CC BY
37
УДК 615.322
□ ПОДБОР ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ КОРНЕЙ ДЕВЯСИЛА ВЫСОКОГО ПРИ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ЭКСТРАКЦИИ
Дьякова Н.А.
Научный руководитель - д.фарм.н., проф. Сливкин А.И.
Воронежский государственный университет, Россия, 394006, Воронеж, Университетская пл., 1. Ninochka_V89@mail.ru - Дьякова Н.А.
Резюме. Целью исследования являлась разработка экспрессной методики выделения и количественного определения водорастворимых полисахаридов из корней девясила высокого (Inula helenium L.). Для ускорения процесса извлечения биологически активных веществ из корней девясила высокого, а также увеличения выхода водорастворимых полисахаридов, решено было использовать ультразвуковую ванну. Варьируя показателями процесса, удалось подобрать оптимальные условия экстрагирования водорастворимых полисахаридов корней девясила высокого в условиях обработки ультразвуком: измельченность сырья 0,5 - 1,0 мм, температура -80 °С, кратность извлечения - 3, длительность экстракций - 15 мин, частота ультразвука - 35 кГц, соотношение сырья и экстрагента 1 г на 15 мл. Предлагаемая методика позволяет интенсифицировать процесс получения водорастворимых полисахаридов из корней девясила высокого и снизить время, расходуемое на него до 4-5 часов, а также увеличить выход продукта до 31,6 % в пересчете на абсолютно сухое сырье.
Ключевые слова: водорастворимые полисахариды; ультразвуковая ванна; корни девясила высокого; Inula helenium L.
□ SELECTION OF OPTIMAL CONDITIONS FOR ISOLATION OF WATER-SOLUBLE POLYSACCHARIDES FROM ROOTS OF HIGH DEVYASIL UNDER CONDITIONS OF ULTRASONIC EXTRACTION
Dyakova N.A.
Scientific adviser - Slivkin A.I., Dr. Sci. (Pharm.), Professor
Voronezh State University
1, University pl., Voronezh, 394006, Russia
Ninochka_V89@mail.ru - Dyakova N.A.
Abstract. The aim of the study was to develop an express procedure for the isolation and quantification of water-soluble polysaccharides from high devisyl roots (Inula helenium L.). In order to accelerate the process of extracting biologically active substances from the roots of high devisil, as well as to increase the yield of water-soluble polysaccharides, it was decided to use an ultrasonic bath. By varying the process parameters, it was possible to select optimal extraction conditions of water-soluble polysaccharides of high-grade roots under ultrasound treatment conditions: raw material grinding 0.5 -1.0 mm, temperature - 80 ° C, extraction multiplicity - 3, extraction duration - 15 min, ultrasound frequency - 35 kHz, with the ratio of raw material to extractor 1 g per 15 ml. The proposed technique allows to intensify the process of preparing water-soluble polysaccharides from roots and to reduce the time spent on it up to 4-5 hours, as well as to increase the yield of the product up to 31.6% in terms of absolutely dry raw materials.
Keywords: water-soluble polysaccharides; ultrasonic bathtub; roots of a Inula helenium L.
Введение. Девясил высокий (Mula helenium L.) — вид многолетних растений рода Девясил (Inula) семейства Астровые (Asteraceae), произрастает повсеместно в Европе, Азии и Африке. Корни девясила высокого отличаются богатым химическим составом и содержат водорастворимые полисахариды (ВРПС), основу которых составляет инулин (до 44%), а также эфирное масло, горькие вещества, сапонины, смолы, камеди, алкалоиды, органические кислоты, микро- и макроэлементы. Корни девясила высокого обладают отхаркивающим, противовоспалительным действием, антисептическим, желчегонным, спазмолитическим
действиями, улучшают аппетит. Благодаря широкому спектру фармакологической активности корни девясила высокого широко используются как лекарственное растительное сырье в виде отвара, а также входят в состав сборов и сиропов [1,2,8,9,10,14]. Таким образом, в фармацевтической практике используются водные извлечения из корней девясила высокого, а фармакологический эффект обусловлен водорастворимыми соединениями, основу которых составляют ВРПС.
Существует способ получения ВРПС из корней девясила высокого, включающий подготовку сырья, его механическую чистку, промывание корней, корневищ, стеблей, их измельчение и перемешивание. Перемешанные и измельченные кусочки сырья дважды экстрагируют горячей водой при температуре 75°С в течение 2-3 суток при постоянном перемешивании. Полученный экстракт обрабатывают 96%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:1 по объему с последующим осаждением ВРПС при температуре минус 16°С. Недостатком данного способа является длительность процесса (более 3 суток), низкий выход ВРПС (25,7%) [11].
Одним из перспективных физических методов воздействия на вещества с целью интенсификации технологических процессов является метод, основанный на использовании механических колебаний ультразвукового диапазона. Установлено, например, что ультразвуком частотой 19-44 кГц можно извлекать биологически активные вещества, в частности водорастворимые полисахариды, из растений с сокращением процесса экстракции на 1 - 2 порядка [3,4,13]. При этом имеет место не только значительное ускорение процесса извлечения из растений полезных веществ, но и увеличение по сравнению с другими методами экстрагирования выхода основного продукта [5,6,7].
Цель исследования - разработка экспрессной методики выделения и количественного определения водорастворимых полисахаридов из корней девясила высокого.
Методика. Для интенсификации процесса извлечения ВРПС применяли ультразвуковую ванну «Град 40-35», взвешивание проводили на аналитических весах «A&D GH-202», высушивание до постоянной массы - в сухожаровом шкафу «Витязь ГП-40». В качестве экстрагента использовали воду очищенную, остальные параметры процесса подбирались экспериментально. При разработке и валидации методики использовали сырье, приобретенное в одной из аптек города Воронежа (производитель ООО «Фитофарм», серия 170618).
Результаты. Изначально были определены оптимальные условия извлечения из корней девясила высокого ВРПС с использованием ультразвуковой ванны. Варьировали измельченностью сырья, температурным режимом экстрагирования, кратностью и длительностью экстрагирования, соотношением сырья и экстрагента, а также частотой ультразвука. Все определения проводили в трех повторностях. Результаты эксперимента приведены в таблицах 1,2,3. Каждое определение проводили троекратно. Полученные данные статистически обрабатывали с помощью программы «Microsoft Excel» при доверительной вероятности 95%.
Таблица 1. Результаты количественного определения ВРПС (% в пересчете на абсолютно сухое сырье в корнях девясила высокого при варьировании измельченностью сырья и температурой ультразвуковой ванны (при трехкратной экстракции по 15 минут с частотой ультразвука 35 кГц, соотношении сырья и экстрагента 1 г на 15 мл)_
' "—----Измельченность сырья, мм Температура, °С " ------- 0,2-0,5 0,5-1,0 1,0-2,0
60 16,32±0,40 15,19±0,34 12,25±0,50
70 22,42±0,26 24,90±0,37 18,28±0,42
80 26,12±0,25 31,36±0,44 25,99±0,39
Таблица 2. Результаты количественного определения ВРПС (% в пересчете на абсолютно сухое сырье) в корнях девясила высокого при варьировании кратностью и длительностью экстрагирования (при измельченности сырья 0,5-1,0 мм, температуре ультразвуковой ванны 80 °С с частотой ультразвука 35 кГц, соотношении сырья и экстрагента 1 г на 15 мл)_
——^^^^ Кратность экстракции Длительность " ——^^^^ экстракций, мин. —-—^^ 1 2 3
10 11,34±0,40 18,47±0,40 24,68±0,34
15 15,78±0,51 20,80±0,52 31,57±0,36
20 16,80±0,32 22,97±0,60 28,96±0,40
Таблица 3. Результаты количественных определений ВРПС (% в пересчете на абсолютно сухое сырье) в корнях девясила высокого при варьировании соотношением сырья и экстрагента и частотой ультразвука (при трехкратной экстракции по 15 минут, измельченности сырья 0,5-1,0 мм, температуре 80 °С)_
ЧсГетаулыразвука/КГЦ Соотношение " " —— сырья и экстрагента (г:мл) —-—_____ 15 25 35
1:10 14,68±0,30 21,86±0,43 23,49±0,30
1:15 15,86±0,45 26,37±0,30 31,57±0,36
1:20 16,90±0,37 24,30±0,52 27,96±0,46
При анализе данных таблиц 1-3, отмечено, что увеличение времени экстракции при трехкратном извлечении в условиях ультразвуковой ванны приводит, очевидно, к деструкции водорастворимых полисахаридов. Использование ультразвука с частотой выше 40 кГц также приводит к деструкции биологически активных веществ и в технологии фитопрепаратов не применяется [7]. Оптимальные условия экстрагирования ВРПС из корней девясила высокого в условиях ультразвуковой ванны таковы: измельченность сырья 0,5-1,0 мм, температура - 80 °С, кратность извлечения - 3, длительность экстракций - 15 минут, частота ультразвука - 35 кГц, соотношение сырья и экстрагента 1 г на 15 мл.
Комплекс проведенных экспериментальных работ дает возможность предложить следующую методику выделения и последующего количественного гравиметрического определения ВРПС в корнях девясила высокого. Аналитическую пробу сырья измельчают до частиц размера 0,5-1,0 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 15 мл воды очищенной, нагретой до температуры кипения, помещают в ультразвуковую ванну с частотой 35 КГц при температуре 80°С, экстрагируют 15 мин. Экстракцию повторяют ещё 2 раза, прибавляя по 15 мл воды. Водные извлечения объединяют и фильтруют в мерную колбу вместимостью 50 мл через 3 слоя марли с подложенным тампоном ваты, вложенных в стеклянную воронку диаметром 5 см и предварительно промытой водой очищенной. Фильтр промывают водой и доводят объём раствора до метки (раствор А). 12,5 мл раствора А помещают в коническую колбу на 50 мл, прибавляют 37,5 мл 95% этилового спирта, перемешивают, охлаждают в морозильной камере при температуре -18°С в течение 30 мин. Затем содержимое колбы фильтруют через предварительно высушенный и взвешенный беззольный бумажный фильтр, проложенный в стеклянный фильтр ПОР 16 с диаметром 40 мм, под вакуумом при остаточном давлении 0,4-0,8 атм. Осадок на фильтре последовательно промывают 15 мл раствора 95% этилового спирта в воде очищенной (3:1), 10 мл смеси этилацетата и 95% этилового спирта (1:1). Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, затем при температуре 100-105 °С до постоянной массы.
Содержание ВРПС в пересчёте на абсолютно сухое сырьё вычисляют по стандартной формуле:
где mi - масса высушенного фильтра, г;
m2 - масса высушенного фильтра с осадком, г;
т — навеска сырья, г;
W— потеря в массе сырья при высушивании, %.
Предлагаемый способ позволяет интенсифицировать процесс получения ВРПС из корней девясила высокого и снизить время, расходуемое на него до 4-5 часов, а также увеличить выход продукта до 31,57 ±0,36 % в пересчете на абсолютно сухое сырье.
Статистическая обработка результатов выделения и количественного определения ВРПС корней девясила высокого по разработанной методике приведена в табл. 4 (где N -число повторностей, f - число степеней свободы, X - среднее значение определяемой величины, S - дисперсия, S - стандартное отклонение, Sx - стандартное отклонение средней величины, Р - доверительная вероятность, ^Р,: - критерий Стьюдента, Ах - полуширина доверительного интервала величины, 8 - относительная ошибка среднего результата) [12]. Таким образом, относительная ошибка предлагаемой методики при доверительной вероятности 95 % составляет 1,42 %.
Таблица 4. Статистическая обработка результатов выделения и количественного определения ВРПС корней девясила высокого
N f X S2 S Sx P, % t(P,f) Дх e, %
10 9 31,61 0,0393 0,1982 0,0626 95 2,2622 0,44 1,42
Выводы. Разработана экспрессная методика выделения и количественного определения ВРПС из корней девясила высокого, которая может быть использована при контроле качества данного вида сырья и промышленном получении из него ВРПС, в частности, инулина. Подобраны оптимальные условия экстрагирования ВРПС из корней девясила высокого в условиях ультразвуковой ванны: измельченность сырья 0,5 - 1,0 мм, температура - 80 °С, кратность извлечения - 3, длительность экстракций - 15 мин, частота ультразвука - 35 кГц, соотношение сырья и экстрагента 1 г на 15 мл. Предлагаемая методика позволяет интенсифицировать процесс получения ВРПС из корней девясила высокого и снизить время, расходуемое на него до 4-5 часов, а также увеличить выход продукта до 31,6 % в пересчете на абсолютно сухое сырье.
Литература
1. Баньковский В.В. Применение вакуумного технологического процесса для выделения сесквитерпеновых лактонов из девясила высокого / В.В. Баньковский, Д.М. Попов, Д.В. Баньковский // Фармация. - 2010. - № 8. - С. 36-37.
2. Государственная фармакопея Российской Федерации. Издание XIV. Том 4. — М.: ФЭМБ, 2018. — 6012-6019 с.
3. Дьякова Н.А. Изучение динамики изменения содержания инулина в корнях лопуха большого (Arctium lappa L.) и одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Webb.) в процессе вегетации / Н.А. Дьякова, А.И. Сливкин, С.П. Гапонов, И.Ю. Михайловская // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. - 2016. - №. 4. - С. 133-136
4. Дьякова Н.А. Особенности накопления водорастворимых полисахаридов корнями одуванчика лекарственного / Н.А. Дьякова, А.А. Мындра, А.И. Сливкин, С.П. Гапонов // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2018. - № 2. - С. 292-297.
5. Дьякова Н.А. Оценка эффективности и безопасности лекарственного растительного сырья подорожника большого, собранного в Центральном Черноземье / Н.А. Дьякова, А.И. Сливкин, С.П. Гапонов // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2018. - № 1. - С. 172-179.
6. Дьякова Н.А. Разработка и валидация экспресс-методики выделения и количественного определения водорастворимых полисахаридов корней одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) / Н.А. Дьякова, А.И. Сливкин, И.А. Самылина, С.П. Гапонов, А.А. Мындра, Т.Г. Шушунова // Химико-фармацевтический журнал. - 2018. - Т. 52. -№ 4. - С. 40-43.
7. Дьякова Н.А. Разработка и валидация экспресс-методики выделения и количественного определения водорастворимых полисахаридов листьев лопуха большого (Arctium lappa L.) / Н.А. Дьякова // Химия растительного сырья. - 2018. - № 4. - С. 81-87.
8. Захаренко В.Г Девясил высокий - лекарственное и декоративное растение / В.Г. Захарова // Бюллетень Государственного Никитского ботанического сада. - 2006. - № 93. - С. 17-20.
9. Корж А.П. Водорастворимые полисахариды подземной части Inula helenium (Asteraceae) / А.П. Корж А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, М.С. Юсубов, М.Л. Белянин, А.Н. Байков // Растительные ресурсы. - 2011. - Т. 47. - № 3. - С. 88-92.
10. Куркин В.А. Фармакогнозия. СамГМУ, Самара. 2004. С 414-417.
11. Патент 2712094 (РФ). Способ получения очищенного инулина из растительного сырья / Н.А. Дьякова, А.А. Мындра, А.И. Сливкин // 2020. Бюл. №3. 7 с.
12. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. Москва: «МедиаСфера» - 2000. - 312 с.
13. Шушунова Т.Г. Выделение инулина из корней одуванчика лекарственного с использованием ультразвука / Т.Г. Шушунова, Н.А. Дьякова, А.И. Сливкин, Е.А. Мальцев // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ: Материалы 6-й Международной научно-методической конференции «Фармобразование-2016». - Воронеж: ИПЦ ВГУ. - 2016. - с.609-612.
14. Яницкая А.В. Девясил высокий - перспективный источник новых лекарственных средств / А.В. Яницкая, И.Ю. Митрофанова // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2012. - № 3 (43). - С. 24-27.
