурацила также приводит к дефициту дипептидаз [4].
Недостаточная избирательность лекарственных средств, в том числе и применяемых в химиотерапии, требует разработки систем адресной доставки лекарств, что позволяет существенно снизить вероятность побочных реакций организма на медикаментозное воздействие; повысить локальную концентрацию в целевых клетках, что даёт возможность сократить терапевтическую дозу лекарства и кратность его введения. Иммобилизация лекарственного препарата на модифицированных носителях позволяет повысить биодоступность активного вещества, целенаправленно воздействовать на пораженные участки, предотвращая множество побочных реакций. Также еще одним преимуществом систем адресной доставки является
возможность создания препаратов пролонгированного действия. Таким образом, использование систем адресной доставки открывает новые перспективы для эффективного лечения раковой опухоли.
На сегодняшний день в качестве носителей активно изучаются полимеры, липосомы, магнитные наночастицы, углеродные нанотрубки, дендримеры и др. [5-8].
Использование хитозан-альгинатных микро- и наночастиц для транспорта и целенаправленной доставки противоопухолевых препаратов является одним из перспективных направлений в онкологии. Наночастицы обеспечивают стабилизацию инкапсулированного в них препарата, следовательно, минимизируют его негативное воздействие на организм, а также позволяют получить препарат с пролонгированным действием [9].
В обзоре [10] было сделано заключение, что образование раковых клеток может быть спровоцировано свободными радикалами. В связи с этим ан-тиоксидантные свойства хитозана могут быть полезными для снижения рисков возникновения рака в организме человека.Противораковые свойства хитина, хитозана и олигосахаридов хитозана стали темой одной из недавних научных В работе [11] хитин и олигосахариды хитозана классифицировали как добавки, используемые в борьбе с раком.
Таким образом, целью данной работы являлось получение хитозан-альгинатных микрочастиц, нагруженных 5-фторурацилом и фолиевой кислотой.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования в работе использовали альгинат натрия со степенью диацети-лирования не менее 75% и молекулярной массой 30 кДа, производства компании Sigma-Aldrich; хито-зан низкой вязкости производства компании ALDRICH Chemistry с молекулярной массой 800 кДа, раствор 5-фторурацила с концентрацией 50 мг/мл основного вещества производства компании «Новосибхимфарм», фолиевую кислоту с содержанием основного вещества не менее 95% производства компании ОАО «Марбиофарм».
Концентрации 5-фторурацила и фолиевой кислоты в растворах определяли, измеряя поглощение, соответственно при 265 и 365 нм.
Для приготовления нагруженных микрочастиц к 117,5 см3 0,063%-ного раствора альгината натрия с внесенным в него лекарственным средством (фто-рурацилом или фолиевой кислотой), по каплям при перемешивании добавляли 7,5 см3 18мМ раствора хлорида кальция. К полученному раствору по каплям добавляли 25 см3 0,070%-ного раствора хито-зана. Микрочастицы отделяли от надосадочного раствора путем центрифугирования на центрифуге «Eppendorf AG 22331» со скоростью 11000 об/мин в течение 30 минут. Вышеприведенные концентрации реагентов были подобраны ранее и позволяют получить микрочастицы размеров 800-1000 нм, что является оптимальным для перорального введения [12]. Дзета-потенциал хитозан-альгинатных микрочастиц составляет 30±3 мВ, что свидетельствует об отсутствии агрегации [13].
Для построения параллельного профиля к 0,3 г микрочастиц добавляли 3 см3 буферного раствора с требуемым значением рН среды, инкубировали в течение заданного времени при комнатной температуре, периодически перемешивая. По истечении времени инкубации микрочастицы отделяли от надосадочного раствора путем центрифугирования на центрифуге «Eppendorf AG 22331» со скоростью 11000 об/мин в течение 30 минут.
Для построения последовательного профиля к 0,3 г микрочастиц добавляли 3 см3 буферного раствора с требуемым значением рН среды, инкубировали в течение заданного времени при комнатной температуре, периодически перемешивая. По окончании инкубации микрочастицы отделяли от надо-садочного раствора центрифугированием на центрифуге «Eppendorf AG 22331» со скоростью 11000
so
к
S X
(U У
S ч
зе ш
•О X
(U
с
(U
100 80 60 40 20 0
об/мин в течение 30 минут. К полученным микрочастицам добавляли следующий буферный раствор и проводили операции, аналогичные вышеописанным.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы определяли ёмкость хитозан-альгинатных микрочастиц отдельно по 5-фторурацилу и фолиевой кислоте, варьируя их начальные концентрации соответственно в интервалах 0,01-0,17 мг/мл и 0,027-0,267 мг/мл соответственно.
Эффективность включения лекарственных препаратов в адресную систему доставки оценивали по их остаточной концентрации в растворе после отделения микрочастиц. Полученные результаты представлены на рис. 1.
0,05 0,1 0,15 0,2
концентрация фолиевой кислоты, мг/мл
0,25
0,3
а)
OS К
S X
ш т
е;
5£
m .о
X
ш с ш
100 80 60 40 20
0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 концентрация фторурацила, мг/мл
0,16 0,18
б;
Рисунок 1 - Зависимость степени включения фолиевой кислоты (а) и фторурацила (б) в хитозан-альги-натные микрочастицы от их концентрации в растворе.
Из рисунка 1 видно, что оптимальной концентрацией фолиевой кислоты, обеспечивающей степень включения более 95%, является 0,03 мг/см3, а для 5-фторурацила аналогичная величина составляет 0,015 мг/ см3. При дальнейшем увеличении концентраций исследуемых лекарственных средств степень включения снижается, что обусловлено превышением ёмкости хитозан-альгинатных микрочастиц. Максимальная степень включения 5-фто-рурацила и фолиевой кислоты согласуется с физиологическими концентрациями лекарственных средств при монотерапии и комбинированном лечении раковой опухоли.
Для дальнейшего исследования системы адресной доставки фолиевой кислоты и 5-фторурацила, включенных в хитозан-альгинатные микрочастицы необходимо определить, в каком отделе желудочно-кишечного тракта будут высвобождаться лекарственные вещества и оценить полноту высвобождения.
При проведении эксперимента по изучению динамики процесса высвобождения лекарственных средств из хитозан-альгинатных микрочастиц моделировали желудочно-кишечный тракт человека, используя растворы соляной кислоты (рН 1,2) и фосфатного буфера со значениями рН 4,2; 5,6; 6,0;
0
0
0
7,2, что соответствует различным отделам желудочно-кишечного тракта человека [14]. Высвобождение 5-фторурацила и фолиевой кислоты из микрочастиц изучали в последовательном и параллельном режимах согласно вышеописанной методике.
На рисунке 2 представлены зависимости степеней высвобождения 5-фторурацила и фолиевой кислоты от времени нахождения микрочастиц в буферных растворах указанной кислотности.
В результате проведенных экспериментов было выявлено, что при рН 4,2 в интервале времени
100
5-60 минут инкубации фолиевая кислота высвобождается из микрочастиц не более, чем на 20%, а фто-рурацил не более, чем на 5%. В кислой среде желудка степень высвобождения лекарственных средств не превышает 10-20%, причем степень высвобождения фторурацила меньше, чем фолиевой кислоты.
Это позволяет предположить снижение отрицательного воздействия фторурацила на слизистую желудка.
к S X
<и
el
£
о
VO
о m и Ъ со •О X
<и с <и
so
as
80 60 40 20 0
20
40 60
время, мин
80
100
0
so
ev
ОС S X
<и
X о ю
° S
CQ U
Z m
.о
X X
0J
с
0J
рН 1,2
рН 4,2
100 80 60 40 20
-рН 5,6
а)
рН 6.2
рН 7,0
20
40
60
80
100
рН
0
0
-•-рН 1,2 -и-рН 4,2 -А-рН 5,6 -рН 6,2 -»-рН 7,0
б)
Рисунок 2 - Профиль параллельного высвобождения фолиевой кислоты (а) и фторурацила (б) из хито-
зан-альгинатных микрочастиц
Наибольшее значение степени высвобождения обоих лекарственных средств составило 95-100% и наблюдалось при рН 7,0, что соответствует значению кислотности тонкого кишечника ЖКТ человека, где и должно происходить их максимальное всасывание.
Построение последовательного профиля высвобождения предполагает последовательное внесение одной и той же порции нагруженных лекарственными препаратами микрочастиц в буферные
растворы с различными значениями рН среды с целью моделирования процесса прохождения носителя через желудочно-кишечный тракт человека.
На рисунке 3 представлены результаты данного эксперимента, которые показали, что как 5-фторурацил, так и фолиевая кислота практически полностью высвобождается при значениях рН 6,2 и 7,0, что соответствует кислотности тонкого кишечника человека, откуда далее лекарственные средства всасываются в кровь, что подтверждает данные, полученные при изучении параллельного высвобождения.
к s
X
ш
£ о
VO
s ^
<J
Ъ ta .û x
(U
с
(U
100 80 60 40 20 0
РН
к s
X
<u el
£ о
VO
о со
U
z
со л
X
aj с aj
so
ffv
100 80 60 40 20 0
а)
4
рН
б)
Рисунок 3 - Профиль последовательного высвобождения фолиевой кислоты (а) и фторурацила (б) из
хитозан-альгинтаных микрочастиц
Выводы:
1. Определена степень включения 5-фторурацила и фолиевой кислоты в хитозан-альгинатные микрочастицы в количествах, достаточных для обеспечения необходимой лекарственной дозы. Установлено, что степень включения лекарственных средств в микрочастицы, равная 95-98%, составляет для 5-фторурацила 0,023 мг/мг, а для фолиевой кислоты - 0,045 мг/мг. Исследованы параллельный и последовательный профили высвобождения 5-фторурацила и фолиевой кислоты из хитозан-альгинатных микрочастиц в рН среде ЖКТ. Установлено, что максимальное высвобождение обоих лекарственных препаратов (95%) достигается при рН 7,0, что соответствует кислотности отдела тонкого кишечника, минимум (5-17%) находится при рН 4,2.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Parkin D.M., Bray F., Ferlay J. et al: Global cancer statistics // 2002. CA Cancer J Clin. 2005; 55:74-108.
2. Гарин А.М., Базин И.С. Десять наиболее распространенных злокачественных опухолей. -М., 2006; 266 с.
3. Курилов К.С., Жаркова О.В., Миронова Е.Б. и др. Новые возможности терапии диссемини-рованного колоректального рака // Вест. РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 2006. Т. 17. №3.
4. Снеговой А. В. и др. Нутритивная поддержка при проведении химиотерапии //РМЖ. 2008. Т. 16. №. 27. С. 1818-1822.
5. М.И Давыдов, А.Ю. Барышников. Наноон-кология // Сборник тезисов докладов научно-технологических секций международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech. 2008. Т.2. С.103.
6. Н. Валдэфнер, К.Дэкен, А. Йордан Магнитная наночастица для лечения и/или профилактики рака, на ее основе инфузионный раствор и фармацевтическая композиция. Патент 2490027 РФ. опубл. 20.08.2013. Бюл.23.
7. P. Wang, L. Zhang, H. Peng et al. The formulation and delivery curcumin with solid lipid nanopar-ticles for the treatment on non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo// Materials Science and Engineering. C. 2013. Vol. 33, №8. P. 4802-4808.
8. M. Foldvari, M. Bagonluri. Carbon nanotubes as functional excipients for nanomedicines. Drug delivery and biocompatibility issues // Nanomedicine. 2008. №4 (3). P. 449-454.
9. М.В. Коновалова и др. Получение, свойства и перспективы применения частиц на основе
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
2
3
6
8
1
5
7
хитозана и пектина // Известия Уфимского Научного Центра РАН. 2015. Т. 4, № 1. С. 68-70.
10. Ngo, D.H.; Kim, S.K. Antioxidant effects of chitin, chitosan and their derivatives. In Marine Carbohydrates: Fundamentals and Applications, Part B; Kim, S.-K., Ed.; Elsevier Inc.: Oxford, UK, 2014; pp. 15-31.
11. Azuma, K.; Osaki, T.; Minami, S.; Okamoto, Y. Anticancer and anti-inflammatory properties of chitin and chitosan oligosaccharides. //J. Funct. Biomater. 2015, 6, 33-49.
12. В.В.Гордеева, Г. И. Аксенова, И.Б. Васильев, И.А. Мурашкина. Лекарственные формы с регулируемым высвобождением. Часть 1. Системы доставки: учебное пособие. Иркутск: РПФ «Весь Иркутск», 2012. С. 40-50.
13. V.Proskurina, R. Tukhvatullina, D.Lerche, T. Sobisch, Yu. Galyametdinov, //Russian Journal of Applied Chemistry, 86(11), 1785-1790, 2013.
14. Г. Ф. Коротько. Желудочное пищеварение в технологическом ракурсе // Кубанский научный медицинский вестник. 2006. №7-8. С.17-21.
