CC BY
13
УДК 577.114.5, 57.03
Безяева А.Д. Красноштанова А.А
ВКЛЮЧЕНИЕ АМИЛАЗЫ В ХИТОЗАН-АЛЬГИНАТНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ
Безяева Анастасия Дмитриевна, студентка 3 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Красноштанова Алла Альбертовна, доктор химических, доцент, профессор кафедры биотехнологии, e-mail: aak28@yandex.ru ;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Получены хитозан-альгинатные наночастицы, нагруженные амилазой. Подобраны оптимальные условия,
обеспечивающие максимальную загрузку амилазы в наночастицы. Определена емкость наночастиц по амилазе.
Ключевые слова: наночастицы, хитозан, альгинат, амилаза
THE INCLUSION OF AMYLASE IN CHITOSAN-ALGINATE NANOPARTICLES
Bezyaeva A.D., Krasnoshtanova A.A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
Chitosan-alginate nanoparticles loaded with amylase were obtained. The optimum conditions for obespechivaushyi maximum load of amylase in nanoparticles. The amylase capacity of nanoparticles was determined. Keywords: nanoparticles, alginate, chitosan, amylase
Введение
В настоящее время одним из перспективных направлений в развитии эффективных форм ферментных препаратов является использование полисахаридных наночастиц. Они обеспечивают защиту загруженного в них препарата от агрессивной внешней среды. Другим достоинством наночастиц является контроль скорости высвобождения фермента, что дает возможность получить препарат пролонгированного действия [3].
В качестве материалов для конструирования наночастиц часто используют хитозан и альгинат, обладающих необходимыми для данной цели свойствами, такими как: отсутствие токсичности, мукоадгезивные свойства биоразлагаемость и биосовместимость.
Альгинат - анионный полисахарид, получаемый из бурых водорослей. Связываясь поперечными сшивками с ионами двухвалентного металла, альгиновая кислота в кислых средах образовывает гель, химическая структура которого подобна коробке для яиц, что позволяет удерживать вещество внутри себя. Благодаря вышеуказанным свойства, данный гель нашел широкое распространение в пероральной доставке лекарственных препаратов и создание новых форм ферментных препаратов [4].
Для стабилизации инкапсулированных веществ и повышения адсорбционных свойств наночастиц используют полиэлектролитный комплекс,
образующийся в результате смешивания двухвалентных солей альгината с хитозаном. Хитозан, благодаря своим положительно заряженным аминогруппам, способен взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами слизистой, что объясняет его высокие мукоадгезивные свойства, а также способен раскрывать плотные стенки клеточных контактов для улучшения всасывания лекарственного препарата [4-6].
Для усвоения пищи организм вырабатывает четыре основные группы гидролитических ферментов: протеолитические, амилолитические, липолитичекие и нуклеолитические. Амилазы - ферменты, продуцирующиеся в слюнных железах и
поджелудочной железе, катализирующие гидролиз крахмала до дисахаридов (сахаров). При недостаточной активности амилаз, потребленный крахмал, не способный усвоиться клетками организма, служит субстратом для патогенной микрофлоры, являющихся возбудителями заболеваний ЖКТ. Для нормализации пищеварения применяют ферментные препараты медицинского назначения. Амилаза представляет собой белок и может быть расщеплена протеазами ЖКТ. Хитозан-альгинатные наночастицы способны доставить фермент через ЖКТ до тонкого кишечника, где происходит всасывание данного вещества [1].
Таким образом, целью данной работы является подбор оптимальной концентрации амилазы, при которой будет достигнута максимальная загрузка фермента в наночастицы. Материалы и методы
В качестве объекта исследования использовалась амилаза бактериальная с активностью 3600 ед/г производства компании Shenzhen Leveking Bio-engineering Co, альгинат натрия низкой вязкости производства компании Sigma-Aldrich и низкомолекулярный хитозан со степенью деацилирования более 75% производства компании Sigma-Aldrich.
Для получения хитозан-альгинатных наночастиц к 117,5 мл раствора альгината 0,064% (массовых) и pH 4,3 по каплям со скоростью 0,125 мл/мин с помощью перистальтического насоса добавляли 7,5 мл раствора хлорида кальция 18 мМ. К полученному раствору с помощью перистальтического насоса со скоростью 0,42 мл/мин по каплям добавляли 25 мл раствора хитозана 0,07% (массовых) и pH 4,6. В процессе приготовления раствора его постоянно перемешивали на магнитной мешалке со скоростью 800 об/мин. Для стабилизации наночастиц готовую суспензию перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 минут со скоростью 800 об/мин. Наночастицы выделяли из суспензии путем центрифугирования со скоростью 10000 об/мин в течение 30 минут. Концентрацию белка в растворах определяли колориметрическим методом Лоури [2].
Результаты и обсуждение
Для определения емкости наночастиц по амилазе варьировали количество фермента в суспензии наночастиц. При приготовлении раствора альгината в него вносили амилазу в количестве, при котором в конечном растворе его концентрация составляла 0,001 - 0,10 мг/мл. Наночастицы, нагруженные амилазой получали вышеописанным способом. Для определения количества фермента, не включенного в наночастицы, определяли наличие белка в надосадочной жидкости методом Лоури.
Прежде чем определять емкость наночастиц по амилазе необходимо было проверить правомерность использования для этой цели метода Лоури, т.к. благодаря наличию гидроксильных групп в молекулах хитозана и альгината возможно искажение получаемых результатов.
На рисунке 1 представлены экспериментальные данные, полученные с помощью метода Лоури. По графику видно, что надосадочная жидкость, полученная при центрифугировании суспензии с пустыми наночастицами, дает фон, который необходимо учитывать при обработке результатов. Линейная зависимость оптической плотности от концентрации амилазы наблюдается при концентрациях последней более 0,04 мг/мл.
О.10
0,09 л
fi О.П8 у
I 0,0?
Я 0.0Э
jj 0,04 /Г
\ °'0:! « « « ____ - л
5 0,02 0,01 0,00
0,00 0,01 п,02 0,03 0,0-1 0,05 О,ОС 0,07 0,08 0,09 Концентрация, мг/мл
Рисунок 1. Зависимость оптической плотности растворов амилазы, определяемой методом Лоури, от ее концентрации в растворе
На рисунке 2 представлена обработка результатов с учетом фона ненагруженных наночастиц. Из графика видно, что при концентрации фермента в растворе меньше 0,35 мг/мл вся амилаза включена в наночастицы и поглощение возникает только в следствие фона. Для определения максимальной емкости хитозан-альгинатных наночастиц по амилазе была построена линия тренда через точки, отвечающие концентрациям фермента, превышающих емкость наночастиц, и экстраполирована на ось абсцисс. Таким образом, из рисунка 2 следует, что максимальная загрузка наночастиц достигается при концентрации 0,037 мг/мл.
Эффективность включения соединения в хитозан-альгинатные наночастицы характеризуется степенью его сорбции. Результаты зависимости степени включения амилазы от ее концентрации представлены на рисунке 3, из которого видно, что наибольшая эффективность включения амилазы в систему адресной доставки, со степенью включения более 98%, достигается при концентрации 0,037 мг/мл.
0,0V 0,05
л
1 0 05
I о,04
к
i
и 0,03
а j
J
0,01 0,00
0,00 0,01 0,0i 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,03 0,10 Концентрация амилазы, мг/плл
Рисунок 2. Зависимость оптической плотности растворов амилазы, определяемой методом Лоури, от концентрации амилазы с учетом фонового поглощения
I t /К ш- -•
saco п ваш £ 7ЦСС
1 к
; з b^ia
1 I saw
2 2
" X
I iftOO
£ ;hie iaco ода
ода 0.01 a02 0,03 Opt С У. ода 007 O.OS 0,09 0,10 0,11 Or12 OrI3 0.H ЬиИЦ'.' H РДОЦМН JMUj'ld J Ы, МГ/МЛ
Рисунок 3. Зависимость степени включения амилазы в хитозан-альгинатные микрочастицы от ее концентрации в растворе
Дальнейшее повышение концентрации не будет давать результата, что обусловлено превышением емкости хитозан-альгинатных наночастиц. Выводы
1. Показана правомерность использования метода Лоури при оценке емкости хитозан-альгинатных наночастиц по амилазе.
2. Подобрана оптимальная концентрация амилазы, при которой достигается ее максимальное включение в хитозан-альгинатные наночастицы. Емкость наночастиц по данному ферменту составляет 18,5 мг на 1 г наночастиц.
Список литературы
1. Эллиот В. Биохимия и молекулярная биология/ В. Эллиот, Д. Эллиот - М.: МАИК «Наука/ Интерпериодика», 2002. - 429 с.
2. Запруднова Е.А. Практикум по биохимии/ Е.А. Запруднова, А.Г. Гладилкина - Владимер: Издательство Владим. гос. ун-та, 2011. - 56 с.
3. Коновалова М.В. и др. Получение, свойства и перспективы применения частиц на основе хитозана и пектина // Известия Уфимского Научного Центра РАН. 2015. Т. 4, № 1. С. 68-70.
4. Хотимченко Ю.С. Углеводные биополимеры для адресной доставки белковых препаратов, нуклеиновых кислот и полисахаридов // Тихоокеанский Медицинский Журнал. 2014. № 2. С. 5-13.
5. Агабеков Владимир, Куликовская Виктория, Гилевская Ксения, Дубатовка Екатерина Нано- и микроконтейнеры для доставки биологически активных веществ // Наука и инновации. 2017. №170.
6. Киржанова Е.А. и др. Микро - и наночастицы из альгината и хитозана для трансмукозальной доставки белка // Вестник Московского Университета. Серия 2. Химия. 2016. Т. 57, № 2. С. 103-111.
