ПОДБОР ЭТАЛОННЫХ ГЕНОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У ГЕН-НОКАУТНЫХ СОРТОВ ХЛОПЧАТНИКА ПРИ ЗАСОЛЕНИИ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

- ребенок должен чувствовать поддержку, участие и понимание со стороны взрослых;

- если у родителей самих есть такие привычки, то от них следует оказаться;

- так же важно поощрять положительные успехи ребенка, а не упускать их, акцентируя внимание на плохие оценки, поведение и т.д.

Выводы:

Вредные привычки подростков не редко являются последствием проблем в семье в школе, личной жизни или неверно выбранной компании.

Увлечение интернетом невозможно искоренить полностью ввиду века технологий.

Результат в борьбе за здоровый образ жизни будет иметь положительный результат, если вовремя заметить увлечение ребёнка, поговорить в дружеской атмосфере, разобраться в причинах появления увлечений.

Список литературы

1. Решетова Т.А., Вредные привычки нового времени» - студент, отделение лингвистики. Институт филологии, журналистики и межкультурной

коммуникации Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону. «Открытая наука» 2016.

2. Иванова О.И., Сделан шаг к созданию эффективного метода отказа от курения. №53 Naked Science, сетевое издание. Свидетельство о регистрации СМИ Эл № ФС77-70708 от 15.08.2017.

3. Земскова А.А, Калмыкова Н.А, Дубоносов И.А, Вредные привычки» ФГБОУВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России 2017, том 7, номер 1/ https://eli-brary.ru/item.asp?id=25861852

4. Червоненко Д.В, Шелудько А.Н, Ермолаева Е.В, Вредные привычки. ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России. Том 6, номер 1, 2017 https://eli-brary.ru/item.asp?id=25861852

5. Мартыненко Н.В. Сайт медицинской организации Областное государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Губкинская центральная районная больница". 20.06.2019 Врач-терапевт Центра здоровья

ПОДБОР ЭТАЛОННЫХ ГЕНОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У ГЕН-НОКАУТНЫХ

СОРТОВ ХЛОПЧАТНИКА ПРИ ЗАСОЛЕНИИ

Камбурова В. С.

Заведующий лабораторией Центра геномики и биоинформатики Академии наук Республики Узбекистан Кандидат биологических наук Шерматов Ш.Э. Заведующий лабораторией Центра геномики и биоинформатики Академии наук Республики Узбекистан Кандидат биологических наук Салахутдинов И.Б. Заведующий лабораторией Центра геномики и биоинформатики Академии наук Республики Узбекистан Кандидат биологических наук Латыпова Э.А.

Доцент кафедры «Биология, биологические технологии и ветеринарно-санитарная экспертиза» Пензенского государственного аграрного университета

Маматкулова Г.Ф. Младший научный сотрудник Центра геномики и биоинформатики Академии наук Республики Узбекистан Маматкулова Ш.Х. Стажер-исследователь Центра геномики и биоинформатики Академии наук Республики Узбекистан Давлатбоева Ш.А.

Лаборант

Центра геномики и биоинформатики Академии наук Республики Узбекистан

SELECTION OF REFERENCE GENES FOR EVALUATION OF GENE EXPRESSION IN GENEKNOCKOUT COTTON VARIETIES UNDER SALINITY

Kamburova V.

Center of genomics and bioinformatics of the Academy of Sciences of Uzbekistan Head oh Laboratory, PhD in biology Shermatov Sh.

Center of genomics and bioinformatics of the Academy of Sciences of Uzbekistan Head of Laboratory, PhD in biology Salakhutdinov I. Center of genomics and bioinformatics of the Academy of Sciences of Uzbekistan Head of Laboratory, PhD in biology Latypova E.

Associate Professor of the Department of Biology, Biological Technologies and veterinary and sanitary examination Penza State Agrarian University

Mamatkulova G.

Junior Researcher Center of genomics and bioinformatics of the Academy of Sciences of Uzbekistan Mamatkulova Sh. Research Assistant Center of genomics and bioinformatics of the Academy of Sciences of Uzbekistan Davlatboeva Sh. Laboratory assistant Center of genomics and bioinformatics of the Academy of Sciences of Uzbekistan

Аннотация

Выбор эталонных генов имеет решающее значение для нормализации уровня экспрессии генов целевых генов. Хороший эталонный ген может уменьшить вариации, вызванные разным количеством исходных материалов и разной эффективностью выделения РНК и обратной транскрипции. В качестве референс генов часто используются гены домашнего хозяйства из-за их конститутивной экспрессии. Однако ряд исследований показал, что ни один ген домашнего хозяйства не может использоваться для всех экспериментов, потому что не все гены домашнего хозяйства сохраняют постоянный уровень экспрессии у разных сортов или стрессовых условиях. В этом исследовании мы выбрали 10 генов домашнего хозяйства, чтобы оценить уровни их экспрессии в двух разных тканях (листьях и корнях) в условиях засоления.

Abstract

The selection of reference genes is critical to normalizing the level of gene expression of the target genes. A good reference gene can reduce the variation caused by different amounts of starting material and different efficiencies for RNA isolation and reverse transcription. Household genes are often used as reference genes because of their constitutive expression. However, a number of studies have shown that no single housekeeping gene can be used for all experiments, because not all housekeeping genes maintain a constant level of expression in different varieties or stressful conditions. In this study, we selected 10 housekeeping genes to assess their expression levels in two different tissues (leaves and roots) under saline conditions.

Ключевые слова: хлопчатник, устойчивость, экспрессия генов, референсные гены.

Keywords: cotton plant, resistance, gene expression, reference genes.

Введение. Анализ экспрессии генов становится все более популярным и важным во многих областях биологии. В связи с этим, выбор эталонных генов имеет большое значение для нормализации уровня экспрессии генов целевых генов. Хороший эталонный ген может уменьшить вариации, вызванные разным количеством исходных материалов и разной эффективностью выделения РНК и обратной транскрипции (Wang et al. 2013; Kumar,

Chordia 2015; Smitha et al. 2019). Контрольные гены использовались для выбора из генов домашнего хозяйства из-за их конститутивной экспрессии, однако недавние исследования показали, что ни один ген домашнего хозяйства не может использоваться для всех экспериментов, потому что не все гены домашнего хозяйства сохраняют постоянный уровень экспрессии в разных тканях и на разных стадиях развития при разных стрессовых условиях (Wang et

al. 2013; Yu et al. 2019; Smitha et al. 2019).

По сравнению с другими технологиями, такими как микроматрица и нозерн-блоттинг, количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) является более мощным методом для оценки экспрессии генов целевых генов. Он обладает высокой чувствительностью, специфичностью и широким диапазоном обнаружения до семи порядков увеличения (Park et al., 2008). Таким образом, qRT-PCR стала лучшим методом проверки того, являются ли выбранные гены домашнего хозяйства подходящими эталонными генами. На растениях было проведено множество исследований для изучения оптимальных референсных генов в разных тканях и на разных стадиях развития (Wang et al., 2013; Cao et al. 2019; Pu et al. 2020). Однако меньше исследований было посвящено оценке генов домашнего хозяйства при различных видах лечения или стрессовых условиях. Большинство исследований, которые выявляли эталонные гены в условиях абиотического стресса, проводились только при максимальной степени воздействия стрессового фактора (Wang et al., 2013). Учитывая дозозависимый характер экспрессии генов в стрессовых условиях, такой подход может давать ложные результаты из-за нестабильной экспрессии референсных генов в различных стрессовых условиях.

Хлопчатник является одной из важнейших экономических культур во многих странах, включая Узбекистан. Анализ экспрессии генов хлопчатника может привести к лучшему пониманию развития волокон и биосинтеза масла. Однако исследований по идентификации эталонных генов при абиотическом стрессе не проводилось.

В связи с этим, мы выбрали 10 генов домашнего хозяйства, чтобы оценить уровни их экспрессии в двух разных тканях (листьях и корнях) в условиях засоления.

Материалы и методы.

Объект исследования и дизайн эксперимента.

Объектом исследования служили ген-нокаут-ные сорта и линии хлопчатника Gossypium hirsutum L. Эксперименты проводили на растениях, выращенных в условиях фитотрона.

В лабораторных условиях растения выращивали в стандартных условиях фитотрона. Предварительно обработанные и стерилизованные семена хлопчатника Gossypium hirsutum L. были посажены в стерильную питательную среду. Семена инкубировали в условиях темноты и при температуре 280 С в течение трех дней. Через три дня чашки Петри с проросшими семенами переводили в фотопериодичные условия свет/темнота с продолжительно-

стью 16/8 часов, соответственно. При этом мощность света равнялась 5000 люкс. После появления 3-4 настоящих листочков растения переводили в почву. Все растения подвергались генетической верификации для подтверждения наличия RNAi конструкции.

Выделение тотальной РНК и синтез кДНК.

Тотальную РНК выделяли из листьев трех независимых растений каждого варианта с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя и элюировали водой, свободной от нуклеаз. Чистота РНК была проверена присутствием и интенсивностью рибосомальной РНК в 1% агарозном геле, содержащим 2,2 М формальдегида в присутствии бромистого этидия. Для очищения образцов от примесей ДНК образцы РНК были обработаны набором Turbo DNase kit (Ambion, США), не содержащим РНКазу, согласно инструкции производителя и были очищены дополнительным этапом очистки с помощью фенол-хлороформа (5:1; Ambion) и преципитации этанолом. Концентрация общей РНК измерялась на спектрофотометре (GENESYS 10UV, Thermo Scientific, USA).

Для анализа целевых генов с помощью обратной транскрипции (RT-PCR), комплементарная ДНК (кДНК) была синтезирована из общей РНК образцов хлопчатника с помощью обратной тран-скриптазы с использованием набора для синтеза кДНК SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Thermo Fisher, США) в соответствии с инструкциями производителя.

Выбор генов домашнего хозяйства и дизайн праймеров. Мы выбрали 10 генов домашнего хозяйства, которые обычно используются в качестве эталонных генов у хлопчатника или других видов. Это eIF5 (фактор инициации эукариотической трансляции 5), His3 (гистон H3), ACT14 (актин 14), UBQ7 (белок удлинения убиквитина 7), UBI1 (семейство генов убиквитина), CYP1 (циклофилин 1), GAPDH (глицеральдегид-3- субъединица фосфат-дегидрогеназы C), TUA10 (альфа-тубулин 10), PP2A (каталитическая субъединица протеинфосфа-тазы 2A) и EF1A8 (фактор элонгации трансляции 1A-8).

Все праймеры были разработаны с использованием специального программного обеспечения Primer3web version 4.0.0 (http://primer3.ut.ee/) и Vector NTI Advance 11. Валидация полученных праймерных пар проводилась с использованием Primer Blast

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Список генов и последовательности праймеров приведены в Таблице 1.

Таблица 1.

Праймеры, использованные для количественного RT-PCR._

№ Название праймера Праймерная последовательность (5'-3) Кодируемый белок

1. Gh UBQ7 F GAAGGCATTCCACCTGACCAAC UBI (белок удлинения убиквитина 7)

2. Gh UBQ7 R CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG

3. Gh eIF5 F CGGTTGCCATTGTGCAAGGAGG eIF5 (фактор инициации эукариотической трансляции 5)

4. Gh eIF5 R TCTTGATCAGAACCGTAGGTGAGCG

5. Gh His3 F ACACCAACCTTTGCGCGATCCA His3 (гистон H3)

6. Gh eIF5 R CTAAGCGACTGATCCACACTTCTGG

7. Gh ACT14 F CTGGAGACTGCCAAGAGCAGCT ACT14 (актин 14)

8. Gh ACT14 R CCGGGCAACGGAATCTCTCAGC

9. Gh UBI1 F GGAAGACGGAAGGACTTTGCCTG UBI1 (семейство генов убиквитина)

10 Gh UBH R ACCTTAAGGCTTAGAACCCACCACG

11 Gh CYP1 F CACCATGGCCTCAAATCCCAAGGT CYP1 (циклофилин 1)

12 Gh CYP1 R CTCCGCAGTGCGAGGAGTGC

13 Gh GAPDH F TGATGCCAAGGCTGGAATTGCTT GAPDH (глицеральдегид-3- субъединица фосфатдегидрогеназы C)

14 Gh GAPDH R GTGTCGGATCAAGTCGATAACACGG

15 Gh TUA10 F CACGTGAAGATCTCGCTGCCCT TUA10 (альфа-тубулин 10)

16 Gh TUA10 R ACGGTACATCCCTCAATACTCCTCC

17 Gh PP2A F GATCCTTGTGGAGGAGTGGA PP2A (каталитическая субъединица проте-инфосфатазы 2A)

18 Gh PP2A R GCGAAACAGTTCGACGAGAT

19 Gh EF1A8 F TGAGACAGACTGTTGCTGTTGGTG EF1A8 (фактор элонгации трансляции 1A-8)

20 Gh EF1A8 R ACCAAAGTTCACTTGCCACCCTTC

Проведение количественного RT-ПЦР. Реакция одношаговой обратной транскрипции (RT-PCR) была проведена с использованием набора LightCycler® 480 RNA Master Hydrolysis Probes согласно инструкции производителя (Roche). Для определения экспрессии гена использован метод количественной ПЦР с обратной транскрипцией с использованием определения ампликонов на основе SYBR Green и набора LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche). Количественный ПЦР с обратной транскрипцией был проведен на приборе LightCycler480 Instrument II со следующим циклическим профилем: 95° С в течение 5 мин, затем 45 циклов: 10 с при 95° С, 15 с при 60° С и 15 с при 72° С. Каждая реакционная смесь qRT-PCR содержала 10 мкл SYBR Green I Master (Roche, Швейцария), 1 мкл прямого праймера (10 мкМ), 1 мкл обратного праймера (10 мкМ), 2 мкл кДНК (4-кратное разбавление) и 6 мкл ddH2O. Транскрипт гена убиквитина 7 хлопчатника (Gh_UBQ7) использовали для нормализации уровней экспрессии продуктов QT-ПЦР. Все реакции были выполнены с тремя техническими повторностями. Метод 2-AACt был использован для расчета относительной экспрессии дифференциально экспрессированных генов (Livak, Schmittgen 2001).

Анализ данных qRT-PCR. Анализ данных qRT-PCR проводился с использованием четырех широко используемых методов: geNorm, NormFinder, BestKeeper и сравнительный метод ACT (Xie et al. 2012; Wang et al. 2013). Данные qRT-PCR разделяли на два группы в соответствии с типами стресса и различными источниками (листья и корни). Также оценивали уровни экспрессии десяти возможных референсных генов при нормальных условиях роста (в качестве контроля). Все эти че-

тыре метода были реализованы в онлайн-инстру-менте для оценки экспрессии референсных генов RefFinder (https://www.heartcure.com.au/reffinder/). Помимо представления результатов для каждого метода, этот онлайн-инструмент также интегрировал все результаты для генерации общего ранжирования оптимальных эталонных генов с использованием собственного разработанного алгоритма, который ранжирует кандидатные эталонные гены путем вычисления среднего геометрического, номера ранжирования каждым алгоритмом для каждого гена.

Статистический анализ данных. Все данные были подвергнуты дисперсионному анализу (ANOVA) с использованием пакета программ OriginPш 7.0. Данные представлены как средняя ± стандартная ошибка из 3 биологических и 3 технических повторов. Значимость различий между средними значениями определяли с помощью теста Туки. Различия в Р < 0,05 считались значимыми.

Результаты. Перед проведением qRT-PCR была протестирована эффективность всех прайме-ров. Все значения эффективности праймеров приемлемы и составляют около 85-100%. Мы оценили уровни экспрессии 10 кандидатов референсных генов в листьях и корнях в различных условиях засоления с помощью значений порога цикла ПЦР (О:) в реальном времени.

Полученные результаты показали, что средние значения С: всех 10 возможных референсных генов в этом исследовании варьируются от 23,5 до 31,5. Шесть возможных эталонных генов (ACT14, UBQ7, тп, CYP1, TUA10 и EF1A8) показали медианное значение С: около 25. His3 и GAPDH показали наименьшее медианное значение С: около 23,5; eiF5 показал наибольшее медианное значение С:, равное 31,5. Каждый из 10 эталонных генов также

имел широкий диапазон уровней экспрессии, независимо от индивидуального или общего уровня. На индивидуальном уровне интерквартильные раз-махи (IQR) межгрупповой разницы О: варьировались в пределах 2,18-3,83, при медиане 2,42 (данные не показаны). На общем уровне IQR С: варьировал в пределах 2,48-6,22; стандартное отклонение для С: - в пределах 2,00-3,76 (данные не показаны). UBQ7 показал самый узкий диапазон разнообразия уровня экспрессии с IQR, равным 2,48, за ним следуют EF1A8, GAPDH и TUA10 с равным 2,52, 2,56 и 2,66 соответственно. UBQ7 также представляет самое низкое стандартное отклонение Ох, равное 1,96, за ним следуют TUA10 (1,97), EF1A8 (2,00) и GAPDH (2,07), соответственно.

Также были оценены уровни экспрессии 10 возможных референсных генов в каждой ткани при засолении. Средние значения всех медианных значений С: для 10 эталонных генов составляли 24, 25, 27 и 27 для листьев и корней при солевом стрессе. В этих условиях His3, ШП, EF1A8, GAPDH и UBQ7 показали меньшее разнообразие, чем другие гены домашнего хозяйства в листьях; TUA10, UBQ7, GAPDH и EF1A8 являются более подходящими референс-генами в корнях (данные не показаны).

Далее с целью определения стабильности возможных референсных генов в условиях солевого стресса мы интегрировали и оценили все данные экспрессии в листьях и корнях в условиях солевого стресса с помощью четырех алгоритмов нормализации. Что касается стабильности десяти референс-ных генов в листьях при солевом стрессе, ACT14 и

EF1A8 были признаны двумя лучшими референс-ными генами алгоритмами ACT и NormFinder, а His3 и UBI1 были признаны лучшими двумя рефе-ренсными генами по данным BestKeeper и geNorm (табл. 2). В общем рейтинге ACT14, UBQ7 и EF1A8 были выбраны как лучшие референтные гены в листьях при солевом стрессе. В корнях TUA10 занимает первое место среди лучших референсных генов в списке наиболее стабильных референсных генов по данным BestKeeper и geNorm, в то время как His3, UBQ7 и CYP1 оценивают лучшие референс-ные гены по ACT и NormFinder соответственно (табл. 3). Общий рейтинг показал, что TUA10 и UBQ7 были хорошими эталонными генами в корнях при солевом стрессе.

На следующем этапе с целью исследования влияния степени выраженности солевого стресса на экспрессию возможных референсных генов были созданы данные о специфической экспрессии кан-дидатных генов при различных концентрациях соли. В листьях в условиях солевого стресса EF1A8 считался наиболее стабильным эталоном при низкой и средней концентрации соли, в то время как ACT14 считался наиболее надежным эталоном при высокой концентрации соли (0,5%) в общем рейтинге (табл. 4). В аналогичных условиях в корнях лучшим эталоном при всех трех различных концентрациях соли был признан TUA10, за ним следует EF1A8 при низкой и средней концентрации солевого стресса и UBQ7 при высокой концентрации соли.

Таблица 2

Стабильность экспрессии возможных референсных генов в листьях при солевом стрессе

Метод

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ACT

BestKeeper NormFinder geNorm Общий рейтинг

GhACT14 GhEF1A8 GhUBQ7 0.67 0.68 0.84 GhHis3 GhUBI1 GhUBQ7 1.19 1.02 0.93 1.2 GhACT14 GhEF1A8 GhGAPDH GhUBQ7 0.263 0.349 0.43 0.72 GhHis3 | GhUBI1 GhUBQ7 GhEF1A8 0.387 0.293 0.293 0.411 GhACT14 GhHis3 GhEF1A8 GhUBI1 2.45 3.22 2.83 3.15

GhGAPDH GhTUA10 GhPP2A GhUBI1

0.7 0.74 0.81 0.81

GhEF1A8 GhGAPDH GhACT14 GhPP2A

1.31 1.53 1.57

GhTUA10 GhPP2A GhUBI1

0.433 0.574 0.676

GhGAPDH GhACT14 GhTUA10 GhPP2A

0.427 0.538 0.597 0.652 GhUBQ7 GhGAPDH GhTUA 10 GhPP2A

2.83 4.16 6.12 6.7

GhHis3 GhCYP1GheIF5 0.7 1.02 1.09 GhTUA10 GheIF5 GhCYP1

1.63

GhHis3

0.43

1.85 1.96 GhCYP1GheIF5 0.872 0.974 GhCYP1GheIF5 0.736 0.806 GhCYP1GheIF5 9.24 9.74

Каждый эталонный кандидатный ген оценивался в соответствии с их оценками по каждому методу. Значения баллов, оцененные четырьмя методами, показаны серым цветом. Значения баллов

представляли стандартное отклонение в методе ACT и BestKeeper, значения стабильности в NormFinder, коэффициент нормализации экспрессии генов (значение M) в geNorm.

Таблица 3

Стабильность экспрессии возможных референсных генов в корнях при солевом стрессе

Метод

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ACT

BestKeeper NormFinder geNorm

Общий рейтинг

GhUBQ7 GhCYP1 GhEF1A8 GhTUA10 GhUBI1

1.24 1.34 1.35 1.35 1.37

GhTUA10 GhGAPDH GhUBQ7 GhEF1A8 GhCYPI

0.84 1.11 1.14 1.25 1.41

GhCYP1 GhEF1A8 GhUBQ7 GhTUA10 GhUBI1 0.483 0.643 0.759 0.95 1.025 GhGAPDH | GhTUA10 GhUBQ7 GhUBI1 GhHis3 0.377 0.377 0.46 0.583 0.623 GhTUA10 GhUBQ7 GhCYP1 GhGAPDH GhEF1A8 GhUBI1 2 2.28 2.89 3.15 3.46 4.95

GhHis3 GhGAPDH GhPP2A GhACT14 GheIF5 1.48 1.48 1.66 1.73 2.32 GhUBI1 GhHis3 GhPP2A GhACT14 GheIF5 1.5 1.61 1.69 1.69 2.13 GhHis3 GhGAPDH GhPP2A GhACT14 GheIF5 1.207 1.255 1.322 1.417 2.231 GhEF1A8 GhCYP1 GhPP2A GhACT 14 GheIF5 0.778 0.949 1.198 1.335 1.533 GhHis3 GhPP2A GhACT14 GheIF5 5.96 8 9 10

Дозозависимая стабильность возможных референсных генов в листьях и корнях

Таблица 4

Ткань Стресс

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ЛистьяШа 50 мМ GhEF1A8 GhUBIl GhUBQ7 GhTUA10 GhHis3 2 2.45 3.71

100

GhGAPDHGhACT14GhCYP 1 GhPP2A GheIF5 4.4 4.41 7.97 8.49 10

NaCl мМ

200

GhEF1A8 GhUBI1 GhHis3 2.83 2.91 3.87

1

GhACT14GhUBQ7 GheIF5

2.21 5.18 3.5 Корни NaCl 50 мМ GhTUA 10GhEF 1A8GhGAPDHGhUBQ7 GhCYP 1 GhUBI 1 1.57 2.63 2.78 2.78 3.44 6.19

100

NaCl мМ

3.6 3.56

GhGAPDHGhTUA10GhUBQ7 GhACT14GhPP2A GheIF5 GhCYP1 3.16 3.6 3.15 4.41 6.93 8.74 10 GhPP2A GhEF1A8 GhGAPDHGhUBI 1 GhHis3 GhTUA 10GhCYP 1 3.66 3.94 4.41

NaCl мМ

NaCl мМ

200

GhTUA 10GhEF 1A8GhUBQ7 GhGAPDHGhCYP 1 GhUBI 1 2 2.21 2.45 3.48 4.14 5

GhTUA 10GhUBQ7 GhCYP1 GhGAPDHGhEF 1A8 GhHis3

1.5

3.31

3.87

3.98

4.16

4.24

5.12 2.83 8.49 9.74 GhACT14GhHis3 GhPP2A GheIF5

6.7 7.9 8.49 10

GhHis3 GhPP2A GhACT14 GheIF5

5.42 8 9 10

GhUBI1 GhPP2A GhACT14 GheIF5

4.6 6.05 8.13 10

Обсуждение результатов. Все более очевидно, что выбор подходящего эталонного гена чрезвычайно важен для анализа экспрессии генов. Хороший эталонный ген должен иметь низкую вариацию уровня экспрессии в разных тканях при разной степени интенсивности воздействия стресса (Wang et al. 2013; Kumar, Chordia 2015; Smitha et al. 2019). Обычно в качестве эталонных генов используются гены «домашнего хозяйства». Однако ряд исследований показал, что ни один ген домашнего хозяйства не может использоваться для всех экспериментов, потому что не все гены домашнего хозяйства сохраняют постоянный уровень экспрессии у разных сортов или стрессовых условиях (Wang et al. 2013; Yu et al. 2019; Smitha et al. 2019).

Так, в нашей работе было показано, что IQR межгрупповых различий Ct варьировались от 2,18 до 3,83 для 10 обычно используемых генов домашнего хозяйства, что указывает на то, что уровни экспрессии колебались в 4,5-14,2 раза среди отдельных растений. Учитывая большую разницу в экспрессии генов между людьми, понятно, что общий уровень экспрессии генов также показал большую разницу при разных обработках для каждого обнаруженного гена домашнего хозяйства. Эта дисперсия существенно повлияет на анализ экспрессии целевых генов. Таким образом, определение надежного эталонного гена будет иметь решающее значение для анализа экспрессии гена. В последние годы в этой области было проведено множество исследований для оценки и определения надежных эталонных генов для различных видов растений и различных типов стрессов (Wang et al., 2013; Cao et al. 2019; Pu et al. 2020). Эти исследования, включая нашу работу, позволили продемонстрировать, что разные гены домашнего хозяйства могут работать по-разному в разных условиях. Так, наши результаты показывают, что UBQ7, GAPDH, EF1A8 представлены как лучшие эталонные гены в листьях, а TUA10, UBQ7, CYP1, GAPDHи EF1A8 лучше в корнях при солевом стрессе. Кроме того, следует отметить, что ранее было показано, что ген UBQ7 является наиболее стабильным геном в различных тканях и на разных стадиях развития (Alves-Ferreira et al., 2010).

Таким образом, анализ полученных данных показал, что определение надежного эталонного

гена будет иметь решающее значение для анализа экспрессии гена. Наши результаты показывают, что для ген-нокаутного сорта хлопчатника Порлок-4 при солевом стрессе лучшими референс генами в листьях были UBQ7, GAPDH, EF1A8, а в корнях -TUA10, UBQ7, CYP1, GAPDH и EF1A8. Было показано, что UBQ7 является наиболее стабильным геном в различных тканях и при выраженности солевого стресса, что хорошо согласуется с литературными данными (Wang et al. 2013). В связи с этим, для дальнейших исследований в качестве референс генов был использован ген UBQ7.

References

1. Cao A., et al. 2019. Screening the Reference Genes for Quantitative Gene Expression by RT-qPCR During SE Initial Dedifferentiation in Four Gossypium hirsutum Cultivars that Have Different SE Capability. Genes. 10: 497

2. Kumar A., Chordia N. 2015. In Silico PCR Primer Designing and Validation. In: PCR Primer Design, Methods in Molecular Biology (ed. Basu Ch.) Springer Science+Business Media New York:USA. p. 143-151.

3. Park C.M., et al. 2008. Exploring valid reference genes for gene expression studies in Brachypodium dis-tachyon by real-time PCR. BMC Plant Biol. 8: 112.

4. Pu Q., et al. 2020. Selection and Validation of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR in White Clover (Trifolium repens L.) Involved in Five Abiotic Stresses. Plants. 9: 996

5. Smitha P.K., et al. 2019. Genome wide search to identify reference genes candidates for gene expression analysis in Gossypium hirsutum. BMC Plant Biology 19:405

6. Wang M., et al. 2013. Evaluation and selection of reliable reference genes for gene expression under abiotic stress in cotton (Gossypium hirsutum L.). Gene:44-50

7. Xie F., et al. 2012. miRDeepFinder: a miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small RNAs. Plant molecular biology 80 (1): 75-84.

8. Yu Y., et al. 2019. Selection of Reference Genes for qPCR Analyses of Gene expression in Ramie Leaves and Roots across eleven Abiotic/Biotic treatments. Scientific Reports. 9:20004