CC BY
9болезни стадах. Эти показатели указывает на спровоцированное вакцинацией скрытое носительство L-формы возбудителя бруцеллеза. Такое носительство ориентируют на то, что возбудитель инфекции передаётся не только горизонтальным, но и вертикальным путём.
Содержание гипотезы применительно к возбудителю бруцеллёза КРС заключается в том, что основным местом его жизнедеятельности являются органы облигат-ного хозяина, функцию которого выполняют коровы. В них возбудитель закономерно живёт в авирулентной L-форме и не диагностируется существующими диагностическими тестами. Такая форма возбудителя бруцеллёза от коров передаётся к приплоду вертикальным путём. Их организм остаётся не защищённым от этой болезни только потому, что они инфицируются L-формой возбудителя.
Но на стадии глубокой стельности нетелей, выращенных из этого приплода, авирулентная форма возбудителя попадает в необычную для неё среду, что является стрессовым воздействием, трансформирующим её в вирулентную S-форму. За период функционирования такой формы она не успевает обеспечить соответствующий уровень защиты плода, и, как результат этого, на 6 - 8 месяце стельности у нетелей происходит аборт.
С абортированным плодом во внешнюю среду выделяется большое количество вирулентного возбудителя, и он инфицирует восприимчивых животных горизонтальным путём, что подтверждается серологическими тестами. Поскольку взрослые животные инфицируются вирулентной формой возбудителя этой болезни, то их организм подвергается соответствующей иммунобиологической перестройке, которая предупреждает аборты. Такая перестройка обеспечивает нормальное плодоношение и благополучные отелы, как инфицированных коров, так и коров, которые абортировали, будучи нетелями.
Только этим объясняется то, что коровы, положительно реагирующие на серологические тесты, не абортируют и не выполняет функцию источника возбудителя бруцеллёза. Но, их организм является средой естественной жизнедеятельности возбудителя бруцеллёза. Поэтому в нём Б-форма в течение 1,5 - 2 лет, а в ряде случаев и за более продолжительный период, ретрансформиру-ется в L-форму. Соответственно, корова становится скрытым носителем этой формы возбудителя бруцеллёза, передающим его только приплоду. В организме этого приплода, после его оплодотворения L-форма возбудителя бруцеллеза трансформируется в вирулентную форму, которая порождает аборт. После него рассеянная Б-форма возбудителя инфицирует других животных, у которых формируется иммунитет.
Таким образом, отличительными особенностями естественного течения эпизоотического процесса фактор-
ных инфекционных болезней, каким свойственна эстафетная передача возбудителя инфекции, является его скрытое носительство в L-форме. Болезни этой группы проявляются только после стрессовых воздействий на облигат-ных их хозяев. Такое проявление диагностируется серологическими или аллергическими тестами, и даже клиническими признаками, которые только подтверждают, что внутренние или внешние стрессовые воздействия уже трансформировали авирулентные формы в вирулентных возбудителей факторных инфекционных болезней, эпизоотическим процессам которых свойственна их эстафетная передача.
Знание о болезнях этой группы можно получить в соответствующих публикациях [9, 10].
Литература
1. Джупина С.И. Теория эпизоотического процесса. М., 2004, с. 121
2. Ощепков В.Г., Гордиенко Л.Н. L-трансформация бруцелл - значение в эпизоотическом процессе и эволюции рода Brucella. «Ветеринарная патология», №4, 2004, с. 36 - 46.
3. Шегидевич Э.А., Федотов В.Б., Крючков В.Я. Сероти-повой состав П. мультоцида при пневмонии ягнят. Труды ВИЭВ. - М., 1984, - т.60. - с.16 - 19.
4. Джупина С.И. Законы эпизоотического процесса. Издательство Palmarium Academic Publishing, Saarbrucken, Germany, 2013.
5. Протопопов А.П. Значение подстилки в теплообмене молодняка с.-х. животных. «Вестник с.-х. науки». №12, М., 1959, с 48 - 57
6. Джупина С.И. Различие контроля над эпизоотическим процессом пастереллёза и геморрагической септицемии. «Ветеринария сегодня», № 1 (12), с. 53 - 58.
7. Джупина С.И. Особенности профилактики некро-бактериоза КРС. «Ветеринария сегодня», №2 (13) с. 21 - 26
8. Кузьмиченок А.П. Фенотипическая и генотипиче-ская характеристика штаммов бруцелл разных видов, и разработка экспресс-метода их идентификации. Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук. Москва, 1996, с. 151
9. Джупина С.И. Эпизоотический процесс лейкоза КРС и перспективы девастации возбудителя этой инфекции. «Ветеринарная патология», 2014, №1 (47), с.98 - 103
10. Джупина С.И. Цикл развития возбудителя бруцеллёза КРС. «Научные перспективы ХХ1 века. Достижения и перспективы нового столетия».
Часть 5, №3, 2014, с. 161 - 163
ПОДБОР МЕТОДОВ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА _ПО ЗАМЕНЕ В ГЕНЕ DGAT1-К232А
Мукий Юлия Викторовна
кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская академия ветеринарной медицины», г. Санкт-Петербург, доцент кафедры ветеринарной генетики и животноводства
THE CHOICE OF METODS FOR GENOTYPING OF CATTLE BY MUTATIONS IN THE GENE DGAT1-K232A Mukiy Julia, Canidate of Science PhD, St. Petersburg Academy of Veterinary Medicine, assistant professor
АННОТАЦИЯ
Для выявления мутации К232А в гене DGAT1 у крупного рогатого скота отработана методика с применением реал-тайм ПЦР. Сконструированы праймеры, зонды, определены условия проведения ПЦР. В качестве контроля применялись ДНК матрицы. Результаты показали быстрый и точный анализ искомой замены и успешное применение данного метода.
ABSTRACT
To determine the mutation K232A in the gene DGAT1 used the method of real - time PCR. Designed primers, probes, defined PCR conditions. As controls were used the DNA matrix. The results gave a quick and accurate analysis of the desired mutation and the successful application of this method.
Ключевые слова: крупный рогатый скот; реал-тайм ПЦР; мутация К232А; ген DGAT1.
Keywords: cattle; Real - time PCR; K232A mutation; gene DGAT1.
В настоящее время большинство методик используемых для генотипирования животных основаны на ПДРФ (полиморфизме длин рестрикционных фрагментов). Эти методики видимо можно назвать «классическими» и они включают в себя подбор праймеров (прямого и обратного) для проведения простой ПЦР, расщепление продуктов амплификации рестриктазой и оценку полученных фрагментов в 1,5-2% агарозном геле [1, с. 308309]. При оценке известной мутации у крупного рогатого скота в гене DGAT1 замене К232А аминокислот лизин/ала-нин также используется оценка продуктов рестрикции. Так в агарозном геле неразрезанный фрагмент будет представлять собой лизин, а фрагменты соответствующие 203 и 208 п.о. аланин [3, с. 1912].
Основываясь на опыте своих исследований, а также коллег биологов и генетиков, можно сказать о возникающих трудностях при оценке фрагментов ДНК, полученных после амплификации в агарозном геле. Качество оценки напрямую зависит от большого количества факторов, в том числе от качества и концентрации геля, правильности его заливки, качества лунок, состава, концентрации буфера, правильности проведения фореза и т.д. Далее могут
возникнуть проблемы с получением снимков и гель-документации. Часто полученные результаты бывает трудно интерпретировать, возникают сомнения о точности полученных результатов, а результаты не соответствуют ожиданиям. Особенные трудности могут возникать, если исследуемые участки ДНК (мутации) имеют сходную длину и «светятся» в УФЛ на близком друг от друга расстоянии.
Все эти проблемы решаются с помощью реал-тайм ПЦР. Использование данного метода описано в литературе [2, с.4991]. Поэтому для проведения своих исследований была поставлена задача: подобрать условия, материал и метод для оценки мутации К232А с помощью реал-тайм ПЦР. Эта задача была промежуточной на этапе других глобальных задач, в том числе по генотипированию крупного рогатого скота в Ленинградской области.
Материалом служила ДНК, выделенная из крови коров ОАО ПЗ «Новоладожский» Ленинградской области. Праймеры и зонды (табл.1), матрицы (табл.2) синтезированы в ООО «Beagl» и представлены в соответствующих таблицах.
Таблица 1
Праймеры и зонды для оценки полиморфизма К232А в гене DGAT1 с помощью реал-тайм ПЦР.
Праймеры 5'-3' Зонды 5'-3' Краситель
R- CAGGTTGTCGGGGTAGCTCACG TprobeAA AAGGCCAACGGGGGAGCTGCCCAG R6G
F- G CTTG CTCGTAG CTTTGG CAGGT TprobeGC GCGGCCAACGGGGGAGCTGCC 6'FAM
Таблица 2
Синтетические матрицы, используемые для контроля при оценке К232А в гене DGAT1._
№ Матрица Последовательность 5'-3'
1 DGATlmAA GCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAAGAAGGCCAACGGGGGAGCTGCCCAGCGCACCGTGAGCTACCCCGAC AACCTG
2 DGATlmGC GCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAAGGCGGCCAACGGGGGAGCTGCCCAGCGCACCGTGAGCTACCCCGAC AACCTG
Метод проведения реал-тайм ПЦР.
1. Готовим микс праймеров и зондов. Для этого из стоковых 100 pmol/ml растворов отбираем по 10,0 мкл каждого праймера и по 5,0 мкл каждого зонда в эппендорф на 1,5-2,0 мл. Добавляем дистиллированной Н2О до 100 мкл.
2. На 1 пробирку 20,0 мкл использовались реактивы фирмы «Fermentas»: 2,0 мкл 10х буфер c Mg Cl
0,5 мкл нуклеотидов
1,0 мкл микс праймеров и зондов
0,25 мкл Taq-полимеразы
Добавляем Н2О до 19,0 мкл. 1,0 мкл (30-50 ng) геномной ДНК или ДНК-матрицы. Отдельно ставится пробирка с отрицательным контролем - это вода вместо ДНК.
1. Проводим амплификацию на термоциклере «С 1000 Termal Cycler» фирмы Bio-RAD (CFX 96) в следующем режиме:
2. 950С - 3 мин.
3. 950С - 10 сек.
4. 620С - 50 сек.
5. 720С - 50 сек.
6. GOTO 2. 39 циклов 2-4.
7. Оценка результатов реал-тайм ПЦР. При анализе полученных результатов сравниваем графики в пробах с исследуемой ДНК, матрицами и отрицательным контролем. В пробе с отрицательным контролем линия на графике должна соответствовать горизонтальной оси. Синтетические матрицы разгораются в сочетании с зондом обычно раньше, чем исследуемая ДНК. В нашем случае на 15 цикле. Цвет графиков с зондом по красителю FAM - зеленый, а по R6G синий. При наличии в одной пробе двух графиков разного цвета можно судить о выявлении гетерозиготы по двум заменам.
Список литературы
1. Komisarek J. 2004. Effects of DGAT1 variants on milk production traits in Jersey cattle./ Komisarek J., Waskowicz K., Michalak A., Dorynek Z.// Animal Science Papers and Reports, 2004. - № 3. Р. 307-313
2. Mach N. 2012. Pleiotropic effects of polymorphism of the gene diacylglycerol-O-transferase 1 (DGAT1) in the mammary gland tissue of dairy cows. /Mach N., Blum Y., Bannink A., Causeur D., Houee-Bigot M., Lagarrigue S., Smits M.// J. Dairy Sci., 2012.- № 95.P. 4989-5000.
3. Thaller G. 2003. Effekts of DGAT1 variants on milk production traits in German cattle breeds./ Thaller G., Krämer W., Winter A., Kaupe B., Erhardt G., Fries R.// J. Anim. Sci., 2003.-Aug. № 81(8). Р.1911-1918.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ КОШЕК В НОРМЕ И ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ
Осипова Юлия Сергеевна
аспирант кафедры физиологии, хирургии и акушерства, Ставропольского государственного аграрного
университета, г. Ставрополь
THE COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF CLINICAL AND MORPHOLOGICAL INDICATORS OF BLOOD OF CATS IN NORM AND AT DISEASES OF THE URINARY SYSTEM
Osipova Yulia Sergeyevna, Post-graduate Student of the chair «Physiology, Surgery and Obstetrics», Stavropol State Agrarian University, Stavropol АННОТАЦИЯ
В статье приведены результаты гематологического исследования крови кошек без патологий и с заболеваниями мочевыделительной системы. Определены особенности содержания эритроцитов, гемоглобина, ретикуло-цитов, лейкоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и тромбоцитов, а также показатели гематокрита и скорости оседания эритроцитов в крови домашних кошек с уролитиазом, хронической почечной недостаточностью и циститом.
Ключевые слова: кошки; кровь; гематологический анализ; уролитиаз; хроническая почечная недостаточность; цистит. ABSTRACT
Results of a hematologic blood test of cats without pathologies and with diseases of an urinary system are given in article. Features of the maintenance of erythrocytes, hemoglobin, reticulocytes, leukocytes, bands, neutrophils, eosinophils, monocytes and platelets, and also indicators of a hemato^it and speed of subsidence of erythrocytes in blood of do mestic cats with urolithiasis, a chronic renal failure and cystitis are defined.
Keywords: cats; blood; hematologic analysis; urolithiasis; chronic renal failure; cystitis.
Введение. Заболевания мочевыделительной системы занимают одно из ведущих мест среди патологий, регистрируемых у мелких домашних животных в ветеринарной практике [4, с. 1; 8, с. 11]. Кровь как одна из важнейших связующих систем организма, обладающая относительным постоянством своего состава и отвечающая за доставление питательных веществ и отведение метаболитов имеет большое диагностическое значение для оценки состояния работы внутренних органов [2, с. 98; 5, с. 60; 9, с. 6; 12, с. 113].
Как описано в литературе, у кошек с клиническими проявлениями мочекаменной болезни, особенно при выраженном урологическом синдроме, в крови наблюдалось снижение количества эритроцитов, гемоглобина [2, с. 100; 5, с. 62; 10, с. 9; 14, с. 10] и гематокрита [10, с. 21]. В иностранных источниках есть информация о наличии ре-тикулоцитов в крови больных кошек [15, с. 110].Также отмечалось снижение скорости оседания эритроцитов [5, с.
62], однако согласно исследованиям Ю. С. Ходовой, СОЭ в крови больных мочекаменной болезнью котов резко повышалась [14, с. 10]. Со стороны клеток белой крови был выявлен лекоцитоз [5, с. 62; 14, с. 10]. Громова О. В. сообщает о лейкоцитах на верхней границе нормы [2, с. 100]. Post K., Громова О. В., Ермолаева А. В., Барышев Д. Ю. в своих исследованиях указывали на нейтрофилию со сдвигом ядра влево [2, с. 100; 5, с. 63; 10, с. 9; 15, с. 110]. Лимфоциты являются в функциональном отношении центральным звеном иммунной системы [5, с. 63; 7, с. 284]. При мочекаменной болезни в крови отмечается относительная лимфоцитопения на фоне нейтрофилии [5, с. 63]. По другим данным наблюдался лимфоцитоз [14, с. 10]. Эозинофилы при уролитиазе как снижались [5, с. 63; 15, с. 110], так и увеличивались [2, с 100]. Регистрировалось снижение [5, с. 63; 15, с. 110] и повышение [14, с. 10] содержания моноцитов в крови.
