CC BY
216
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.276.2/.4.015.44
А.Н. Шувалов1, Т.М. Соколова2, И.М. Шаповал1, Ф.И. Ершов1
МОДУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ГЕНОВ ПРЕПАРАТОМ ИММУНОМАКС:
активация генов интерферонов и интерлейкинов
1ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, 123098, г Москва; 2ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, 123098, г Москва
Исследован известный медицинский препарат иммуномакс, производимый фирмой «Иммафарма» (Россия) из растений. Согласно представленным данным, иммуномакс регулирует активность многих клеточных генов. В фибробластах человека препарат значительно индуцировал транскрипцию генов мультифункциональных факторов NF-kB и р53, в значительной степени повышал уровни экспрессии генов интерферона (ИФН) Р1 и ИФН-стимулируемого (ИСГ) 15. Иммуномакс стимулировал гены иммунных цитокинов - ИЛ1-Р, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ8 и ИЛ17А. Гены «домашнего хозяйства» (18S-рибосомальной РНК, ГАФД, р-актина и Р2-микроглобулина также были активированы. Впервые исследовано действие иммуномакса на экспрессию подтипов ИФНа (1,2, 5 и 21) и типов ИФНР1, ИФ^ и ИФНЛ1 в клетках крови человека, полученных от доноров. Наблюдаемые эффекты препаратов были различными и зависели от исходных конститутивных уровней ИФНа. Иммуномакс стимулировал ИФН-гены доноров с дефектной активностью (отсутствие или сниженный уровень). Наши результаты демонстрируют широкий биологический, иммуномодулирующий и противовирусный потенциал препарата «Иммуномакс» в клетках человека различного происхождения, связанный с системой ИФН, продукцией цитокинов и клеточным метаболизмом.
Ключевые слова: препарат иммуномакс; клетки человека; экспрессия генов; интерфероны; интерлейкины A.N. Shuvalov1, T.M. Sokolova2, I.M. Shapoval1, F.I. Ershov1
MODULATION OF CELLULAR GENE TRANSCRIPTION BY DRUG “IMMUNOMAX”: ACTIVATION OF INTERFERON AND INTERLEUKINE GENES
[N.F. Gamaleya Scientific Reseach Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of Russian Federation 123098, Moscow; 2D.I. Ivanovsky Institute of virology, Ministry of Health of Russian Federation, 123098, Moscow The well-known medical drug “Immunomax” produced by Russian firm “ImmaPharma” from plant material was studied. According to the results “Immunomax” regulates activity of many cellular genes. In human fibroblasts this drug induced transcription of multifunctional factors NF-kB and p53, it increased conciderably expression levels of beta1 -interferon and interferon-stimulated gene (ISG 15) and stimulated immune cytokine genes such as IL1b, IL4, IL6, IL8 and IL17A. The “housekeeping genes” (18S ribosomal RNA, GAPDH, actin-beta, B2M) were also activateded. For the first time we studied “Immunomax” action on gene expression of subtypes (1, 2, 5, 21) alpha-IFN and IFN-beta1, IFN-gamma, IFN-lambda in human blood cells from donors. Observational drug effects were different and depended on initial constitutive levels of alpha-IFN. “Immunomax” stimulated donors' IFN-genes with defective activity (absent or lower). Our results demonstrate wide biological and antiviral potential of this drug in human cells in connection with IFN-system, cytokine production and cellular metabolism.
Key words: drug "Immunomax"; human cells; gene expression; interferons; interleukines
Введение
Препарат иммуномакс широко используют как иммуномодулятор при бактериальных и вирусных инфекциях [1]. Данные о механизмах действия иммуномакса были получены в иммунокомпетентных клетках мыши и человека [2]. Показаны иммуноадъювантные свойства препарата, эффект усиления антибактериальной защиты и активация моноцитов, NK-клеток и грануло-цитов. Иммуномодулирующее действие иммуномакса сопровождалось продукцией интерлейкинов (ИЛ) (ИЛ-ip и ИЛ-8) и фактора некроза опухолей а (ФНОа). По химической природе иммуномакс является кислым пептидогликаном (ПГ) растительного происхождения (см. инструкцию фирмы-производителя «Иммафарма», Москва). ПГ - известные консервативные структурные компоненты клеточной стенки бактерий, которые узнаются иммунной системой животных с помощью рецепторов врожденного иммунитета. Известные по-
Шувалов Александр Николаевич (Shuvalov Alexander Ni-colaevich), e-mail: [email protected]; Соколова Татьяна Михайловна (Sokolova Tat’yana Mihaylovna), e-mail: [email protected]; Шаповал Ирина Михайловна (Shapoval Irina Mihaylovna); Ершов Феликс Иванович (Ershov Felix Ivanovich)
верхностные ПГ-узнающие рецепторы (PGLYRPs) и внутриклеточные сенсоры NOD1, NOD2 (NaLp3) включают активацию фактора транскрипции NF-kB, его транслокацию в ядро и индукцию синтеза провоспалительных цитокинов [3]. Действующая функциональная единица ПГ муранилдипептид (МДП), взаимодействует с NOD2 и в клетках эндотелия сосудов индуцирует синтез интерферона (ИФН) 1-го типа с участием IRF3 независимо от ФНОа [4]. Предполагают, что индукция синтеза ИФНу и фактора ФНОа осуществляется c поверхностных PGLYRPs по механизму, подобному таковому липополисахарида и стеариновой кислоты [5].
В нашей работе впервые изучены транскрипционные механизмы действия отечественного препарата иммуномакс на клетках фибробластов и цельной крови человека. Проанализирована экспрессия большой группы клеточных генов, которые относятся к системе ИФН, апоптоза, регуляторов транскрипции и генов «домашнего хозяйства». Для количественной оценки генной экспрессии использовали метод обратной транскрипции полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) в реальном времени. По нашим данным, имму-номакс - регулятор транскрипции многих клеточных генов и ему присущи не только иммуномодулирующие
- 16 -
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
101
8-
6
4
2 Н О
1
контроль 18S ГАФТ (32М Актин
в
7
6
5
4321 -О
- 5 ! ш
Щ
" 1
Р ш.
Контроль ИЛ-1 ИЛ-6 ИЛ-8
Контроль р53 NF-kB г
20
Щ
- 10
~ 1
- 1 ш Р
' Контроль' ИФН Р ' ИСГ-15 '
Рис. 1. Действие иммуномакса на транскрипцию клеточных генов в фибробластах человека.
Оценка уровней транскрипции в количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Рассчитаны уровни экспрессии генов относительно контроля, принятого за 1.
По оси ординат - относительный уровень ACq, по оси абсцисс обозначения генов: «домашнего хозяйства» (а), факторов транскрипции NF-kB и p53 (б), интерлейкинов (в), ИФНР1 и ИСГ15 (г), ЙФНа, иФНу, ИфНА, и ФНО-альфа (д). Над столбиками даны числовые значения кратности стимуляции мРНК относительно контроля. а, б, в, - сверху и снизу приведены результаты электрофореза в 1,5% агарозном геле специфических ПЦР-продуктов, окрашенных бромистым этидием. Дорожки геля (в) ИЛ-4 и ИЛ-17: контроль (К), реаферон (Р), иммуномакс (И).
Анализ специфичности ОТ-ПЦР-продуктов по температурам плавления в конечной точке амплификации (е). Показаны пики и температуры плавления специфических ИФН-зависимых ферментов (дсПк, ОАС, РНК-азы) и ФНОа ИФН. Исследованные препараты реаферон (Р), авонекс (А), иммуномакс (И). Контроль клеток без препаратов (К) и негативный контроль в ПЦР (Н). Неспецифические пики ДНК-амплификатов, не соответствующие по Т-плавления расчетным ( #).
1 - контроль; 2 - 18S; 3 - ГАФД; 4 - Р2; 5 - актин.
свойства, но и другие биологические активности, ассоциированные с системой ИФН [6]. Полученные нами данные демонстрируют сходство в транскрипционной регуляции генов МДП с иммуномаксом. Впервые показано, что иммуномакс активирует транскрипцию генов ИФН, ключевых клеточных регуляторов - белка р53, фактора NF-kB и ИФН-стимулируемого гена (ИСГ)15, кодирующего убиквитиноподобный белок [7].
Материал и методы. Препарат иммуномакс («Имма-фарма», Москва), по данным производителя, содержит 200 ЕД активного вещества (соответствует примерно 40 мкг и предназначен для внутримышечного введения). По химической природе является кислым пептидогликаном с молекулярной массой 1000-40000 кД, выделен из растений и очищен хроматографическими методами. Для обработки клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) препараты разводили в питательной среде до концентрации 0,4 ед/мл. На клетках крови исследовали две концентации - 5 и 0,5 ед/мл. Выбранные дозы не вызывали видимых изменений клеточной морфологии, клеточной проницаемости (окраска трипановым синим) и оказывали стимулирующее действие на экспрессию генов «домашнего хозяйства» (рис. 1, а).
Культура клеток. Фибробласты легкого эмбриона человека (линия ФЛЭЧ-977) получены из Медико-генетического центра РАМН (Москва). Постановку экспериментов осуществляли на монослое, выращенном в 96-луночных плато
(Costar) в питательной среде DMEM с добавлением глутамина, 10% сыворотки телят и гентамицина («ПанЭко», Россия). Варианты «контроль» и «иммуномакс» дублировали в 6 лунках плато, концентрация иммуномакса в лунке составляла 0,4 ед/мл, время инкубации с препаратом 24 ч при 37°С. Клетки объединяли на этапе добавления в лунки лизирующего буфера. Суммарное количество фибробластов составляло 3 • 105 кл на 0,3 мл реагента тризол (Invitrogen).
Для приготовления суспензии клеток крови использовали свежевзятую кровь из вены 3 доноров (1 мужчина 25 лет и 2 женщины 50-65 лет; табл. 1). Цельную кровь в количестве 0,25 мл разбавляли 1:3 средой RPMI-1640 с 10% ЭТС и антибиотиками. К разведенной крови добавляли раствор им-муномакса в количестве 5 мкл (конечная концентрация 5 и 0,5 ед/мл). Клетки крови инкубировали с препаратом 24 ч при 37°С, затем осаждали центрифугированием при 1500 об/мин 10 мин, промывали средой RPMI, повторно осаждали и использовали для выделения РНК.
Выделение РНК и количественная ОТ-ПЦР. К клеткам добавляли реагент три-зол (Invitrogen) или буфер лизиса из набора Total RNA isolation kit (Promega) и проводили выделение РНК, согласно инструкции. Осадки РНК промывали 70% этанолом, растворяли в 30 мкл и обрабатывали ДНКазой (набор DNA free фирмы Ambion). РНК отжигали с универсальным олиго(дТ)15 или random-праймерами при 95°С 5 мин. Реакцию ОТ проводили при 40°С в течение 1 ч в реакционной смеси объемом 30 мкл, которая содержала фермент RT MMuLV 200 ед/мл, ингибитор нуклеаз RNAsin 1 ед/мл, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ по 500 мкМ) и выделенную РНК.
Синтезированную кДНК анализировали в количественной ПЦР в разведении 1:3 и 1:30. ПЦР в реальном времени ставили на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США) в двух вариантах: 1) 2-кратная реакционная смесь Sso-Fast EvaGreen Supermix и специфические пары праймеров; 2) 2-кратная реакционная смесь SsoFast Probe Supermix с парами специфических праймеров и меченными FAM -Taq-man зондами. Праймеры для мРНК транскриптов генов, использованные в нашей работе для анализа генной экспрессии, приведены в табл. 2 (большинство из них рассчитаны нами в программах Primer Blast и Primer Express). Указаны размеры ожидаемых ПЦР-продуктов и конститутивный уровень экспрессии генов в контрольных, необработанных иммуномаксом клетках. Также приведены праймеры к мРНК ИФНа (консервативная пара к подтипам 4, 7, 8 и 21), олигоаденилатсинтетазе (ОАС1), дсРНК-протеинкиназе (дсПК), использованные нами ранее в полуколичественной ОТ-ПЦР [8, 9]. Из данных литературы взяли структуру праймеров к мРНК ИЛ-4 [10], ИЛ-17А [11, 12] и генам «домашнего хозяйства» - 18S рибосомальной РНК, мРНК Р-актина, ГАФД, Р2-микроглобулину (P2M) [13].
Количественный ОТ-ПЦР анализ провели 2 раза. Статистическую оценку изменений уровня транскрипции генов сделали относительно контроля по методу 2 в степени ACq (2ДСq) в программе «Gene Expression Analysis CFX-96» (BioRad, США). Стандартная ошибка измерений (SD) не превышала + 0,5. Значения в контроле (клетки, необработанные препаратом) принимали равным 1. Программа ПЦР: 96°С 2 мин, далее 45 циклов 94°С 10 с, 50-59° С 20 с, 72°С 30 с. В конечной точке количественной ОТ-ПЦР (вариант 1) по пикам плавления устанавливали специфичность ДНК-продуктов.
- 17 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
Таблица 1
Экспрессия генов подтипов ИФНа в клетках крови доноров
Донор Уровни амплификации (значение Cq)*
ИФНа1 ИФНа2 ИФНа5 ИФНа21
№ 1:
контроль 37,4 0 0 38,7
иммуномакс:
5 ед. 36,6 36,9| 0 38,6
0,5 ед. 33,9| 0 37,4| 37,5
№ 2:
контроль 37,2 35,7 37,0 35,7
иммуномакс:
5 ед. 39,5| 04 38,84 38,74
0,5 ед. 37,0 38,44 37,0 36,8
№ 3:
контроль 35,3 35,3 35,2 36,0
иммуномакс:
5 ед. 34,6 34,9 34,4 37,0
0,5 ед. 33,7| 34,9 34,1 34,1
Примечание. * - амплификация с мечеными FAM - Taqman-зондами; 44 - стимуляция или подавление экспрессии генов более чем в 2 раза; выделенные показатели демонстрируют достоверные изменения; донор № 1 - молодой мужчина 25 лет, имеет антитела к вирусу Эпштейна-Барр и часто болеет ангинами, донор № 2 - женщина 53 лет с кардиологическими нарушениями; донор № 3 - женщина 65 лет с онкологическим заболеванием I стадии.
В варианте с меченным FAM-Taq-man зондом специфичность определяли их комплементарным взаимодействием и освобождением флюоресцентного красителя. Дополнительно ДНК-амплификаты (варианты ПЦР 1 и 2) анализировали электрофорезом в агарозном геле с бромистым этидием на соответствие расчетным размерам. Негативный контроль праймеров (без кДНК) не давал специфических ПЦР - продуктов.
Результаты и обсуждение. Для анализа количественных изменений генной экспрессии широкое распространение получил метод ОТ-ПЦР в реальном времени, который является наиболее точным и дает воспроизводимые результаты в различных типах клеток [14]. В фундаментальных исследованиях метод применяют для изучения механизмов действия препаратов различной природы на геном человека.
Конститутивный уровень экспрессии генов в клетках человека. На первом этапе важно было оценить конститутивный уровень экспрессии генов в контрольных клетках и специфичность образуемых ПЦР-продуктов (см. табл. 2). В культуре ФЛЭЧ уровень транскрипции мРНК большинства исследованных генов был невысоким. Пороговый цикл амплификации Cq находился в диапазоне 30-40 c разведениями кДНК в 3-5 раз. Ряд ДНК-продуктов содержали дополнительные неспецифические продукты, что затрудняло дальнейший расчет относительных количественных изменений в ответ на препарат (ACq). Нам не удалось выявить определяемого количества мРНК ИФНвх, ИФНу и ИФНАр а также ИЛ-17А в исследуемом материале ФЛЭЧ после проведения 50 циклов амплификации.
В клетках крови 3 доноров содержание мРНК ИФНа подтипов 1, 2, 5, 21 и ИФН^ также было
низким (35—39 Cq). Уровень транскрипции мРНК ИФНРХ и ИФНу, как и в клетках ФЛЭЧ, оказался неопределяемым.
В то же время содержание 18S-рибосомальной РНК, мРНК в-актина, ГАФД и в 2М в клетках ФЛЭЧ было высоким (Cq 20-25, разведения кДНК в 30-50 раз). Синтезируемые ОТ-ПЦР-продукты по температурам плавления и данным электрофореза высокоспецифические (см. рис. 1, а). Кодирующие их гены относят к генам «домашнего хозяйства» и часто используют в количественной ОТ-ПЦР как стабильные референсы для нормализации экспрессии индуцибельных генов [13]. Однако, по нашим данным, их уровень в клетках ФЛЭЧ возрастал под действием иммуномакса. Подобное активирующее действие на эти референс-РНК мы обнаружили в клетках ФЛЭЧ с препаратами реаферон и ридостин (дсРНК). Поэтому рассматривать эти РНК как нормализаторы не всегда представляется возможным [15].
регуляция иммуномаксом активности генов р53, NF-kB, ИЛ, ИФН-регулируемых генов в фибробластах человека. Прежде всего нас интересовали эффекты иммуномакса на гены, кодирующие регуляторные транскрипционные факторы NF-kB и p53, которые контролируют активность большой группы генов клеточной защиты [16, 17]. Кратность стимуляции имму-номаксом транскрипции этих ключевых генов была приблизительно одинаковой - порядка 5-6 раз (рис. 1, б). Это указывало на включение сигнальных путей,
а
Рис. 2. Индукция иммуномаксом генов ИФН в клетках крови доноров.
Донор №1 (а), доноры №2 и №3 (б).
Оценка индукции в количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Столбики показывают кратность стимуляции экспрессии генов б-ИФНр, г - ИФНу, лИФНД относительно контроля принятого за 1.
- 18 -
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
Таблица 2
Описание праймеров, использованных в анализе экспрессии генов
Ген Структура праймеров и гибридизацион-ных проб Конститутивный уровень в клетках Размер продукта, н. п.
ИФНа1 F5’ - agtatctgcaatatctacgatggc R5’-gatcacagcccagagagcag (FAM) agctaagcaccaccaggaccatca (BHQ1) Кровь Сq 35-37 95
ИФНа2 F5’-caacatctacaatggccttgacc R5’-cagtacacagcccacagagc (FAM) actggtggccctcctggtgctca (BHQ1) Кровь Сq 35-36 89
ИФНа5 F5’-tctcaacagcccagaagcatc R5’-tcacagcccagagaacagattg (FAM) agttgagcaccaccagggccatca (BHQ1) Кровь Сq 35-37 108
ИФНа21 F5’-gttacccatctcaggtagcctagc R5’-atcacagcccagagaacagatg (FAM) tgagcaccagcacggccatcagt (BHQ1) Кровь Сq 36-39 117
ИФНР F5'-atgaccaacaagtgtctc R5'-tcagtttcggaggtaacc ФЛЭЧ Сq > 50 Кровь 564
ИФНу F5'-atgaaatatacaagttatatcttgg R5'-ttactgggatgctcttcg ФЛЭЧ Сq > 50 Кровь 501
ИФНХ F5’-catcatcttggattgcccattt R5’-tatttgaggtctcgcgtgagg ФЛЭЧ Сq > 50 Кровь Сq 37 623
ИСГ-15 F5’-atgttttcagataattcacattgc R5’-ctatttgttttggcccagttt ФЛЭЧ Сq 34-35 396
дсПК F 5’-tgcatcgggggtgcatgggcc R5’-cttcacgctccgccttctcgt ФЛЭЧ Сq 30,4* 563
ОАС1 F5’-tcggggagggggtggagttcg R5’-gctcactgggggacccatccca ФЛЭЧ Сq 36* 602
РНКаза L F5’-agtgagccacaggggcca R5’-aggaccagccgtccaaggtcc ФЛЭЧ Сq 33 320
р53 F 5’-tgctcaagactggcgctaaa R5’-gctcgacgctaggatctgac ФЛЭЧ Сq 31 208
NF-kB F5’-ccatatttgggaaggcctgaac R5’ - tatgggccatctgttggcag ФЛЭЧ Сq 31 113
FAS (CD95) F5’-tgagactcagaacttggaaggcc R 5’-tgcccactgtttcaggtttaagg ФЛЭЧ Сq 29* 532
ФНОа F5’-gcaacaagaccaccacttcg R5’-gtaggccccagtgagttctg ФЛЭЧ Сq 26 114
ИЛ-1Ь F5’-atctgtacctgtcctgcgtg R5’-cgggcatgttttctgcttga ФЛЭЧ Сq 34* 198
ИЛ-4 [7] F5’-cttccccctctgttcttcct R5’-ttcctgtcgagccgtttcag ФЛЭЧ Сq 37* 269, 317
ИЛ-6 F5’-gacccaaccacaaatgccag R5’-atctgaggtgcccatgctac ФЛЭЧ Сq 31 154
ИЛ-8 F5’-caccggaaggaaccatctca R5’-ttggggtggaaaggtttgga ФЛЭЧ Сq 30 172
ИЛ-17А [17] F5-ccacgaaatccaggatgcccaaat R5'-attccaaggtgaggtggatcggtt ФЛЭЧ Сq > 50 144
ИЛ-17А [6] F5’-aatctccaccgcaatgagga R5’-acgttcccatcagcgttga (FAM) cggcactttgcctcccagatcaca (BHQ1) Кровь Сq 36-37 95
Примечание. Курсивом отмечены гены c невыявляемым уровнем транскрипции мРНК при проведении 50 циклов амплификации. * - наличие наряду со специфическими дополнительных продуктов; н. п. - нуклеотидные пары.
приводящих к активации группы провоспалительных цитокинов и ИФН-генов [4, 18]. В обработанных иммуномаксом клетках действительно наблюдали стимуляцию группы ИЛ: ИЛ-1Ь, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-17А (рис.1, в).
Наиболее выраженной оказалась активация иммуномаксом генов ИФНР1 и ИСГ-15 (рис. 1, г). При этом следует отметить, что конститутивный уровень экспрессии гена ИФНР1 в контрольных фибробластах был неопределяемым, а гена ИСГ-15 - низким. Значимых изменений в транскрипционной активности генов ИФН-зависимых ферментов олигоаденилатсинтета-зы (ОАС1), дсРНК-зависимой про-теинкиазы (дсПК) и рибонуклеазы (РНКазы L) не обнаружили. Имму-номакс слабо стимулировал синтез специфических мРНК-ферментов. Таким образом, из широкого спектра исследованных генов наиболее восприимчивыми к иммуномаксу по данным транскрипционного анализа оказались гены ИФНР1 и ИСГ-15.
влияние иммуномакса на экспрессию генов ИФн и ИЛ-17 в клетках крови человека.
Особый интерес представляло изучение действия иммуномакса на гены ИФН в клетках крови человека. С этой целью взяли кровь у 3 доноров разного возраста. К культивируемым в питательной среде клеткам крови добавили им-муномакс в двух концентрациях - 5 и 0,5 ед/мл. Результаты проведенного анализа экспрессии генов ИфНа (подтипы 1, 2, 5 и 21) у 3 доноров представлены в табл. 1. Донор № 1 оказался дефицитным по мРНК подтипов ИФНа2 и ИФНа5 (не выявлялись в контроле) и имел более низкую активность мРНК ИФНа21. Именно в клетках крови этого донора иммуномакс вызывал наиболее сильный стимулирующий эффект. В то же время у 2 других доноров (№ 2 и № 3) исследованные мРНК подтипов ИФНа выявляли конститутивно. Возможно, поэтому их гены либо не отвечали (донор № 2) или реагировали на иммуномакс слабее, чем гены донора № 1. Наблюдаемый избирательный эффект характерен для иммуномодулятороов.
Дефектный по экспрессии генов ИФНа донор № 1 оказался особо восприимчивым к иммуномаксу и
- 19 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
по генам других видов ИФН. У него наблюдали выраженную стимуляцию активности генов ИФНр, ИФНу и ИФШ, (рис. 2, а). Для этого в условиях in vitro требовалась низкая доза иммуномакса. Подобного стимулирующего эффекта не обнаружили у донора № 2 с выявляемой экспрессией ИФНа/ ИФНр. Донор № 3 отвечал стимуляцией экспрессии гена ИФНР1 на 5 ед. иммуномакса (рис. 2, б).
Дополнительно изучали эффект иммуномакса на экспрессию гена ИЛ-17А в клетках крови. У донора № 1 наблюдали эффект стимуляции активности гена этого ИЛ, а у доноров № 2 и № 3 заметных изменений не обнаружили (данные не приводятся).
Заключение
Наши результаты впервые демонстрируют выраженную способность иммуномакса модулировать транскрипцию генов ИФН в двух типах клеток человека - ФЛЭЧ и клетках крови. Полученные данные подтверждают сообщение [4] об индукции МДП (МДП-действующая структура ПГ) ИНФ 1-го типа в эндотелиальных клетках человека. Результаты согласуются с ранее установленными механизмами позитивного влияния препарата на иммунокомпетентные клетки мыши и продукцию ими ИЛ-lb и ИЛ-8 [2]. Спектр генов, регулируемых иммуномаксом, дополнительно включает ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-17. Впервые установлена активация им-муномаксом генов NF-kB и р53, которые регулируют многие клеточные процессы, в том числе гены врожденного иммунитета и ИФН. Впервые сделан анализ действия иммуномакса на гены трех типов ИФН в клетках крови человека. Обнаружен избирательный эффект индукции генов ИФН у доноров с дефицитом в системе ИФН.
ЛИТЕРАТУРА
1. Новиков А.Г., Логунова З.В., Потекаев Н.Н. Опыт применения иммуномодулятора «Иммуномакс». Русский медицинский журнал. 2004; 12 (13): 819-20.
2. Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Шишкова Н.М. Мастернак Т. Б., Малкина Е. Ю., Ульянова Л. И. и др. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия препарата Иммуномакса. Иммунология. 2005; 26 (2): 111-20.
6. Соколова Т.М., Ершов Ф.И. РНК интерференция и система интерферона. Цитокины и воспаление. 2011; 10 (4): 11-20.
8. Соколова Т.М., Бибикова О.В., Быстров Н.С., Урываев Л. В. Экспрессия генов системы интерферона и клеточного апоптоза в пробах крови человека. Вопросы вирусологии. 2005; 50 (1): 19-21.
9. Соколова Т.М., Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Терехов С.М., Урываев Л.В., Кущ А.А. Механизмы клеточной резистентности к цитомегаловирусу связаны с пролиферативным состоянием и транскрипционной активностью генов лейкоцитарного и иммунного интерферонов. Медицинская иммунология. 2007; 9 (4-5): 457-б6.
REFERENCES
1. Novikov A.G., Logunova Z.V., Potekaev N.N. Experience of using an immunomodulator “Immunomax”. Russkiy medtsinskiy zhurnal. 2004; 12 (13): 819-20 (in Russian).
2. Ataullakhanov R.I., Pichugin A.V, Shishkova N.M., Masternak Т.В., Malkina E.Yu., Ulyanova L.I. Cell mechanisms of the im-munomodulating action produced by drug “Immunomax”. Im-munologiya. 2005; 26 (2): 111-20 (in Russian).
3. SorboraM.L., PhilpottD.J. Peptidoglycan: a critical activator of the mammalian immune system during infection and homeostasis. Immunol. Rev. 2011; 243 (1): 40-60.
4. Qingshan L., Mei Yang, XueetingLiu. MDP up-regulates the gene expression of type I interferons in human aortic endothelia cells. Molecules. 2012; 17: 3599-608.
5. Sharma P., Dube D., Sinha M. Structural insights into the dual strategy of recognition by Peptidoglycan recognition protein, PGRP-S: Structure of the ternary complex of PGRP-S with lipopolysacca-ride and stearic acid. Plos one. 2013; 8 (I): e53756.
6. Sokolova T.M., Ershov F.I. RNA-interference and the system of interferon. Tsytokiny i vospaleniye. 2011; 10 (4): 11-20 (in Russian).
7. Zhang D., Zhang D-Er Interferon-stimulated gene 15 and protein IS-Gylation system. J. Interferon Cytokine Res. 2011; 31 (1): 119-30.
8. Sokolova T.M., Bibikova O.V., Bystrov N.S., Uryvaev L.V. Gene expression of the interferon and cell-immunity systems in human blood samples. Voprosy virusologii. 2005; 50 (1): 19-21 (in Russian).
9. Sokolova T.M., Fedorova N.E., Medzhidova M.G., Terekhov SM., Uryvaev L.V., Kushch A.A. Mechanisms of cell resistance to cytomegalovirus are connected with cell proliferation state and transcription activity of leukocyte and immune interferon genes. Meditsins-kaya immunologiya. 2007; 9 (4-5): 457-66 (in Russian).
10. Hamzaoul A., Brahim M.B. Iflammatory response in induced sputum mononuclear cells from patients with acute exacerbation asthma. Mediat. Inflamm. 2000; 9 (3-4): 147-55.
11. Bullens D.M.A.,Truyen E., Cotour L. IL-17 mRNA in sputum of asthmatic patients: linking T cell driven inflammation and granulocytic influx. Respir. Res. 2006; 7 (135): 1-9.
12. Wainwringht D.A., Sengupta S., Han Y. et al. The presence of IL-17A and T helper 17 cells in experimental mouse brain tumors and human glioma. Plos one. 2010; 5 (10): 1-7.
13. Rho H.W., Lee B.C., Choi E.S. Identification of valid reference genes for gene expression studies of human stomach cancer by reverse transcription - qPCR. BMC Cancer. 2010; 10: 240-53.
14. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-DeltaDeltaC(T). Methods. 2001; 25: 402-8.
15. Vazquez-Blomquist D., Fernandez J.R., Miranda J. Selection of reference genes for use in quantitative reverse transcription PCR assays when using interferons in U87MG. Mol. Biol. Rep. 2012; 39 (121): 11167-75.
16. Pestka S. A dance between interferon-alpha/beta and p53 demonstrates collaborations in tumor suppression and antiviral activities. Cancer Cell. 2003; 4 (2): 85-7.
17. Shapshak P. Bioinformation and molecule of the moth: Multiple pathways for a single gene, NF-kB. Bioinformation. 2012; 8 (9): 399-402.
18. McDonald C., Inohara N, Nufiez G. Peptidoglycan signaling in Innate immunity and inflamantory Disease. J. Biol. Chem. 2005; 280 (21): 20177-80.
Поступила 23.04.13
- 20 -
