CC BY
30УДК 636.2.082.12:575.174.015.3
УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО АЛЛЕЛЯМ А И К DGAT1 НА ОСНОВЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Ковальчук С.Н., Архипова А.Л., Андрейченко И.Н., Косовский Г.Ю.
Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, Москва, Российская Федерация
Диацилглицерол-О-ацилтрансфераза 1 (DGAT1) является одним из ключевых ферментов биосинтеза триглицеридов. Среди известных аллельных вариантов гена dgatl крупного рогатого скота мутация GC ^ AA в позиции 10433/10434 (согласно нумерации последовательности GenBankno. AJ318490) приводит к негомологичной замене 232-го аминокислотного остатка (A ^ K). Ряд исследований показал связь аллеля К с повышенным содержанием насыщенных жиров в молоке и мясе крупного рогатого скота. В связи с этим dgatl рассматривается в качестве гена-кандидата для контроля количества и состава жира в молоке и мясе крупного рогатого скота. Цель настоящей работы - усовершенствование способа идентификации аллельных вариантов К и А гена dgatl с целью сокращения длительности процедуры геноти-пирования крупного рогатого скота. В разработанном способе используются два праймера, фланкирующие участок гена dgatl длиной 279 п.н. и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan. Идентификация аллелей А и К проводится по нарастанию флюоресценции по каналам Fam и Cy5, соответственно. Разработанный способ был валидирован ПЦР-ПДРФ-анализом на 50 образцах ДНК коров голштинизированной черно-пестрой породы. Разработанный способ на основе ПЦР в реальном времени позволяет значительно сократить время проведения анализа (до 1 часа) по сравнению с ПЦР-ПДРФ и может быть использован для быстрой и эффективной идентификации аллельных вариантов К и А DGAT1 у крупного рогатого скота.
Ключевые слова: генотипирование крупного рогатого скота, методы исследования, полиме-разная цепная реакция в реальном времени, ген диацилглицерол-О-ацилтрансферазы 1, аллель-ный полиморфизм
Проблемы биологии продуктивных животных, 2017, 4: 96-103
Введение
Диацилглицерол-О-ацилтрансфераза 1 (DGAT1, EC 2.3.1.20) - один из ключевых ферментов метаболизма триглицеридов, катализирует заключительную стадию их биосинтеза, используя в качестве субстрата 1,2-диациллицерол и ацил-СоА (Farese и др., 2000). DGAT1 играет важную роль в ряде физиологических процессов у высших эукариот, таких как регуляция концентрации триацилглицеролов в крови, формирование жировой ткани, созревание ооцитов и др. (Homa et al., 1986; Cases et al., 1998). Дефицит DGAT1 приводит к нарушению синтеза жирных кислот в жировой ткани, скелетных мышцах (Chen et al., 2002), а также в молочной железе вплоть до полного отсутствия лактации (Smith et al., 2000).
Ген, кодирующий DGAT1 у Bos taurus, расположен в центромерном участке хромосомы 14 вместе с другими генами, определяющими молочную продуктивность и качество молока и формирующими так называемый локус количественных признаков QTL (Quantitative trait loci) (Riquet, 1999; Farnir, 2002). Изучение аллельного полиморфизма гена dgat1 позволило выявить в общей сложности около двух десятков однонуклеотидных замен, большинство из которых локализованы в некодирующих участках гена и, таким образом, не влияет на структуру самого фермента (Winter et al., 2002; Grisart et al., 2002; Kong et al., 2007; Rosse et al.,
2014). Исключением является двунуклеотидная замена GC ^ AA в экзоне 8 (позиция 10433/10434 в нуклеотидной последовательности гена dgatl (GenBank No. AJ318490), которая приводит к замене аминокислотного остатка аланина на лизин в позиции 232 зрелого белка DGAT1 (A ^ K). Исследования, проведённые на разных породах крупного рогатого скота, выявили связь между наличием аллеля 232K и повышенным содержанием жира в молоке крупного рогатого скота и преобладанием насыщенных жирных кислот C16:0 и C18:0 над ненасыщенными (Grisart et al., 2002; Spelman et al., 2002; Fisher et al., 2004; Winter et al., 2002; Täbäran et al., 2015). Также имеются данные о связи аллеля К с повышенным содержанием внутримышечного жира и мраморностью говядины (Thaller et al., 2003; Kong et al., 2007; Aviles et al., 2013). Таким образом, ген dgatl признан геном-кандидатом для контроля содержания и состава жиров в молоке и мясе крупного рогатого скота. Селекция крупного рогатого скота по аллелю А может улучшить качество молока по содержанию ненасыщенных жиров, в то время как отбор животных по аллелю К может приводить к увеличению содержания насыщенных жиров в молоке и мясе.
Цель настоящей работы - усовершенствование способа идентификации аллельных вариантов К и А гена dgatl с целью сокращения длительности процедуры генотипирования крупного рогатого скота.
Материал и методы
ДНК выделяли из образцов цельной крови 50 коров черно-пестрой голштинизирован-ной породы с помощью набора реагентов «М-сорб» (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя. Для конструирования праймеров и зондов использовались программы GeneRunner, Multiple primer analyzer (https://www.thermofisher.com/).
Реакцию амплификации проводили в 10 мкл смеси ПЦР, содержащей 5 мкл реактива LightCycler® 480 ProbesMaster («Roche», Швейцария), по 0.4 мкМ прямого праймера, DGAT1-F: 5'- TGCTGGCCCTGATGGTCTACAC-3' и обратного праймера DGAT1-R:5'-GCGGTAGGTCAGGTTGTCGG-3', по 0.2 мкМ аллель-специфичных зондов DGAT1-A:5'-(FAM)-TAAGGCGGCCAACGGGGGAGCTGC(BHQ1)-3' и DGAT1-K:5'-
(Cy5)TAAGAAGGCCAACGGGGGAGCTGC(BHQ2)-3', 20 нг ДНК. ПЦР проводили с помощью прибора LightCycler 96 («Roche», Швейцария) при следующих условиях: начальная денатурация в течение 10 мин при 95°С; последующие 40 циклов амплификации в следующем режиме — денатурация при 95°С в течение 15 с, отжиг при 60°С в течение 15 с, элонгация при 72°С в течении 15 с. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и Cy5. Анализ результатов генотипирования проводили с использованием программного комплекса для амплификатора LightCycler® 96 версии SW1.1. Валидацию разработанного способа генотипирования крупного рогатого скота по аллелям К и А гена DGAT1осуществляли методом ПЦР-ПДРФ, описанном ранее (Глазко и др., 2016).
Результаты и обсуждение
В настоящее время одним из наиболее распространенных методов идентификации ал-лельных вариантов генов является ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов). Метод ПЦР-ПДРФ включает следующие этапы:
1) выделение геномной ДНК;
2) амплификация полиморфного участка гена;
3) рестрикцию полученного ампликона специфической эндонуклеазой (рестриктазой);
4) электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и анализ полученных электрофореграмм.
Существуют различные способы проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K dgatl (табл. 1). Различия касаются используемых прай-
меров для ПЦР и эндонуклеазы для рестрикции ампликона. Так, в способе, предложенном в работе (Komisarek et al., 2008), используются праймеры F: 5 -TGCCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCC-3 R: 5-ACCTGGAGCTGGGTGAGGAACAGC-3, инициирующие амплификацию фрагмента гена dgat1 длиной 378 п.н., и рестриктаза BglI. При этом получаются следующие генотип-специфичные профили — генотип AA = 254/96/28 п.н., генотип KK = 282/96 п.н., генотип AK = 282/254/96/28 п.н. В способе, предложенном в статье (Тюлькина et al., 2015) используются три праймера — DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3 ', DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' и DGAT 1 -3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3',
два из которых являются аллель-специфичными, а третий - общий для обоих аллелей гена dgat1. С помощью праймеров осуществляется амплификация участка гена длиной 100 п.н., который затем расщепляется рестриктазой с TaqI, создавая следующие профили — генотип АА = 82/18 п.н., генотип КК = 100 п.н. и АК = 100/82/18 п.н.
В методе, предложенном Kong c соавторами (Kong et al., 2007), использовались праймеры: Forward: 5'- TTCCTCAAGCTGTTCTCCTA-3' и Reverse: 5'-CACGTACCTGCTGGATCA-3' и рестриктаза EaeI. Получаемые профили генотипов: КК = 558 п.н., АА = 369/189 п.н., АК = 558/369/189 п.н.
В методе, предложенном в работе (Winter et al., 2002), используются праймеры F: 5'-GCACCATCCTCTTCCTCAAG -3' и R: 5 '-GGAAGCGCTTTCGGATG-3 ' и рестриктаза CfrI (профили генотипов —АА = 203/208 п.н., КК = 411 п.н., АК = 411/203/208 п.н).
В методе, предложенном нами ранее (Глазко и др., 2016), использовались праймеры DGAT1-dir: 5'-TGCTGGCCCTGATGGTCTACAC-3' и DGAT1-rev:5-
GAAGGAAGCAAGCGGACAGT-3' и рестриктаза AcoI. Получаемые профили генотипов — КК = 540, АА = 220/320, АК = 540/220,320.
Таблица 1. Методы ПЦР-ПДРФ анализа
Рест-
ри- Профиль генотипа (п.н.)
Праймеры ктазы Ссылка
КК АА АК
F: 5'- GCACCATCCTCTTCCTC AAG-3' CfrI 411 203/208 411/203/208. Winter et
R: 5'- GGAAGCGCTTTCGGATG-3' al., 2002
Forward: 5'-TTCCTCAAGCT EaeI 558 369/189 558/369/189 Kong et al.,
GTTCTCCTA-3' 2007
Reverse: 5'-CACGTACCTGCTGGA
TCA-3'
F: 5-TGCCGCTTGCTCGTAGCT BglI 282/96 254/96/28 282/254/96/28 Komisarek
TTGGCC-3 et al., 2008
R: 5-ACCTGGAGCTGGGTGA
GGAACAGC-3
DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGT TaqI 100 82/18 100/82/18 Тюлькин и
AGCTTTCGAAGGTAACGC-3' др., 2015
DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCG
TAGC TTTGGCAGGTAACAA- 3'
DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCG
CGGTAGGTCAGG-3'
DGAT1-dir:5'-TGCTGGCCCTGAT AcoI 540 220/320 540/220/320 Глазко и
GGTCTACAC- 3' др., 2016
DGAT1-rev: 5'-GAAGGAAGCAAG
CGGACAGT-3'
Основными недостатками метода ПЦР-ПДРФ являются: 1) длительность и трудоемкость анализа (более 6-8 ч до получения результата); 2) низкая производительность; 3) отсутствие возможности автоматизации анализа; 4) вероятность получения недостоверных результатов в случае неоптимального соотношения количества ДНК, рестриктазы и времени рестрикции. Лимитирующим фактором для применения данного метода является отсутствие рест-риктаз к необходимому полиморфному участку гена.
Эффективной альтернативой ПЦР-ПДРФ анализу является метод ПЦР в реальном времени с использованием аллель-специфичных линейных разрушаемых зондов (TaqMan). Зонд типа TaqMan представляет собой олигонуклеотид, комплементарный нужному участку ПЦР-продукта, меченный флюорофором и гасителем флюоресценции. В структуре зонда TaqMan флуорофор и гаситель сближены настолько, что флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего продукта реакции зонд гибридизуется на соответствующий ампли-кон, после чего разрушается за счет 5'-концевой активности Taq-полимеразы. Разрушение зонда приводит к отрыву флуорофора от гасителя и началу флуоресценции. Интенсивность флуоресцентного сигнала возрастает с каждым циклом ПЦР пропорционально накоплению целевого ПЦР-продукта. Дифференциация аллелей с помощью аллель-специфичных зондов TaqMan основана на эффективности их гибридизации на содержащие полиморфную позицию продукты ПЦР. И хотя различие в эффективности гибридизации зондов при однонуклеотид-ных заменах незначительна, эта небольшая разница накапливается от цикла к циклу и в итоге позволяет достоверно различать аллели (Ребриков, 2009).
Нами разработан способ идентификации аллельных вариантов А и К dgat1 на основе ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan. В ПЦР используются два праймера, общие для обоих аллелей гена dgat1, и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan (рис. 1). Праймеры DGAT1-D и DGAT1-R инициируют амплификацию участка гена dgat1 крупного рогатого скота длиной 279 п.н.
Аллель А Аллель К
Аллель А Аллель К
ТЗСТДВСССТБАТВБТСТАСАССАТС СТ С Т Т ССТСААССТСТТСТ С СТАС 96АС6Т СА ТЗСТОВСССТ ОАТ ВБТС ТАСАС С АТ С СТ С Т Т С С ТСААбСТСТ ТСТССТАССб 96АС 6Т СА прайме р БСАТ1-Г
АССТС Т ввТ ССС САЙАС С бСАСбв С Т вС ССССААСв ССААСбСТбОТСАбвССТСССТСС АССТС Т ССТ ССССАСАС С ССАССС С Т СС БСССААСС С СААСССТ СБТСАССС СТ ССС Т СС
Аллель А Аллель К
есстскесзсс АСТ ссвс т бссаст т ссс т ссс 6АСС ggcaggggctcggctcac.ccc.cga
С ССТ Б БОСС САСТ ССС С Т ИС САСТ Т ИСС Т С СС БАСС СССАБССС С Т Св СС Т САС СС С С(ЗА
ЗОНД-А:ТАлассаассААсаовзаластвс
Аллель А СССССССССТЕССССТТССТССТАвСТТТСССАССТААСССССССААСвЕСССАССТЕСС
Аллель К С ССС С С ССС Т 6С С ССТ Т ССТССТАвС Т Т Т 66САС6ТААвААС6С СААС 9АСС Т 6СС
3 О Н Д - К : ТААСЯАвСССААСОаОЗвАССТЗС
Аллель А Аллель К
САС-С С С АСС СТ 6А6С.ТАС С ССЕАСААССТ вАСС ТАСС БС
С А Г- С Г; С А С Г Г, Т С, А Г, С Т А С С ССЕАСААССТ GA.CC ТАСС БС
праймер 06АТ1-К.
I
Рис. 1. Нуклеотидные последовательности фрагмента гена dgat 1 длиной 279 п.н., кодирующих аллели А и К. Жирным шрифтом отмечены последовательности праймеров и зондов.
Идентификация аллелей А и К проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей Fam и Cy5 соответственно. Для определения генотипа животного используются конечные значения флуоресценции красителей Fam и Cy5. Анализ результатов генотипирования проводили с использованием программного комплекса для амплификатора LightCycler® 96 версии SW1.1. Программа представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (рис. 2А).
Для гомозиготных образцов по аллелю А (генотип АА) детектируется нарастание флуоресценции по каналу Fam (рис. 2Б). Для гомозиготных образцов по аллелю К (генотип КК) детектируется сигнал по каналу Cy5 (рис. 2B). Для гетерозиготного образца (генотип АК)
наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции (рис. 2Г). Таким образом, результаты ПЦР в реальном времени с детекцией флуоресценции двух красителей, Баш и Су5, позволяют однозначно определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена dgat1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, — генотип животного.
Рис. 2. А - пример диаграммы распределения аллелей А и К dgat1; Б - результат исследования гомозиготного образца по аллелю А (генотип АА); В - результат исследования гомозиготного образца по аллелю К (генотип КК); Г- кривые флуоресценции для гетерозигот АК.
Разработанный метод был апробирован на 50 образцах ДНК коров черно-пестрой гол-штинизированной породы. По результатам генотипирования 50% животных являлись гетеро-зиготами (генотип АК), 29,2% — гомозиготами по аллелю А (генотип АА) и 20,8% животных -гомозитотами по аллелю К (генотип КК). Валидацию метода проводили с помощью ПЦР-ПДРФ — анализа, описанного нами ранее (Глазко и др., 2016). Результаты обоих методов генотипирования полностью совпали. Однако разработанный нами способ генотипирования по аллелям К и А dgat1 методом ПЦР в реальном времени позволяет значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа, что выгодно отличает его от ПЦР-ПДРФ анализа.
Таким образом, нами разработан эффективный и надежный способ для экспресс-идентификации аллельных вариантов К и А гена dgat1 крупного рогатого скота методом ПЦР в реальном времени с использованием аллель-специфичных зондов, который может быть использован при селекция крупного рогатого скота для прогноза качества молока и мяса у потомства по содержанию насыщенных и ненасыщенных жиров.
ЛИТЕРАТУРА
1. Глазко В.И., Андрейченко И.Н., Ковальчук С.Н., Глазко Т.Т., Косовский Г.Ю. Гены-кандидаты контроля характеристик молочной продуктивности крупного рогатого скота // Доклады РАСХН. - 2016. - № 5. - C. 45-50.
2. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова А.М., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР в реальном времени - M.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.
3. Тюлькин С.В., Вафин Р.Р., Муратова А.В., Хатыпов И.И., Загидуллин Л.Р., Рачкова Е.Н., Ахметов Т.М., Равилов Р.Х. Разработка способа проведения ПЦР-ПДРФ на примере DGATl-гена крупного рогатого скота // Фундаментальные исследования. - 2015. - № 2. -Часть 17. - С. 3773-3775.
4. Avilés C., Polvillo O., Peña F., Juárez M., Martínez A.L., Molina A. Associations between DGAT1, FABP4, LEP, RORC, and SCD1 gene polymorphisms and fat deposition in Spanish commercial beef // J. Anim. Sci. - 2013. - Vol. 91. - No. 10. - P. 4571-4577.
5. Cases S., Smith S.J., Zheng Y.W., Myers H.M., Lear S.R., Sande E., Novak S., Collins C., Welch C.B., Lusis A.J., Erickson S.K., Farese R.V. Jr. Identification of a gene encoding an acyl CoA:diacylglycerol
acyltransferase, a key enzyme in triacylglycerol synthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. - Vol. 95. - No. 22. - P. 13018-13023.
6. Chen H.C., Smith S.J., Ladha Z. Increased insulin and leptin sensitivity in mice lacking acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase 1 // J. Clin. Invest. - 2002. - Vol. 109. - P. 1049-1055.
7. Farese Jr.R.V., Cases S., Smith S.J. Triglyceride synthesis: insights from the cloning of diacylglycerol acyltransferase // Curr. Opin. Lipidol. - 2000. -Vol. 11. - P. 229-234.
8. Farnir F.B., Grisart W., Coppieters J. et al. Simultaneous mining of linkage and linkage disequilibrium to fine map quantitative trait loci in outbred half-sib pedigrees: revisting the location of a quantitative trait locus with major effect on milk production on bovine chromosome 14 // Genetics. - 2002. - Vol. 161. - P. 275-287.
9. Fisher P.J., Spelman R.J. Verification of selective DNA pooling methodology through identification and estimation of the DGAT1 effect // Anim. Genet. - 2004. - Vol. 35. - P. 201-205.
10. Grisart B., Coppieters W., Farnir F., Karim L., Ford C., Berzi P., Cambisano N., Mni M., Reid S., Simon P., Spelman R., Georges M., Snell R. Positional candidate cloning of a QTL in dairy cattle: identification of a missense mutation in the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition // Genome Res. - 2002. - Vol. 12. - No. 2. - P. 222-231.
11. Homa S.T., Racowsky C., McGaughey R.W. Lipid analysis of immature pig oocytes // J. Reprod. Fertil. -1986. - Vol. 77. - P. 425-434.
12. Komisarek J., Michalak A. A relationship between DGAT1 K232A polymporphism and selected reproductive traits in Polish Holstein-Friesian cattle // Anim. Sci. Pap. Rep. - 2008. - Vol. 26. - No. 2. - P. 89-95.
13. Kong H.S., Oh J.D., Lee J.H., Yoon D.H., Choi Y.H., Cho B.W., Lee H.K., Jeon G.J. Association of sequence variations in DGAT 1 gene with economic traits in Hanwoo (Korea Cattle) // Asian-Aust. J. Anim. Sci. - Vol. 20. - No. 6. - P. 817-820.
14. Riquet J., Coppieters W., Cambisano N. et al. Identity by decent fine-mapping of QTL in outbred populations: Application to milk production in dairy cattle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96. - P. 9252-9257.
15. Rosse I.C., Steinberg R.S., Coimbra R.S., Peixoto M.G., Verneque R.S., Machado M.A., Fonseca C.G., Carvalho M.R. Novel SNPs and INDEL polymorphisms in the 3'UTR of DGAT1 gene: in silico analyses and a possible association // Mol. Biol. Rep. - 2014. - Vol. 41. - No. 7. - P. 4555-4563.
16. Smith S.J., Cases S., Jensen D.R., Chen H.C., Sande E., Tow B., Sanan D.A., Raber J., Eckel R.H., Farese R.V.Jr. Obesity resistance and multiple mechanisms of triglyceride // Nat. Genet. - 2000. - Vol. 25. - No. 1. - P. 87-90.
17. Spelman R.J., Ford C.A., Mcelhinney P., Gregory G.C., Snell R.G. Characterization of the DGAT1 gene in the New Zealand dairy population // J. Dairy Sci. - 2002. - Vol. 85. - P. 3514-3517.
18. Täbäran A., Balteanu V.A., Gal E., Pusta D., Mihaiu R., Dan S.D., Täbäran A.F., Mihaiu M. Influence of DGAT1 K232A polymorphism on milk fat percentage and fatty acid profiles in Romanian holstein cattle. Anim. Biotechnol. - 2015. - Vol. 26. - No. 2. - P. 105-111.
19. Thaller G., Kühn C., Winter A., Ewald G., Bellmann O., Wegner J., Zühlke H., Fries R. DGAT1, a new positional and functional candidate gene for intramuscular fat deposition in cattle // Anim. Genet. - 2003. -Vol. 34. - No. 5. - P. 354-357.
20. Winter A., Krämer W, Werner F.A, Kollers S., Kata S., Durstewitz G., Buitkamp J., Womack J.E., Thaller G., Fries R. Association of a lysine-232/alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative trait locus for milk fat content // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002. - Vol. 99. - P. 9300-9305.
REFERENCES
1. Avilés C., Polvillo O., Peña F., Juárez M., Martínez A.L., Molina A. Associations between DGAT1, FABP4, LEP, RORC, and SCD1 gene polymorphisms and fat deposition in Spanish commercial beef. J. Anim. Sci. 2013, 91(10): 4571-4577.
2. Cases S., Smith S.J., Zheng Y.W., Myers H.M., Lear S.R., Sande E., Novak S., Collins C., Welch C.B., Lusis A.J., Erickson S.K., Farese R.V. Jr. Identification of a gene encoding an acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, a key enzyme in triacylglycerol synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95(22): 13018-13023.
3. Chen H.C., Smith S.J., Ladha Z. Increased insulin and leptin sensitivity in mice lacking acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase 1. J. Clin. Invest. 2002, 109: 1049-1055.
4. Farese Jr. R.V., Cases S., Smith S.J. Triglyceride synthesis: insights from the cloning of diacylglycerol acyltransferase . Curr. Opin. Lipidol. 2000, 11: 229-234.
5. Farnir F.B., Grisart W., Coppieters J. et al. Simultaneous mining of linkage and linkage disequilibrium to fine map quantitative trait loci in outbred half-sib pedigrees: revisting the location of a quantitative trait locus with major effect on milk production on bovine chromosome 14. Genetics. 2002, 161: 275-287.
6. Fisher P.J., Spelman R.J. Verification of selective DNA pooling methodology through identification and estimation of the DGAT1 effect. Anim. Genet. 2004, 35: 201-205.
7. Glazko V.I., Andreichenko I.N., Koval'chuk S.N., Glazko T.T., Kosovskii G.Yu. [Candidate genes co n-trolling the characteristics of dairy cattle productivity]. Doklady Rossiiskoi Academii Sel'skokhozyaistvennykh Nauk - Russian Agricultural Sciences. 2016, 5: 45-50.
8. Grisart B., Coppieters W., Farnir F., Karim L., Ford C., Berzi P., Cambisano N., Mni M., Reid S., Simon P., Spelman R., Georges M., Snell R. Positional candidate cloning of a QTL in dairy cattle: identification of a missense mutation in the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition. Genome Res. 2002, 12(2): P. 222-231.
9. Homa S.T., Racowsky C., McGaughey R.W. Lipid analysis of immature pig oocytes. J. Reprod. Fertil. 1986, 77: 425-434.
10. Komisarek J., Michalak A. A relationship between DGAT1 K232A polymporphism and selected reproductive traits in Polish Holstein-Friesian cattle. Anim. Sci. Pap. Rep. 2008, 26(2): 89-95.
11. Kong H.S., Oh J.D., Lee J.H., Yoon D.H., Choi Y.H., Cho B.W., Lee H.K., Jeon G.J. Association of sequence variations in DGAT 1 gene with economic traits in Hanwoo (Korea Cattle). Asian-Aust. J. Anim. Sci. 20(6): 817-820.
12. Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu., Semenov P.A., Savilova A.M., Kofiadi I.A., Abramov D.D. PTsR v real'nom vremeni. (Real-time PCR). Moscow: Binom. Laboratoriya znanii Publ., 2009, 223 p. (In Russian).
13. Riquet J., Coppieters W., Cambisano N. et al. Identity by decent fine-mapping of QTL in outbred populations: Application to milk production in dairy cattle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96: 9252-9257.
14. Rosse I.C., Steinberg R.S., Coimbra R.S., Peixoto M.G., Verneque R.S., Machado M.A., Fonseca C.G., Carvalho M.R. Novel SNPs and INDEL polymorphisms in the 3'UTR of DGAT1 gene: in silico analyses and a possible association. Mol. Biol. Rep. 2014, 41(7): 4555-4563.
15. Smith S.J., Cases S., Jensen D.R., Chen H.C., Sande E., Tow B., Sanan D.A., Raber J., Eckel R.H., Farese R.V.Jr. Obesity resistance and multiple mechanisms of triglyceride. Nat. Genet. 2000, 25(1): 87-90.
16. Spelman R.J., Ford C.A., Mcelhinney P., Gregory G.C., Snell R.G. Characterization of the DGAT1 gene in the New Zealand dairy population. J. Dairy Sci. 2002, 85: 3514-3517.
17. Täbäran A., Balteanu V.A., Gal E., Pusta D., Mihaiu R., Dan S.D., Täbäran A.F., Mihaiu M. Influence of DGAT1 K232A polymorphism on milk fat percentage and fatty acid profiles in Romanian Holstein cattle. Anim. Biotechnol. 2015, 26(2): 105-111.
18. Thaller G., Kühn C., Winter A., Ewald G., Bellmann O., Wegner J., Zühlke H., Fries R. DGAT1, a new positional and functional candidate gene for intramuscular fat deposition in cattle. Anim. Genet. 2003, 34(5): 354-357.
19. Tyul'kin S.V., Vafin R.R., Muratova A.V., Khatypov I.I., Zagidullin L.R., Rachkova E.N., Akhmetov T.M., Ravilov R.Kh. [Development of a method for conducting PCR-RFLP on the example of DGAT1-gene of cattle]. Fundamentalnye issledovaniya - Basic Research. 2015, 2-17: 3773-3775 (In Russian).
20. Winter A., Krämer W, Werner F.A, Kollers S., Kata S., Durstewitz G., Buitkamp J., Womack J.E., Thaller G., Fries R. Association of a lysine-232/alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative trait locus for milk fat content. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99: 9300-9305.
Improved method of genotyping cattle by alleles A and K DGAT1 on the basis of real time-PCR
Kovalchuk S.N., Arkhipova A.L., Andreichenko I.N., Kosovsky G.Yu.
Center of Experimental Embryology and Reproductive Biotechnologies, 127422, Moscow, Russian Federation
ABSTRACT. Acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase 1(DGAT1) is a key enzyme in tri-acylglycerol synthesis. Among known allelic variants of bovine dgat1 gene, the non-synonymous mutation GC ^ AA at positions 10433/10434 (according to GenBank no. AJ318490 sequence) results in the nonhomologous substitution of amino acid residue 232 (A ^ K). Numerous studies showed a strong association of the DGAT1 K232 allele with increasing saturated fat content in milk and beef. Therefore, dgatl was considered as a candidate gene for control of milk and beef fat contents and composition. The aim of this work was to improve the method for identification of K and A allelic variants of dgat1 gene by shortening the duration of the procedure for genotyping cattle. In the developed method, two primers flanking 279-bp fragment of dgat1 gene and two allele-specific TagMan probes were used. Identification of A and K alleles was performed on basis of increasing Fam and Cy5 fluorescence, respectively. The developed method was validated with PCR- RFLP analysis of 50 DNA samples from holsteinized Black-and-White cows. The developed real-time PCR-base method requires less time (up to 1 hour) in comparison with PCR-RFLP analysis and could be used for rapid and effective identification of K and A allelic variants of DGAT1 in cattle.
Keywords: genotyping of cattle, research methods, real-time polymerase chain reaction, diacylglycerol-O-acyltransferase gene 1, allelic polymorphism
Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2017, 4: 96-103
Поступило в редакцию: 23.07.2017 Получено после доработки: 05.09.2017
Ковальчук Светлана Николаевна, к.б.н., зав. отд., тел. 89169269037, s.n.kovalchuk@mail.ru Архипова Анна Львовна, м.н.с., тел. 84956102131, kamfora3@gmail.com Андрейченко Ирина Николаевна, н.с, тел. 89268165083, nikolavna.88@mail.ru Косовский Глеб Юрьевич, д.б.н., дир., тел. 84956102131, gkosovsky@mail.ru
