Подавление цикла вируса гепатита в под действием нуклеолитических систем CRISPR/Cas9 и белка HBx Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Оригинальные статьи

Original articles

Инфекция и иммунитет Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet

2019, Т. 9, № 3-4, с. 476-484 2019, vol. 9, no. 3-4, pp. 476-484

ПОДАВЛЕНИЕ ЦИКЛА ВИРУСА ГЕПАТИТА В ПОД ДЕЙСТВИЕМ НУКЛЕОЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ CRISPR/Cas9 И БЕЛКА HBx

С.А. Брезгин12, А.П. Костюшева1, В.Н. Симирский3, Е.В. Волчкова4, Д.С. Чистяков4, Д.С. Костюшев1, В.П. Чуланов1,4

1ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия

2 ФГБУГНЦИнститут иммунологии ФМБА России, Москва, Россия

3Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия

4ГБОУВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова МЗ РФ, Москва, Россия

Резюме. Вирус гепатита В (ВГВ) может вызывать хронический гепатит В (ХГВ) — тяжелое хроническое заболевание печени инфекционной природы. По последним данным официального статистического наблюдения, число больных ХГВ в мире превышает 250 млн человек, а в Российской Федерации составляет около

3 млн человек. Противовирусные препараты (аналоги нуклеоз(т)идов и пегилированный интерферон) подавляют репликацию и транскрипцию вируса, однако не способны полностью элиминировать его из организма. Причиной этого является стабильная форма генома ВГВ — кольцевая ковалентно замкнутая ДНК (ккзДНК), которая представляет из себя компактную минихромосому, экранированную от воздействия противовирусных препаратов. Необходимым шагом для излечения ХГВ является разработка новых терапевтических подходов, направленных на разрушение или инактивацию матриц ккзДНК. Системы сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 способны вносить двуцепочечные разрывы в практически любые заданные участки ДНК. Ранние работы по использованию сайт-специфичных нуклеаз CRISPR/Cas9 для ВГВ продемонстрировали эффективное разрезание ккзДНК, однако деградации всех матриц добиться не удалось. Вероятно, причиной этого являются структурные особенности ккзДНК, которая может существовать в гетерохроматизированном состоянии, недоступном для действия белков-нуклеаз CRISPR/Cas9. Один из активаторов транскрипции, вирусный белок HBx, способен релаксировать структуру ккзДНК, привлекая к ним факторы, ремоделирующие хроматин. Белок HBx активирует транскрипцию ВГВ и способствует расплетению структуры ккзДНК, делая ее более доступной для систем CRISPR/Cas9. В данной работе было изучено влияние белка HBx дикого типа, а также мутантных, более безопасных форм НВх белка (HBxMut, который не взаимодействует с факторами Bcl-2 и Bcl-xL, и HBxNESM, который не вызывает образование активных форм кислорода и не индуцирует двуцепочечные разрывы в геноме) на эффективность систем CRISPR/Cas9. Выяснилось, что НЬх белок и его мутантные формы способны значительно увеличить эффективность систем CRISPR/Cas9, подавляя транскрипцию вирусной прегеномной РНК вплоть до 98%. Были определены оптимальные соотношения и концентрации плазмид, кодирующих элементы систем CRISPR/ Cas9 и белков HBx. Кроме того, было показано, что белки HBx в выбранном диапазоне концентраций не вы-

Адрес для переписки:

Костюшева Анастасия Павловна 111123, Россия, Москва, ул. Новогиреевская, 3А, ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Тел.: 8 925 310-91-24 (моб.). E-mail: ak@rcvh.ru

Библиографическое описание:

Брезгин С.А., Костюшева А.П., Симирский В.Н., Волчкова Е.В., Чистяков Д.С., Костюшев Д.С., Чуланов В.П. Подавление цикла вируса гепатита В под действием нуклеолитических систем CRISPR/Cas9 и белка HBx // Инфекция и иммунитет. 2019. Т. 9, № 3-4. С. 476-484. doi: 10.15789/2220-7619-2019-3-4-476-484

Contacts:

Anastasiya P. Kostyusheva

111123, Russian Federation, Moscow, Novogireevskaya str., 3A, Central Research Institute of Epidemiology. Phone: +7 925 310-91-24 (mobile). E-mail: ak@rcvh.ru

Citation:

Brezgin S.A., Kostyusheva A.P., Simirsky V.N.c, Volchkova E.V., Chistyakov D.S., Kostyushev D.S., Chulanov V.P. Suppression of hepatitis B virus by a combined activity of CRISPR/Cas9 and HBx proteins // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2019, vol. 9, no. 3-4, pp. 476-484. doi: 10.15789/2220-7619-2019-3-4-476-484

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 16-15-10426. © Брезгин С.А. и соавт., 2019 DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-2019-3-4-476-484

зывают изменений пролиферации и жизнеспособности клеток. Таким образом, совместное действие систем сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 и вирусного белка-активатора HBx значительно подавляет транскрипцию вируса гепатита В.

Ключевые слова: вирус гепатита В, кольцевая ковалентно замкнутая ДНК, CRISPR/Cas9, белок HBx, мутантные формы белка HBx.

SUPPRESSION OF HEPATITIS B VIRUS BY A COMBINED ACTIVITY OF CRISPR/Cas9 AND HBx PROTEINS

Brezgin S.A.ab, Kostyusheva A.P.a, Simirsky V.N.C, Volchkova E.V.d, Chistyakov D.S.d, Kostyushev D.S.a, Chulanov V.P.ad

a Central Research Institute of Epidemiology, Rospotrebnadzor, Moscow, Russian Federation bInstitute of Immunology FMBA, Moscow, Russian Federation

c Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation dI.M. Sechenov Moscow State Medical University, Moscow, Russian Federation

Abstract. Chronic hepatitis B is a severe liver disease associated with persistent infection with hepatitis B virus. According to recent estimations, 250 million people in the world are chronically infected, including 3 million chronically infected people in Russia. Antiviral therapeutics (nucleos(t)ide analogues and PEGylated interferon) suppress viral transcription and replication, but do not eliminate the virus from infected cells. The key reason for HBV persistency is a stable form of the viral genome (covalently closed circular DNA, cccDNA) that exists as a minichromosome protected from novel cccDNA-targeting therapeutics. Novel therapeutic approaches aimed at elimination or inactivation of cccDNA are urgently needed. CRISPR/Cas9 systems induce double strand breaks in target sites of DNA sequences. Experiments with CRISPR/Cas9 demonstrated high antiviral activity and efficient cleavage of cccDNA, but a small part of cccDNA pool remains intact. One of the main reasons of incomplete cccDNA elimination might be the structural organization of cccDNA, which persists in a heterochromatinized, very compacted form and is not be accessible to CRISPR/Cas9 systems. Viral protein HBx unwinds cccDNA and regulates cccDNA epigenetically by recruiting transcription-remodeling factors. In this work, we analyzed effects of CRISPR/Cas9 in combination with an HBx-encoding plasmid or plasmids encoding mutant forms of HBx (HBxMut, which does not interact with pro-apoptotic factors Bcl-2 h Bcl-xL, and HBxNesm is localized exclusively in the nucleus and does not generate reactive oxygen species and double strand breaks in the genome). We showed that HBx improves CRISPR/Cas9 efficiency, decreasing pregenomic RNA transcription level over 98%. Moreover, we analyzed optimal ratios of plasmids encoding CRISPR/ Cas9 and HBx proteins for better antiviral efficacy. Furthermore, we discovered that HBx proteins do not have an effect on proliferation and viability of the transfected cells. In conclusion, CRISPR/Cas9 with HBx proteins exhibit high antiviral effect.

Key words: hepatitis B virus, circular covalently closed DNA, CRISPR/Cas9, specificity, HBx protein, mutant forms of HBx protein.

Введение

Инфекция вирусом гепатита В (ВГВ) может протекать в острой или хронической формах, на сегодняшний день около 250 млн людей страдают от хронического гепатита В (ХГВ) [20]. Для лечения пациентов с ХГВ используются аналоги нуклеоз(т)идов либо пегилирован-ная форма интерферона, однако они способны лишь подавлять вирусный цикл, при этом не оказывая прямого воздействия на основную причину хронической инфекции — персисти-рующую в ядрах гепатоцитов кольцевую ковалентно замкнутую ДНК (ккзДНК) ВГВ [10, 11]. В отличие от короткоживущих транскриптов вируса и репликативных интермедиатов (дву-цепочечной линейной и кольцевой частично двуцепочечной ДНК) ккзДНК в покоящихся гепатоцитах может находиться в течение очень длительного времени, при этом она является

недосягаемой для действия любых современных противовирусных средств даже в ходе продолжительных (от нескольких лет до десятилетий) курсов терапии [1]. Воздействие на транскрип-ционно-активную часть пула ккзДНК в гепа-тоцитах, которая составляет только некоторую часть популяции ккзДНК [16], отмечено лишь при лечении препаратами интерферона-а и несколькими цитокинами, которое заключается в снижении транскрипции ккзДНК и ее частичной элиминации в результате активации молекулярных внутриклеточных механизмов иммунитета и эпигенетического ремоделирования [17]. Следовательно, требуется разработка эффективного подхода, который позволит достичь деградации ккзДНК per se или сделать ее функционально некомпетентной. Технология сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 является одной из немногих технологий, способных оказывать прямое воздействие на ккзДНК. В ранее

опубликованных работах было продемонстрировано значительное подавление вирусной инфекции и снижение уровней ккзДНК вплоть до 90%. Тем не менее добиться нуклеолитичес-кого расщепления всех матриц ккзДНК системами CRISPR/Cas9 пока не удалось [5, 11, 14, 15, 16]. Причиной этого могут быть особенности структуры ккзДНК, которая остается недоступной для действия нуклеаз, поскольку она имеет нуклеосомную организацию и ассоциирована с гистоновыми и негистоновыми белками [13]. Она формирует в ядре типичную структуру «бусин на нитке» и существует в виде минихромо-сомы. Вирусный белок HBc в структуре мини-хромосомы связывается с двуцепочечной ДНК вируса, что приводит к уменьшению расстояния между нуклеопротеиновыми комплексами на 10% [3]. Таким образом, ккзДНК является высокостабильной структурой и может быть экранирована от действия CRISPR/Cas9 гисто-новыми и негистоновыми белками. Считается, что ккзДНК может существовать в нескольких конформациях, которые определяют ее транскрипционную активность [12, 16]. КкзДНК, существующая в транскрипционно активной конформации, может быть более доступна для действия CRISPR/Cas9. Таким образом, перевод матриц ккзДНК в транскрипционно активное состояние может увеличить эффективность нуклеолитического расщепления системами CRISPR/Cas9. Известно, что вирусный белок HBx регулирует ккзДНК эпигенетически и усиливает экспрессию вирусных РНК [2]. Он обеспечивает эпигенетический контроль ккзДНК, регулируя взаимодействие хроматин-ремодели-рующих белков с ДНК вируса. В клетках с му-тантной формой HBx белка пул ккзДНК в ядре не уменьшается, однако количество транскрибируемой прегеномной РНК снижается значительно. Взаимодействие HBx с ккзДНК связано с процессами вирусной репликации и привлечения ацетилтрансфераз p300 и CBP. HBx связывает многие клеточные белки, включая компоненты транскрипционного комплекса (RPB5, TFIIB, TBP, TFIIH), коактиваторы (CBP, p300, и PCAF) и факторы транскрипции (ATF/CREB, ATF3, c/EBP, NF-IL-6, Ets, Egr, SMAD4, Oct1, RXR receptor, p53) [2]. Таким образом, HBx является главным активатором транскрипции вируса, способствуя релаксации структуры ккзДНК и привлечению белков, обеспечивающих процесс инициации транскрипции.

В ходе данной работы был проведен анализ действия систем CRISPR/Cas9 в комбинации с белками HBx дикого типа [4], белком HBxMut [8], не взаимодействующим с про-апоптотическими факторами Bcl-2 и Bcl-xL, и HBxNESM [6], у которого отсутствует сигнал экспорта из ядра, также он не вызывает образо-

вание активных форм кислорода в цитоплазме и не индуцирует двуцепочечные разрывы в геноме человека. Были подобраны оптимальные условия котрансфекции клеток HepG2 плазми-дами, кодирующими элементы систем CRISPR/ Cas9, и плазмидами, кодирующими белки HBx. Выяснилось, что все 3 изученных белка могут значительно увеличивать эффект CRISPR/Cas9 систем с рядом РНК-проводников, что выражается в снижении уровня транскриптов преге-номной РНК ВГВ. Помимо этого, трансфекция плазмидами, кодирующими белки HBx, не вызвала значительных изменений пролиферации и жизнеспособности клеток.

Материалы и методы

Линии клеток. Клетки гепатомы человека HepG2 культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) (Thermo Fisher Scientific), 1% фетальной бычьей сыворотки (Gibco), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина при 37°С (5% СО2). Клетки в 24- и 12-луночных планшетах, достигшие 60—70% плотности, трансфицирова-ли: 1) плазмидой, кодирующей геном ВГВ (HBV-1.1mer, предоставлена Dieter Glebe, Университет Гиссена); 2) плазмидой, кодирующей белок Cas9 (предоставлена Phil Sharp и Feng Zhang, Addgene plasmid #63592); 3) ПЦР-продуктом, кодирующим РНК-проводник под иб-промотором (плаз-мида для получения ПЦР-продукта предоставлена Eric Lander и David Sabatini, Addgene plasmid #50662); 4) одной из плазмид, кодирующнй соответствующий белок HBx (HBx дикого типа, предоставлена Wang-Shick Ryu, Addgene plasmid #65463, HBxMut, предоставлена Ding Xue, Addgene plasmid #42598, HBxNESM, предоставлена Xin Wang, Addgene plasmid #, пустая плазми-да HBx, синтезирована в нашей лаборатории при помощи вырезания кодирующего HBx участка из плазмиды #65463) с помощью PEI. Через 24 ч среду отбирали, клетки промывали дважды фосфатным буфером, меняли среду на полную и инкубировали в течение еще 48 ч. После чего выделялись нуклеиновые кислоты и производился анализ ПЦР в реальном времени.

Дизайн РНК-проводников и получение ПЦР-продуктов. Мишени в геноме ВГВ были подобраны с использованием сервиса Broad Institute Genetic Perturbation Platform (portals.broadinstitute. org) и программы Geneious 7.1.9. ПЦР-продукт с U6-промотором, кодирующий РНК-проводник, получали при помощи двухэтапного мутагенного ПЦР с высокоточной полимеразой Q5 (New England Biolabs), с проведением амплификации с плазмиды pLX-sgRNA (Addgene plasmid #50662). РНК-проводник содержит мишень в геноме ВГВ и шпильку, необходимую для распознавания

белком S. pyogenes Cas9. Были подобраны следующие последовательности РНК-проводников:

Sp1: AGAGTGAGAGGCCTGTATTT;

Sp2: CTGCACGTCGCATGGAGACC;

Sp3: ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT;

Sp4: CTCCCTTATCGTCAATCTTC;

Sp5: ATGGGCCATCAGCGCATGCG;

Sp6: ACTACTGTTGTTAGACGACG;

Sp7: CACCTCACCATACTGCACTC;

Sp8: GGTTTCACCCCACCGCACGG;

Sp9: AATGTCAACGACCGACCTTG;

Sp10: GTCTGTGCCTTCTCATCTGC;

Sp11: GCGTTGATGCCTTTGTATGC;

Sp12: AGTGTTTGCTGACGCAACCC;

Sp13: CCTTATCGTCAATCTTCTCG;

Sp14: CTTTCCACCAGCAATCCTCT;

Sp15: CCACTGGCTGGGGCTTGGTC;

Sp16: CACTGTTTGGCTTTCAGTTA;

Sp17: CACCGCACGGAGGCCTTTTG;

Sp18: GGTCTGTGCCAAGTGTTTGC;

Sp19: CTGCCGATCCATACTGCGGA;

Sp20: TCTCATCTGCCGGACCGTGT;

Sp21: TTATAAAGAATTTGGAGCTA;

Sp22: TCGCCTCGCAGACGAAGGTC;

Sp23: CTGGGTTTCACCCCACCGCA;

Sp24: TGTGCACTTCGCTTCACCTC;

Sp25: TCTCGTGTTACAGGCGGGGT.

Выделение нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью набора AmpliSens «РИБО-преп» по протоколу производителя, добавляя лизирующий буфер непосредственно к клеткам после удаления среды и двукратного промывания фосфатным буфером. Фракцию нуклеиновых кислот обрабатывали ферментом DNAse I по протоколу производителя в течение 30 мин при 37°C, после чего для инактивации фермента осуществлялось перевыделение РНК с помощью набора «АмплиПрайм РИБО-преп». Далее проводилась обратная транскрипция с помощью набора «Реверта-L».

Полуколичественный ПЦР-анализ. Полуколичественный ПЦР-анализ проводили со специфическими праймерами и зондами TaqMan на прегеномную РНК ВГВ (пгРНК) и GAPDH. Были использованы следующие последовательности праймеров:

для GAPDH:

— прямой:

CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT;

— обратный:

GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT;

— зонд:

(fam) GAGCTACACTTGGCTGTGCT (bhql);

для прегеномной РНК:

— прямой:

GGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCT;

— обратный:

CATTGAGATTCCCGAGATTGAGAT;

— зонд:

(fam) TCTCAATCGCCGCGTCGCAGA (bhql).

Иммуноцитохимический анализ. Для имму-ноцитохимического окрашивания клетки выращивались на стеклах. Перед помещением в культуру стекла были простерилизованы: обработаны 70% этанолом и выдержаны под ультрафиолетом в течение часа. Далее стекла помещались на дно 6-луночных планшетов, клетки высевали с плотностью 0,5 х 105 на лунку. Фиксация клеток проводилась следующим образом: среда изымалась, клетки промывались дважды фосфатным буфером, фиксировались 4% параформальдегидом в течение 10 мин, отмывались трижды в Tris-HCl буфере (1х, 50 мМ, рН = 8,0) по 10 мин. Tris-HCl отбирали, клетки обрабатывали блокирующим буфером в течение 30 мин. Стекла обрабатывали первичными антителами (разведение антител 1:1000) к HBxAg в блокирующем буфере в течение 1 ч, производили отмывку несвязавшихся антител с помощью отмывочного буфера (3 раза по 10 мин). Стекла обрабатывали вторичными антителами (разведение антител 1:300) в блокирующем буфере течение часа, снова промывали отмывоч-ным буфером (3 раза по 10 мин). Для визуализации ядер клетки инкубировались с красителем Hoechst33342 в течение 10 мин и заключались в среде Fluoroshield.

Микроскопирование. Микроскопирование проводили на флуоресцентном микроскопе Leica DMI6000 с иммерсионными линзами, при 20-и 100-кратном увеличениях. Полученные изображения анализировались с помощью программы Leica AF. Работа проводилась с использованием оборудования ЦКП ИБР им. Н.К. Кольцова РАН.

Анализ пролиферации и жизнеспособности методом колориметрии. Исследование динамики пролиферации клеток HepG2 и их жизнеспособности проводили с помощью набора Cell Cytotoxicity Assay kit (Abcam Biochemicals), который предназначен для оценки пролиферации и жизнеспособности клеток по запатентованной технологии восстановления флуоресцентного субстрата делящимися клетками, по протоколу производителя. Эксперименты проводили в 96-луночных планшетах, рассевая клетки с 30%-ной плотностью в 8 технических повторах; для детекции флуоресцентного сигнала использовали планшетный спектрофотометр iMark (Bio-Rad Laboratories, Inc., США).

Статистика. Статистическую обработку проводили с помощью t-критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа OneWay ANOVA (где применимо) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7, попарные апостериорные сравнения производили с помощью критерия Тьюки.

Результаты

Усиление нуклеолитического действия CRISPR/Cas9 под действием белка HBx

Влияние НВх на эффективность противовирусного действия анализировали на модели котрансфекции клеток HepG2 по экспрессии прегеномной РНК. В клетки были ко-трансфицированы: 1) плазмида, кодирующая геном ВГВ; 2) плазмида, кодирующая белок Cas9 Streptococcus pyogenes; 3) ПЦР-продукт, кодирующий соответствующий РНК-проводник; 4) плазмида, кодирующая соответствующий белок HBx (либо некодирующая плазмида). Как и следовало ожидать, при трансфекции плазми-ды HBx без РНК-проводников происходит значительная активация вирусного цикла: уровень прегеномной РНК возрастает в 6,12+1,02 раз (p > 0,001) (рис. 1Б, II обложка). Далее была проведена первичная оценка влияния HBx дикого типа на действие систем CRISPR/Cas9. На рисунке 1А

(II обложка) представлена карта генома ВГВ с отмеченными на ней участками, к которым нацелены РНК-проводники. Все РНК-проводники были отобраны в предварительных экспериментах и сами по себе обладают высокой эффективностью действия (снижение уровня прегеномной РНК на 29-96%, p > 0,0001). Всего было проанализировано 25 РНК-проводников (Sp1-Sp25) для системы S. pyogenes Cas9 с котранс-фекцией плазмиды HBx или пустой плазмиды. Противовирусное действие оценивали по уровню экспрессии транскрипта ВГВ — прегеномной РНК. Для 9 РНК-проводников котрансфекция HBx не вызвала никаких статистически достоверных изменений траснкрипции прегеном-ной РНК (рис. 2Б), для 3 РНК-проводников наблюдалось снижение эффективности CRISPR/ Cas9 на 9-42% (рис. 2В). Тем не менее для 13 РНК-проводников котрансфекция плазмидой НВх приводила к усилилению противовирусного действия CRISPR/Cas9 на 2-42% (рис. 2А).

CT)

el

ё! О- cn 2 й go eSS

Р g

s ц_>

о со

0 щ

1 ЕС О

1,4 п 1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,40,2 -0 -

*** T """ л- *** **

1 Гк "1

Sp1 Sp1X C\J Q. CO X CM Q. CO Sp3 Sp3X Sp4 Q. 03 Ю a O) Sp5X Sp6 Sp6X 03 X Ь CO OO a. сл Sp8X

Q

пп m

9! 2Ä

О. О) 03 а

со

о.

из а. из

Q. т-

СМ X

a 51

с/3 a оз

S2 £ а. S со а. оз

сп

31

х Е

S<3

л о

Р g

U со

о 05

f ЕС О

1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 О

ns ns нз

П rn rh гг

нз ns

гп m m

JL na

nlmrTl

■4-х in x со x ю

Q.1- Q.T-03 Q. CO Q. CO CO

Q.T

CO I

St со а. оз

Sä

CO O. CO

О.?

03 O. 03

se

Q. CM CO Q. 03

S5

Q. CM

CM X

CM CM О.СЧ

со а. со

**

Рисунок 2. А) Экспрессия прегеномной РНК после действия системы S. pyogenes CRISPR/Cas9 при котрансфекции с белком НВх, повышение противовирусной активности CRISPR/Cas9. Б-В) РНК-проводники, эффективность которых не изменяется (Б) или снижается (В) при котрансфекции HBx дикого типа

Figure 2. А) Levels of pregenomic RNA after co-transfection with S.pyogenes CRISPR/Cas9 and HBx for RNA guides with increased antiviral activity. B-C) RNA guides with an antiviral efficacy that remained unaltered (B) or declined after co-transfection by wild type HBx (C)

Примечания. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям. **p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, нз — незначимые отличия. В верхней части графика указаны статистические отличия экспериментальных групп от группы контроля.

Notes. The data are represented as mean ± standard deviation. p < 0.05, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, ns — difference is not significant. Statistical difference between experimental groups and control group is shown on the top of each graph.

Для РНК-проводника БрП в комбинации с плаз-мидой НВх (БрПХ) удалось достигнуть снижения уровня прегеномной РНК на 98%.

Различные типы белков НВх улучшают действие СШБРР/СавЭ и не оказывают токсического действия

Поскольку НВх белок дикого типа взаимодействует с рядом клеточных белков и способен активировать онкогены, были подобраны безопасные мутантные формы белков НВх: НВхМи (не взаимодействует с проапоптотичес-кими факторами Вс1-2 и Вс1-хЬ) и НВхНББМ (отсутствует сигнал экспорта из ядра, не вызывает образование активных форм в цитоплазме, не вызывает образование двуцепочечных разрывов). На рисунке 3 (см. II обложку) представлены наиболее характерные отличия во внутриклеточной локализации каждого из трех вышеописанных белков: НВхНББМ имеет мутацию в сигнале ядерного экспорта, поэтому почти полностью локализуется в ядре, НВхшШ; лока-

лизуется преимущественно в цитоплазме, тогда как НВх белок дикого типа концентрируется в ядре, но распространен по всей клетке. Для работы с этими белками были отобраны 2 РНК-проводника: Бр9 (поскольку он высоко консервативен среди наиболее часто встречающихся генотипов ВГВ А—В) и БрП (поскольку он обладает самым высоким противовирусным действием, как в комбинации с НВх, так и без нее).

Для РНК-проводника БрП были проведены опыты по подбору оптимальных соотношений плазмид ВГВ, Сяб9 и НВх. В таблице на рисунке 4 представлены концентрации плазмид, использованные в опыте. Эксперименты показали, что самые значительные эффекты всех типов белков наблюдаются при внесении плазмид ВГВ и Сяб9 в соотношении 1:1 (0,3 мкг : 0,3 мкг) и при внесении наибольших количества НЬх белков (0,65 мкг) (рис. 4А).

Для РНК-проводника Бр9 была проведена раститровка различных количеств плазмид НВх, вносимых при котрансфекции. Исходя

О)

<п . X Е

So

л О ^ ч-а> <и

о со о и Е ее

12 3 4 НВх

12 3 4 HBxNESM

12 3 4 HBxMut

a

123456 123456 123456

НВх

HBxNESM

HBxMut

1 2 3 4

Плазмида ВГВ HBV plasmid 0,6 мкг (га) 0,5 мкг (И) 0,4 мкг (И) 0,3 мкг (И)

Плазмида Cas9 Cas9 plasmid 0,6 мкг (га) 0,5 мкг (И) 0,4 мкг (И) 0,3 мкг (И)

Плазмида НВх НВх plasmid 0,05 мкг (га) 0,25 мкг (И) 0,45 мкг (И) 0,65 мкг (И)

1 2 3 4 5 6

Плазмида ВГВ 0,2 мкг 0,2 мкг 0,2 мкг 0,2 мкг 0,2 мкг 0,2 мкг

HBV plasmid (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg)

Плазмида Cas9 0,2 мкг 0,2 мкг 0,2 мкг 0,2 мкг 0,2 мкг 0,2 мкг

Cas9 plasmid (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg)

Плазмида НВх 0 мкг 0,125 мкг 0,325 мкг 0,425 мкг 0,525 мкг 0,62 мкг

НВх plasmid (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg)

Рисунок 4. А) Подбор оптимальных соотношений кодирующих плазмид Cas9, НВх или мутантных форм (HBxmut, HBxNESM) и ВГВ с РНК-проводником Sp11 для достижения максимального противовирусного эффекта. Оптимальным было принято соотношение 4 с наименьшей нагрузкой плазмид ВГВ и Cas9 и наибольшими количествами вводимой плазмиды НВх (0,65 мкг). Б) Определение дозозависимых эффектов НВх белка дикого типа и мутантных форм НВх на противовирусное действие CRISPR/Cas9 систем на модели котрансфекции HepG2. HBxNesm и HBxmut действуют одинаково эффективно независимо от дозы. Для HBx дикого типа наблюдается некоторый дозозависимый эффект Figure 4. A) Search for optimal concentration of Cas9, wild type or mutant HBx and HBV encoding plasmids with RNA guide Sp11 for better antiviral efficacy. It was shown that optimal ratios of the plasmid concentration was experimental settings number 4. B) Analysis of dose-dependent effects of wild type HBx and mutant forms of HBx on CRISPR/Cas9 activity at the HepG2 co-transfection model. HBxNesm and HBxMut have the same antiviral activity independently of plasmids' concentration. Dose-dependent activity is observed for different concentrations of wild-type HBx plasmid Примечания. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям. Звездочками обозначены статистически достоверные отличия экспериментальных групп от группы 1. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Notes. The data are represented as mean ± standard deviation. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

из данных прошлого эксперимента, плазми-ды ВГВ к Cas9 брали в соотношении 1:1, а концентрации плазмид HBx были использованы следующие: 0,125; 0,325; 0,425; 0,525 и 0,62 мкг. При раститровке плазмид, кодирующих НЬх белки, выяснилось, что НBхNESM и HBxmut усиливают противовирусные эффекты нуклеаз даже при минимальной загрузке кодирующих

плазмид, тогда как для НBх белка дикого типа наблюдается некоторая тенденция к дозозави-симому эффекту (рис. 4Б).

Была проведена оценка влияния НBх белка дикого типа и мутантных форм НBх белка на пролиферацию и жизнеспособность клеток с разной загрузкой кодирующих плазмид (0,05; 0,25; 0,45; 0,65 мкг). Было выявлено, что исполь-

Пролиферация/Proliferation НВх

5,5 7,5 часы/hours

Пролиферация/Proliferation HBxMut

5,5 7,5 часы/hours

Пролиферация/Proliferation HBxNesm

5,5 7,5 часы/hours

1 ---2--3

Жизнеспособность/Viability НВх

5,5 7,5 часы/hours

Жизнеспособность/Viability HBxMut

5,5 7,5 часы/hours

Жизнеспособность/Viability HBxNesm

160

1,5 2 4,5 — Контроль/Control

5,5 7,5 часы/hours

Рисунок 5. Влияние НВх белков дикого типа и мутантных форм (HBxmut, HBxNESM) на пролиферацию (слева) и жизнеспособность (справа) клеток

Figure 5. Impact of the HBx proteins on viability and proliferation of the cells

Комментарий. Клетки HepG2 были трансфицированы разными количествами (1 — 0,05 мкг; 2 — 0,25 мкг; 3 — 0,45 мкг; 4 — 0,65 мкг) плазмид, кодирующих один из НВх белков. В то время как пролиферация клеток повышается практически при всех условиях, жизнеспособность клеток при трансфекции НВх, HBxmut и HBxNesm практически не изменяется. Comments. HepG2 cells were co-transfected with different concentration (1 — 0,05 ^kg; 2 — 0,25 ^kg; 3 — 0,45 ^kg; 4 — 0,65 |^kg) of HBx encoding plasmids. Prolifertaion of the cells increases and viability do not change.

зованные в экспериментах количества кодирующих НВх, НВхши и НВх№бш плазмид не вызывают изменения жизнеспособности клеток и практически не оказывают влияния на пролиферацию клеток НерС2 (рис. 5).

Обсуждение

Хронический гепатит В является неизлечимым заболеванием, который приводит к развитию цирроза и рака печени, ответственных за гибель более 1,4 млн человек ежегодно [7]. Поэтому необходима разработка подходов к эффективной и полной элиминации вируса и ключевой формы генома ВГВ, ккзДНК. Системы СЯ15РЯ/Са89 позволяют расщеплять матрицы ккзДНК, однако ни в одном из ранее опубликованных исследований разрушение 100% молекул ккзДНК достигнуто не было. Если предположить, что индукция мутаций в каждой из копий ккзДНК, присутствующих в клетке, технически возможна, всегда остаются риски того, что вирус может приобретать резистентность, оставаться транскрипцион-но активным и поддерживать репликативный цикл даже после внесения мутаций после репарации. Следовательно, применение СШБРЯ/ СаБ9 будет сопровождаться меньшей вероятностью реактивации вируса в тех условиях, когда репарация двуцепочечных разрывов в ккзДНК невозможна, а геном вируса подвергается деградации и удаляется из ядра. Одной из причин, по которым не все матрицы ккзДНК подвергаются расщеплению, является существование матриц ккДНК в суперскрученном состоянии. Существование матриц в подобной форме может затруднять их взаимодействие с системами СЯ15РЯ/Са89, поскольку белок СаБ9 обладает более низкой нуклеолитической активностью в отношении гетерохроматина [18] [19]. НВх белок — главный регулятор эпигенетического состояния ккзДНК, способный релаксировать ккзДНК и переводить ее в транскрипционно-

Список литературы/ЯеТегепсеБ

активную форму, более доступную для действия нуклеаз СЯ15РЯ/Са89 [2]. В данной работе был произведен скрининг ряда РНК проводников, нацеленных на геном вируса гепатита В в комбинации с белками НВх. Для ряда РНК-проводников не удалось добиться усиления противовирусного действия, однако в результате экспериментов были выявлены 11 РНК проводников, эффективность которых в комбинации с белком НВх дикого типа повышалась на 2—40%, позволяя при этом достигнуть снижения транскрипции вируса на 98%.

Помимо белка НВх дикого типа, были проанализированы эффекты мутантных белков НВхМи и НВхНББМ. Были определены оптимальные соотношения плазмид, кодирующих элементы систем СЯ15РЯ/Са89 и белков НВх, и оптимальное количество белка НВх, вызывающее самое сильное усиление противовирусного действия. Кроме того, было показано, что количества кодирующих НЬх, НЬхши и НВх№бш плазмид в выбранном диапазоне не вызывают изменения жизнеспособности и пролиферации клеток.

Несмотря на то что по результатам тестов на жизнеспособность и пролиферацию не было выявлено негативных эффектов НВх дикого типа, ввиду трансактивирующей способности НВх белка не исключено его взаимодействие с онкогенами и связывание с про- и антиапоп-тотическими факторами, а также образование активных форм кислорода в цитоплазме и, как следствие, индукция двуцепочечных разрывов ДНК в геноме человека [9, 20]. Более целесообразным представляется использование безопасных мутантных форм НВх которые позволят если не устранить, то минимизировать возможные побочные эффекты, усилив при этом эффективность действия СЯ15РЯ/Са89 на ккзДНК, включая высококонденсированные, гетерох-роматизированные формы ккзДНК, которые не распознаются или не расщепляются классическими вариантами СЯТ8РЯ/Са89 систем.

1. Allweiss L., Dandri M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses, 2017, vol. 9, no. 6:156. doi: 10.3390/v9060156

2. Belloni L., Pollicino T., De Nicola F., Guerrieri F., Raffa G., Fanciulli M., Levrero M. Nuclear HBx binds the HBV minichromosome and modifies the epigenetic regulation of cccDNA function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, vol. 106, no. 47, pp. 1997519979. doi: 10.1073/pnas.0908365106

3. Bock C.T., Schwinn S., Locarnini S., Fyfe J., Manns M.P., Trautwein C., Zentgraf H. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome. J. Mol. Biol, 2001, vol. 307, no. 1, pp. 183-196. doi: 10.1006/jmbi.2000.4481

4. Cha M.-Y., Kim C.-M., Park Y.-M., Ryu W.-S. Hepatitis B virus X protein is essential for the activation of Wnt/beta-catenin signaling in hepatoma cells. Hepatology, 2004, vol. 39, no. 6, pp. 1683-1693. doi: 10.1002/hep.20245

5. Dong C., Qu L., Wang H., Wei L., Dong Y., Xiong S. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nuclease efficiently inhibits viral replication. Antiviral Res., 2015, vol. 118, pp. 110-117. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.03.015

6. Forgues M., Marrogi A.J., Spillare E.A., Wu C.G., Yang Q., Yoshida M., Wang X.W. Interaction of the hepatitis B virus X protein with the Crml-dependent nuclear export pathway. J. Biol. Chem., 2001, vol. 276, no. 25, pp. 22797-22803. doi: 10.1074/jbc. M101259200

7. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis B virus infection — natural history and clinical consequences. N. Engl. J. Med., 2004, vol. 350, no. 11, pp. 1118-1129. doi: 10.1056/NEJMra031087

8. Geng X., Huang C., Qin Y., McCombs J.E., Yuan Q., Harry B.L., Xue D. Hepatitis B virus X protein targets Bcl-2 proteins to increase intracellular calcium, required for virus replication and cell death induction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, vol. 109, no. 45, pp. 18471-18476. doi: 10.1073/pnas.1204668109

9. Kim S., Lee H.-S., Ji J.-H., Cho M.-Y., Yoo Y.-S., Park Y.-Y., Cho H. Nuclear expression of hepatitis B virus X protein is associated with recurrence of early-stage hepatocellular carcinomas: role of viral protein in tumor recurrence. J. Pathol. Transl. Med., 2016, vol. 50, no. 3,pp. 181-189. doi: 10.4132/jptm.2016.03.18

10. Konerman M.A., Lok A.S. Interferon treatment for hepatitis B. Clin. Liver Dis., 2016, vol. 20, no. 4, pp. 645- 665. doi: 10.1016/ j.cld.2016.06.002

11. Liu Y., Zhao M., Gong M., Xu Y., Xie C., Deng H., Wang Z. Inhibition of hepatitis B virus replication via HBV DNA cleavage by Cas9 from Staphylococcus aureus. Antiviral Res., 2018, vol. 152, pp. 58- 67. doi: 10.1016/j.antiviral.2018.02.011

12. Lucifora J., Xia Y., Reisinger F., Zhang K., Stadler D., Cheng X., Volz T. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science, 2014, vol. 343, no. 6176, pp. 1221-1228.

13. Nassal M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut, 2015, vol. 64, no. 12, pp. 1972-1984. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309809

14. Ramanan V., Shlomai A., Cox D.B.T., Schwartz R.E., Michailidis E., Bhatta A., Bhatia S.N. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Sci. Rep., 2015, vol. 5:10833. doi: 10.1038/srep10833

15. Seeger C., Sohn J.A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Mol. Ther. Nucleic Acids, 2014, vol. 3: e216. doi: 10.1038/ mtna.2014.68

16. Seeger C., Sohn J.A. Complete spectrum of CRISPR/Cas9-induced mutations on HBV cccDNA. Mol. Ther., 2016, vol. 24, no. 7, pp. 1258-1266. doi: 10.1038/mt.2016.94

17. Shi H., Lu L., Zhang N.-P., Zhang S.-C., Shen X.-Z. Effect of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha on hepatitis B virus following lamivudine treatment. World J. Gastroenterol., 2012, vol. 18, no. 27, pp. 3617-3622. doi: 10.3748/wjg.v18.i27.3617

18. Uusi-Mäkelä M.I.E., Barker H.R., Bäuerlein C.A., Häkkinen T., Nykter M., Rämet M. Chromatin accessibility is associated with CRISPR-Cas9 efficiency in the zebrafish (Danio rerio). PLoS One, 2018, vol. 13, no. 4: e0196238-e0196238. doi: 10.1371/journal. pone.0196238

19. Verkuijl S.A., Rots M.G. The influence ofeukaryotic chromatin state on CRISPR-Cas9 editing efficiencies. Curr. Opin. Biotechnol., 2018, vol. 55,pp. 68-73. doi: 10.1016/j.copbio.2018.07.005

20. WHO. Global hepatitis report 2017. World Health Organization, 2017.

21. Yue D., Zhang Y., Cheng L., Ma J., Xi Y., Yang L., Xiang R. Hepatitis B virus X protein (HBx)-induced abnormalities of nucleic acid metabolism revealed by 1 H-NMR-based metabonomics. Sci. Rep., 2016, vol. 6: 24430. doi: 10.1038/srep24430

Авторы:

Брезгин С.А., младший научный сотрудник лаборатории вирусных гепатитов ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия; аспирант лаборатории № 73 клинической фармакологии ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, Москва, Россия; Костюшева А.П., младший научный сотрудник лаборатории вирусных гепатитов ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия;

Симирский В.Н., к.б.н., старший научный сотрудник Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия; Волчкова Е.В., д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней, зав. кафедрой инфекционных болезней медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ, Москва, Россия; Чистяков Д.С., лаборант ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ, Москва, Россия; Костюшев Д.С., научный сотрудник ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия; Чуланов В.П., д.м.н., зав. лабораторией вирусных гепатитов ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия; профессор кафедры инфекционных болезней медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ, Москва, Россия.

Поступила в редакцию 24.12.2018 Отправлена на доработку 11.03.2019 Принята к печати 13.03.2019

Authors:

Brezgin S.A., Junior Researcher, Laboratory of Viral Hepatitis, Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russian Federation; PhD Student, Laboratory of Clinical Pharmacology No. 73, Institute of Immunology FMBA, Moscow, Russian Federation; Kostyusheva A.P., Junior Researcher, Laboratory of Viral Hepatitis, Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russian Federation;

Simirskii V.N., PhD (Biology), Senior Researcher, Koltsov Institute

of Developmental Biology of RAS, Moscow, Russian Federation;

Volchkova E.V., PhD, MD (Medicine), Professor, Professor

of the Department of I nfectious Diseases, Head of the Department

of Infectious Diseases on Faculty of Preventive Medicine,

I.M. Sechenov Moscow State Medical University, Moscow, Russian

Federation;

Chistyakov D.S., Laboratory Technician, I.M. Sechenov Moscow State Medical University, Moscow, Russian Federation; Kostyushev D.S., Researcher, Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russian Federation; Chulanov V.P., PhD, MD (Medicine), Head of the Laboratory of Viral Hepatitis, Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russian Federation; Professor of the Department of Infectious Diseases, Faculty of Preventive Medicine, I.M. Sechenov Moscow State Medical University, Moscow, Russian Federation.

Received 24.12.2018 Revision received 11.03.2019 Accepted 13.03.2019