CC BY
63
обзоры
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДк 616.36-002.2-022:578.891]-092
Костюшев Д.С.1, Зуева А.П.12, Брезгин С.А.1'3, Липатников А.Д.1'4, Волчкова Е.В.3, МалеевВ.В.1,
Чуланов В.П.1'3
роль днк-метилтрансфераз в жизненном цикле вируса ГЕПАТИТА B
И ПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСкОГО ГЕПАТИТА B
1ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, 111123, г. Москва;
2ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», 119991, г. Москва;
3ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, 119991, г. Москва;
4ФГБОУ ВПО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», 125047, г. Москва
Хронизация гепатита B связана с образованием вирусом гепатита B (HBV) персистентной формы вируса, кольцевой ковалентно-замкнутой ДнК (ккзДнК). Стабильность ккзДнК связана с внутриядерной локализацией и образованием мини-хромосомы, регулируемой эпигенетическими механизмами. Одним из основных механизмов эпигенетической регуляции является метилирование ДнК по CpG-островкам. При хроническом гепатите B уровни экспрессии ДнК-метилтрансфераз значительно повышены. Тем не менее роль ДнК-метилтрансфераз в жизненном цикле HBV и их действие на клетку остаются малоизучеными. В этом обзоре представлены передовые достижения в изучении роли ДнК-метилтрансфераз при хроническом гепатите B и на моделях HBV in vitro.
Ключевые слова: обзор; вирус гепатита B; хронический гепатит B; ДНК-метилтрансферазы; транскрипция; метилирование; генотипы.
Для цитирования: Костюшев Д.С., Зуева А.П., Брезгин С.А., Липатников А.Д., Волчкова Е.В., Малеев В.В., Чуланов В.П. Роль ДНК-метилтрансфераз в жизненном цикле вируса гепатита B и патогенезе хронического гепатита B. Вопросы вирусологии. 2018; 63(1): 19-29. DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-1-19-29
Kostyushev D.S.1, Zueva A.P12, Brezgin S.A.13, Lipatnikov A.D.14, Volchkova E.V.3, Maleyev V.V.1,
Chulanov V.P.13
THE ROLE OF DNA-METHYLTRANSFERASES IN THE LIFE CYCLE OF HEPATITIS B VIRUS AND
PATHOGENESIS OF CHRONIC HEPATITIS B
1 Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, 111123, Russian Federation;
2 M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, 119991, Russian Federation;
3 I.M. Sechenov First State Medical University, Moscow, 119048, Russian Federation;
4 D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, 125047, Russian Federation
Chronic hepatitis B is caused by a persistent form of hepatitis B virus, covalently closed circular DNA (cccDNA). Stability of cccDNA is associated with intracellular localization of cccDNA and formation of minichromosome, regulated by epigenetic mechanisms. One of the key mechanisms in epigenetics is methylation of DNA on CpG islands. Expression levels of DNA-methyltransferases (DNMTs) in chronic hepatitis B patients were shown to be upregu-lated. Nevertheless, the role of DNMTs in the life cycle of HBV and their effects on the cell remain elusive. In this review, we discuss latest achievements on the role of DNMTs in chronic hepatitis B and HBV in vitro models.
K e y w o r d s: hepatitis B virus; chronic hepatitis B; DNA-methyltransferases; y-H2AX; transcription; HBsAg; methylation; genotypes.
For citation: Kostyushev D.S., Zueva A.P., Brezgin S.A., Lipatnikov A.D., Volchkova E.V., Maleyev V.V., Chulanov V.P. The role of DNA-methyltransferases in the life cycle of hepatitis B virus and pathogenesis of chronic hepatitis B. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2018; 63(1): 19-29. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-1-19-29
For correspondence: Dmitriy S. Kostyushev, junior scientist, Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, 111123, Russian Federation. E-mail: [email protected] Information about authors:
Kostyushev D.S., http://orcid.org/0000-0002-1851-7441; Volchkova E.V., http://orcid.org/0000-0003-4581-4510; Maleyev V.V., http://orcid.org/0000-0002-8508-4367; Chulanov V.P., http://orcid.org/0000-0001-6303-9293 Acknowledgment. This work was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 16-15-10426). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 16 April 2017 Accepted 20 June 2017
Введение padnaviridae, род Orthohepadnaviridae, и характеризует-
Гепатит В — тяжелое заболевание, вызываемое виру- ся высокой ткане- и видоспецифичностью, уникальной сом гепатита В (НВУ). НВУ относится к семейству Не- организацией генома и механизмом репликации. Суще-
Для корреспонденции: Костюшев Дмитрий Сергеевич, мл. науч. сотр., ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, 111123, г. Москва. E-mail: [email protected]
reviews
Рис. 1. Жизненный цикл ИВУ ккзДНК является матрицей для транскрипции всех РНК ИВУ, включая пгРНК. ЭПР — эндоплазматический ретикулум.
ствует 9 генотипов HBV (A — I), различие в нуклеотид-ных последовательностях между разными генотипами составляет около 8% [1].
По всему миру более 350 млн человек страдают от хронического гепатита B (ХГВ), который является причиной гибели более 1 млн человек ежегодно, что связано с исходами заболевания, такими как цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома [2]. Несмотря на наличие эффективных программ вакцинации, ни один из современных методов терапии не приводит к полному излечению пациентов с ХГВ. Непосредственной причиной хронической инфекции и персистенции вируса в клетке является особая форма генома HBV, кольцевая ковалентно-замкнутая ДНК HBV (ккзДНК) (рис. 1) [3]. Матрицы ккзДНК способны в течение неограниченного срока находиться в ядре гепатоцитов и поддерживать репликацию вируса. ккзДНК существует в виде мини-хромосомы в комплексе с белками вируса, гистоновыми и негистоновыми белками клетки (рис. 2) [4].
ДНК-метилтрансферазы (ДНМТ) гиперэкспрессиру-ются при инфицировании клеток HBV in vitro [5] и in vivo в гепатоцитах пациентов с ХГВ [6]. Увеличение уровней продукции ДНМТ обычно связывают с неспецифическим противовирусным ответом клетки. Действительно, ДНМТ могут метилировать ДНК HBV, подавлять транскрипцию вирусных мРНК и репликацию HBV [7, 8]. Длительная активация ДНМТ приводит к высокой частоте метилирования генома клеток, а также дисрегуляции многочисленных внутриклеточных процессов, связанных с трансформацией клеток и развитием рака.
В этом обзоре мы рассматриваем последние данные о механизмах активации ДНМТ, влиянии ДНМТ на жизненный цикл вируса, различиях в профилях метилирования ккзДНК среди разных генотипов ИВУ, действии ДНМТ и ИВУ на генетическую стабильность клеток и перспективах применения результатов исследований, касающихся метилирования ккзДНК, в разработке методов лечения ХГВ. В обзоре использованы как данные наиболее значимых работ, посвященных ИВУ, так и наши экспериментальные данные.
жизненный цикл и структура ИБУ
ИВУ — ДНК-содержащий вирус млекопитающих. Основная форма генома представляет собой релаксиро-ванную кольцевую частично двухце-почечную ДНК (кчдДНК), размер которой составляет примерно 3,2 кб (см. рис. 2). Цепи ДНК асимметричны, что является уникальной особенностью гепаднавирусов: цепь с негативной полярностью является полноразмерной, положительная цепь ДНК ИВУ имеет размер 1100—2600 нуклеотидов (нт). Незавершенная плюс-цепь всегда содержит одинаковый 5'-конец, в то время как З'-конец обычно вариабелен и может иметь разную длину. 5'-концы обеих цепей содержат прямые повторы и регионы коротких повторяющихся последовательностей, которые являются ключевыми для репликации вирусного генома.
Минус-цепь незамкнута, содержит небольшой избыточный регион длиной 8—10 нт, к которому прикреплена субъединица полимеразы. Плюс-цепь кэпирована олигорибонуклеотидом на 5'-конце [9].
Образование ккзДНк
Точный механизм синтеза ккзДНК пока изучен недостаточно. Для конверсии кчдДНК в ккзДНК необходима разборка нуклеокапсида и транспорт кчдДНК в ядро. Депротеинизированная форма кчдДНК является функциональным предшественником ккзДНК. Завершение синтеза плюс-цепи ДНК — важный шаг, ведущий к де-протеинизации генома и структурным изменениям ну-клеокапсида (табл. 1).
Таблица 1
Этапы конверсии кчдДНк в ккзДНк
Этапы
События в процессе конверсии кчдДНК в ккзДНК
Удаление Р-белка с 5'-конца минус-цепи ДНК
Удаление короткого РНК-олигомера, используемого для синтеза плюс-цепи ДНК
Удаление части минус-цепи ДНК с концевой избыточностью
Лигирование цепей ДНК
1
2
3
4
обзоры
Рис. 2. Эпигенетическая регуляция активности ккзДНК HBV. ДНК вируса гепатита B может интегрироваться в геном гепатоцитов и формировать минихромосомы ккзДНК в ядре. ккзДНК служит матрицей для вирусной транскрипции, образования ДНК и продукции белков вируса. Активность ккзДНК и интегрированной формы ДНК вируса гепатита B регулируется эпигенетическими механизмами клетки (HDAC1, ДНМТ) и белками вируса (HBx, HBc).
Сигналы ядерной локализации (NLS) на C-концах HBc-белка обеспечивают взаимодействие капсида с клеточными кариоферинами и способствуют импорту депротеинизированной формы кчдДНК в ядро для образования ккзДНК [4]. Синтезированная de novo ккзДНК ассоциируется с гистонами и существует в виде мини-хромосомы. Обычно в ядре гепатоцита находится до 50 копий ккзДНК, в то время как число копий ккзДНК на моделях HBV в культурах клеток человека in vitro, обычно используемых для изучения цикла и действия противовирусных препаратов, оказывается значительно ниже [10].
Геном эукариот представляет собой плотно упакованный хроматин, единицей строения которого является нуклеосома. Каждая нуклеосома состоит из гистоновых белков (по 2 копии каждого из 4 гистонов: H2A, H2B, H3 и H4 в одной нуклеосоме) и 200 пар оснований ДНК. ккзДНК также имеет нуклеосомную организацию и ассоциирована с гистоновыми и негистоновыми белками. Она формирует в ядре типичную структуру «бусин на нитке» и существует в виде минихромосомы. Известно, что в структуру минихромосомы входят HBc и HBx [11] (см. рис. 2). Также подтверждено наличие факторов транскрипции клетки CREB, YY1, STAT1 и STAT2, а также хроматинремоделирующих факторов PCAF, p300/
CBP, HDAC1, SIRT1 и EZH2 [12]. HBc в структуре минихромосомы связывается с двухцепочечной ДНК вируса, что приводит к уменьшению расстояния между нуклеопротеиновыми комплексами на 10%. Как и в хроматине клетки, характер модификации гистонов и расположение нуклеосом играют важную роль в регуляции транскрипции [13].
Регуляция активности ккзДНк
Поскольку ккзДНК существует в виде мини-хромосомы, ее транскрипционная активность регулируется эпигенетическими механизмами. Гистоновые и не-гистоновые белки напрямую или за счет белок-белковых взаимодействий связываются с ДНК вируса (рис. 3). Как и в ДНК клетки, ацетилирование гистонов может регулировать транскрипционную активность ккзДНК. T. Pollicino и соавт. [11] подтвердили справедливость этого утверждения как на модельных системах in vitro, так и in vivo в печени хронически инфицированных пациентов, используя технологию ChiP и антитела к ацети-лированным формам H3 и H4. Высокая активность аце-тилтрансфераз PCAF и p300/CBP форсирует вирусную репликацию, в то время как привлечение гистондеаце-тилаз HDAC1 к ккзДНК, напротив, обеспечивает низкий уровень репликации in vitro. Чтобы экспериментально
reviews
подтвердить это, были использованы ингибиторы гисто-новых деацетилаз I и III класса — трихостатин A и ни-котинамид соответственно. Обработка этими факторами приводит к ацетилированию гистона H4 и повышению уровня репликации HBV. Таким образом, было высказано предположение, что подавление репликации вируса происходит по уже известным механизмам ремоделиро-вания хроматина.
Помимо посттрансляционных модификаций гистонов, ДНК HBV и, в частности, ккзДНК может регулироваться метилированием по CpG-островкам. Механизмы активации ДНМТ и особенности метилирования генома HBV будут рассмотрены ниже. Отметим, что функционально активация экспрессии ДНМТ при инфицировании HBV может быть связана с неспецифическим противовирусным ответом инфицированных клеток на проникновение вируса. ккзДНК, единственная матрица для считывания РНК HBV, гиперметилируется по CpG-островкам, при этом подавляется транскрипция и репликация. Помимо этого, неблагоприятным исходом активации ДНМТ является метилирование генома гепатоцитов пациентов с ХГВ, что может негативно влиять на экспрессию функционально значимых генов, приводить к дисрегуляции клеточной деятельности, а также способствовать повреждению ДНК клетки. В целом кумулятивный эффект факторов HBV per se и активации ДНМТ, в частности, усугубляет повреждение генома клеток и ускоряет процессы, связанные с развитием фиброза и гепатоцеллю-лярной карциномы. Кроме того, метилирование ккзДНК может рассматриваться как один из механизмов формирования эпигенетически репрессированных молекул ккзДНК. Таким образом, ДНМТ могут участвовать в персистенции вирусной инфекции.
HBV стимулирует экспрессию ДНМТ
Процессы конденсации хроматина ккзДНК имеют ключевое значение в регуляции экспрессии вирусных РНК и продукции вирусных белков. Степень компакти-зации ккзДНК определяется эпигенетическими модификациями ккзДНК и связанных с ней белков. Именно она определяет доступность ккзДНК для регуляторных факторов транскрипции.
Метилирование — распространённый механизм защиты клеток эукариот в ответ на проникновение чужерод-
ной ДНК и вирусных геномов. Многие промоторы генов в геноме клеток и вирусов богаты CpG-динуклеотидами или группами CpG-динуклеотидов, так называемыми CpG-островками. Метилирование цитидина в островках CpG подавляет экспрессию генов и способствует гете-рохроматизации.
ДНК-метилирование происходит за счет действия ДНМТ, непосредственных эффекторов, которые осуществляют ферментативное присоединение метильных групп к цитидину, и метил-CpG-связывающих белков, роль которых сводится к распознаванию паттернов метилирования [14]. Семейство ДНМТ состоит из ДНМТ1, ДНМТ2, ДНМТ3А, ДНМТ3В и ДНМТЗ^ ДНМТ1 относится к поддерживающим ДНК-метилтрансферазам. В процессе деления клеток ДНМТ1 метилирует геми-метилированные островки CpG. ДНМТ3А и ДНМТ3В являются de novo ДНК-метилтрансферазами, они могут метилировать как неметилированные, так и гемимети-лированные островки CpG. ДНМТ2 и ДНМТ3L не способны к метилированию ДНК, но выполняют другие важные функции [15].
Ранее было установлено, что инфицирование клеток HBV стимулирует экспрессию ДНМТ, в особенности ДНМТ3А/В и ДНМТ1. Более высокие уровни экспрессии ДНМТ детектируются в гепатоцитах пациентов с ХГВ в сравнении с контрольной группой [16]. Последние исследования убедительно показали, что профиль метилирования островков CpG в ккзДНК и, следовательно, активность вирусного цикла связаны с репликацией вируса и активностью ДНМТ. Метилированные геномы HBV обнаружены в сыворотке и биоптатах печени пациентов с ХГВ. Все больше сведений указывает на то, что увеличение экспрессии ДНМТ может быть частью неспецифического анти-HBVответа клетки хозяина, т. е. частью внутриклеточной иммунной системы. Предыдущие работы показали, что метилирование ДНК HBV снижает вирусную мРНК, продукцию вирусного белка и прегеномной РНК (пгРНК) [17]. На клетках гепатомы человека HepG2 in vitro было показано, что через 2—4 сут после инфицирования HBV в клетках наблюдается увеличение уровней экспрессии ДНМТ [18]. В наших работах также было показано, что на модели клеток HepG2, трансфицированных плазмидой с геномом 1.1merHBV, HBV индуцирует экспрессию ДНМТ1
Рис. 3. Посттрансляционные модификации гистонов в ккзДНК HBV. ChIP-Seq-анализ ккзДНК с маркёрами эухроматина (H3K4me3, H3K27ac, H3K36me3, H3K122ac) и гетерохроматина (H3K9me3, H3K27me3) на первичных гепатоцитах пациента с HBV (а), инфицированной HBV печени человека (б) и клетках HepG2-NTCP с HBV (в).
обзоры
HepG2
ДНМТ1
doxyHepG2 +
HBV1.1
ДНМТЗА
Рис. 4. Повышение уровней экспрессии генов ДНМТ1 и ДНМТ3А при репликации НБУ HepG2: клетки гепатомы; HepG2 + HБV1.1: клетки HepG2, трансфицированные геномом HБV1.1; doxyHepG2 + HБV1.1: клетки HepG2, трансфицированные геномом HБV1.1 с активным промотором tet-on.
и ДНМТ3А в различной степени и с разной динамикой (рис. 4) [19]. Белок HBx HBV участвует в многочисленных внутриклеточных процессах, а именно в регуляции транскрипции HBV, контроле за степенью гетерохрома-тизации ккзДНК. Отмечена роль HBx-белка в трансформации клеток, регуляции клеточного цикла, апоптоза и пр. Продукция HBx в клетках per se, т. е. без активной инфекции HBV на модели трансфекции, стимулирует продукцию ДНМТ и усиливает метилирование CpG-островков в геноме клеток [19]. При этом белок HBx может как напрямую активировать экспрессию ДНМТ1 и ДНМТ3А/В [20], так и действовать на процессы ДНК-метилирования опосредованно, за счет привлечения ДНМТ к промоторам генов [21]. Y. Zhu и соавт. [22] показали, что трансфекция клеток HepG2 плазмидой, кодирующей HBx, приводит к 1,5- и 1,7-кратному повышению экспрессии ДНМТ1 и ДНМТ3А соответственно.
На нашей модели HepG2-1.1merHBV, трансфицированной HBx, при активации цикла HBV происходит 2,5-кратная (p < 0,01) индукция экспрессии ДНМТ1. Экспрессия ДНМТ3А также усиливается, но не достигает статистической значимости. Следовательно, результаты наших и других исследований продемонстрировали, что экспрессия ДНМТ1 и ДНМТ3А усиливается в клетках, инфицированных HBV. Ключевым фактором гиперэкспрессии ДНМТ является HBx-белок HBV [6].
Метилирование ДНК HBV
Метилирование CpG-островков ДНК HBV способствует уменьшению продукции вирусных белков. Гиперметилирование островков CpG ДНК HBV подавляет синтез HBsAg [23] и снижает уровень экспрессии HBeAg [24]. Трансфекция метилированной формы ДНК HBV в клетки HepG2 приводит к снижению уровня экспрессии мРНК вируса, а также образования HBsAg
и HBcAg [25]. Котрансфекция ДНК HBV с ДНМТ3А (ДНК-метилтрансферазой) ассоциирована со снижением продукции HBsAg и HBeAg [18].
HBx может подавлять транскрипцию HBV, в том числе привлекая к минихромосоме белки ДНМТ1, ДНМТ3А1 и ДНМТ3А2. Доказано, что HBx вызывает эпигенетические изменения, включая изменения в метилировании ДНК, модификацию гистонов, а также экспресию ми-кроРНК [19]. HBx может снижать экспрессию ДНМТ3А, индуцируя образование miR-101 [26]. Таким образом, HBx обеспечивает эпигенетический контроль ккзДНК, регулируя взаимодействие хроматин-ремоделирующих белков с ДНК HBV.
Метилирование последовательностей ДНК HBV, интегрированных в геном клеток, было впервые описано более 20 лет назад в работах R. Miller и W. Robinson [27]. Кроме того, анализ статуса метилирования эписомаль-ных форм генома HBV показал, что неинтегрирован-ные формы также могут метилироваться в гепатоцитах пациентов и на моделях HBV in vitro [28]. Важно, что метилированию подвергается ккзДНК HBV. Таким образом, регулируется образование всех видов мРНК HBV, включая пгРНК.
В целом метилирование ДНК является CpG-специфичным, поэтому плотность и расположение CpG-динуклеотидов и CpG-островков может напрямую влиять на возможность и степень метилирования генома HBV. Как показано ранее, большинство изолятов HBV содержат 3 CpG-богатых региона. Островок I перекрывается с областью начала S-гена, островок II охватывает регионы энхансера I и промотора Х-гена, а островок III находит-
Рис. 5. Распределение CpG-островков в геноме HBV различных генотипов.
Вертикальная ось соответствует процентной доле GC, горизонтальная относится к нуклеотид-ной последовательности генома ИБУ CpG-островки I, II и III выделены серым цветом. Отдельные вертикальные линии обозначают CpG-динуклеотиды [32 с модификациями].
reviews
Таблица 2
Расположение и размер трёх традиционных и новых островков CpG в нуклеотидных последовательностях HBV различных генотипов
Гено- CpG-островок I CpG-островок II CpG-островок III Новые CpG-островки
тип локализация, нт средний размер. нт локализация, нт средний размер, нт локализация, нт средний размер, нт локализация, нт средний размер, нт
A 94—303 151 1215—1671 424 2276—2460 149 —
B 109—289 121 1175—1679 444 2298—2462 146 300—633; 1926—2043 109
C 60—626 124 1035—1732 442 2121—2458 162 2874—2989 105
D 94—288 110 1205—1671 419 2250—2458 150 467—589 122
E 184—577 102 1223—1673 409 2334—2456 122 — —
F — — 1202—1672 347 2257—2462 153 1921—2038 111
G 186—297 111 1663—1906 466 2341—2494 145 — —
H 332—436 105 1106—1728 518 2336—2464 120 1933—2035 103
I 98—283 138 1248—1678 422 2252—2456 186 — —
J — — 1111—1671 561 2335—2446 112 — —
ся в регионе промотора Sp1 и старт-кодона Р-гена [29, 30]. Роль островков I и III в регуляции ИВУ остается не совсем ясной. Низкая плотность CpG в островке I обусловливает слабое влияние метилирования островка на регуляцию вирусного цикла. Значительных корреляций между состоянием метилирования островка III и циклом ИВУ также выявлено не было. Напротив, метилирование островка II подавляет транскрипцию S-гена и коррелирует с низким уровнем продукции или отсутствием ИВ-sAg. Предполагается, что гиперметилирование островка II может также подавлять транскрипцию рге-С/С-гена и снижать продукцию HBeAg [24].
Работы двух групп исследователей, изучавших образцы от пациентов с ХГВ из Азии, подтвердили, что метилирование ккзДНК происходит в большинстве клинических образцов и негативно влияет на репликацию ИВУ. В отличие от этого изучение статуса метилирования ДНК
%
[ | Изоляты без островка I
[2] Изоляты с тремя классическими Срв-островками (без новых Срв-островков)
И Изоляты с новыми Срв-островками
Рис. 6. Доля геномов ИВУ А—J без СрО-островка I, с тремя традиционными СрО-островками, с новыми СрО-островками.
HBV с образцами из Франции показало, что геном HBV редко становится мишенью ДНК-метилтрансфераз в образцах печени от пациентов с XrB [31]. Только 14% метилирования происходит по островку I, 0,6% — по островку II и 3,7% — по островку III. Причиной противоречивых результатов может быть высокая генетическая гетерогенность геномов HBV и как следствие неоднородное распространение CpG-островков у пациентов из разных регионов (рис. 5). Известно, что в Азии преобладают генотипы B и C HBV, в то время как во Франции — генотипы A и D, более типичные для остальной части Европы [1].
На основании допущения, что степень метилирования ккзДНК может сильно варьировать среди разных генотипов HBV, Y. Zhang и соавт. [31] методом компьютерного анализа изучили различия в плотности CpG-динуклеотидов среди генотипов HBV (табл. 2; рис. 6). В результате оказалось, что 45% последовательностей HBV содержат 3 традиционных CpG-островка, тогда как 47% последовательностей HBV содержат только 2 островка (II и III). Предположительно низкая плотность CpG-динуклеотидов в некоторых генотипах оказывается слишком низкой в островке I. В отличие от островка I области островков II и III более консервативны среди генотипов. Помимо этого Y. Zhang и соавт. обнаружили 3 новых островка CpG, названные IV, V и VI соответственно. Островок IV обнаружен в геноме HBV генотипов B, C и D, он расположен между островками I и II, перекрывается с S- и P-генами. Островок V выявлен в геноме HBV генотипов B, H и F, расположен между энхансером II и кор-промотором и sp1, перекрываясь с C-геном. Островок VI идентифицирован в геноме HBV генотипа C, располагается в sp2, перекрывается с preS1 и P-генами. Вероятно, эти островки также могут являться мишенями для метилирования ДНК, однако их роль в регуляции цикла HBV остается неизученной. Возможно, гиперметилирование островка V может блокировать инициацию транскрипции С-гена, а метилирование островка VI подавлять экспрессию мРНК 2.1 [31].
Распределение CpG-островков различается между генотипами HBV. Это говорит о том, что метилирование ДНК может регулировать транскрипцию HBV в различной степени у различных генотипов. Данным открытием можно объяснить противоречивые результаты различ-
обзоры
Прегеномная РНК
Суммарная ДНК HBV
GFP+ HBV1.1
doxyGFP + HBV1.1 doxyHBV1.1 + ДНМТЗА
2.5 1,8
1.6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2
О
- i F i x
* x
- * » ç
с
Л s s. x
GFP ДНМТ1 ДНМТЗА ДНМТ1/3
1 сут
GFP ДНМТ1 ДНМТЗА ДНМТ1/3
3 сут
ккзДНК
La
Ы
GFP
ДНМТ1 ДНМТЗА ДНМТ1/3
1 сут
GFP ДНМТ1 ДНМТЗА ДНМТ1/3
3 сут
Внутриклеточный HBs-антиген
GFP
doxyGFP
ДНМТЗА
г
К
1 2,51 а>
& 2-
О ^
m 1,5 H
к го
5 1
¡0,5 H
Транскрипция HBV
H ï R
\ *
\ * rfi
\ ?
\ \ *
\ * \
GFP ДНМТ1 ДНМТЗА ДНМТ1/3
1 сут Прегеномная РНК
GFP ДНМТ1 ДНМТЗА ДНМТ1/3
3 сут
3 мРНК S-антигена
Рис. 7. Влияние ДНМТ1 и ДНМТ3А на цикл вируса гепатита B.
а: ДНМТ3А полностью блокирует экспрессию прегеномной РНК на модели котрансфекции (GFP + HBV1.1 — неактивный контроль; doxyGFP + HBV1.1 — активный контроль; doxyHBVl.1 + ДНМТЗА — клетки с активным циклом HBV, трансфицированные ДНТМЗА); б: изменение суммарной ДНК HBV при трансфекции ДНМТ1, ДНМТЗА и котрансфекции ДНМТ1/3А; в: трансфекция ДНМТЗА увеличивает пул ккзДНК в клетках HepG2-1.ImerHBV с интегрированным геномом HBV1.1; г: трансфекция ДНМТ1, ДНМТЗА или котрансфек-ция ДНМТ1/ЗА подавляет экспрессию S-РНК HBV; д: трансфекция ДНМТЗА снижает продуцию HBs-антигена.
ных исследований, в которых анализировали метилирование HBV ДНК на HBV различных генотипов.
Влияние метилирования генома HBV на жизненный цикл вируса
ДНМТЗА/B и ДНМТ1 могут напрямую связываться с ккзДНК. Метод анализа ChIP-ПЦР показал, что количество ккзДНК, связавшееся с ДНМТ, значительно возрастает к 3—4-м суткам после инфицирования клеток Huh7 в культуре [32]. Следовательно, HBV стимулирует продукцию ДНМТ, которые в свою очередь связываются с матрицами ккзДНК, метилируют геном HBV по CpG-островкам и подавляют транскрипцию.
Хотя влияние трансфекции ДНМТ3А на транскрипцию HBV было изучено ранее [18], мы впервые показали, что трансфекция ДНМТ1, ДНМТ3А и котрансфек-ция ДНМТ1/ДНМТ3А ингибируют продукцию ДНК HBV и влияют на размер пула ккзДНК. К 3-м суткам после трансфекции клеток HepG2-1.1merHBV плазми-дами, кодирующими соответствующие ДНМТ, уровень ДНК HBV снижался примерно на 40% (p < 0,05) во всех вариантах трансфекции, при этом транскрипция S-РНК
снижалась наиболее заметно, сокращаясь на 40—50% (p < 0,01). Экспрессия пгРНК снижалась не так существенно, примерно на 25%, но статистически недостоверно. Из этого следует, что ДНМТ1, ДНМТЗА и ко-трансфекция ДНМТ1/ДНМТЗА подавляют транскрипцию и репликацию HBV (рис. 7).
В свою очередь при более детальном исследовании влияния гиперэкспрессии ДНМТ на уровни ккзДНК на модели HepG2-1.1merHBV с помощью высокочувствительного метода детекции ккзДНК после обработки ферментом Plasmid-Safe DNase [19] было установлено, что ДНМТ1 не влияет на размер пула ккзДНК, однако ДНМТЗА, напротив, значительно увеличивает пул ккзДНК. Трансфек-ция клеток HepG2-1.1merHBV плазмидой, кодирующей ДНМТЗА, вызывает примерно 2,5-кратное увеличение пула ккзДНК уже в 1-е сутки после трансфекции. Возрастание пула ккзДНК сохраняется на З-и сутки после трансфекции (увеличение примерно в 2 раза) (p < 0,005).
В своих работах мы показали, что трансфекция ДНМТ1 и ДНМТЗА значительно подавляет не только уровни экспрессии S-РНК, но также уровни ДНК HBV, и вместе с этим трансфекция ДНМТЗА удваивает пул ккзДНК в
reviews
Таблица 3
Эффекты пролонгированной гиперэкспрессии ДНМТ при ХГВ
Позитивные эффекты
Негативные эффекты
Подавление транскрипции и репликации HBV
Образование персистентного пула ккзДНК:
• метилирование СрО-островков ккзДНК стимулирует модификацию гистонов мини-хромосом и усиление компактизации ккзДНК.
Повреждение генома и риск трансформации клеток:
• дизрегуляция экспрессии генов, многие из которых участвуют в развитии гепато-целлюлярной карциномы;
• повреждение генома клеток (индукция разрывов хромосом).
Метилирование промоторов генов в геноме гепатоцитов:
• затрудняет регенерацию печени;
• увеличивает повреждение гепатоцитов, связанное с ИВУ;
• способствует развитию цирроза.
сравнении с контролем. Как было сказано выше, метилирование островков СрО в геноме ккзДНК может служить одним из механизмов, ответственных за персистентность ИВУ. Мы предполагаем, что длительная гиперэкспрессия ДНМТЗА может играть определенную роль в образовании персистентного пула ккзДНК и участвовать в хронической инфекции ИВУ.
Метилирование генома клетки при инфекции HBV
Как было сказано выше, ИВх-белок ИВУ индуцирует экспрессию ДНМТ1, ДНМТЗА/В и других ДНК-метилтрансфераз. Поскольку ДНМТ не действуют на ДНК ИВУ селективно, увеличение уровней продукции ДНМТ приводит к метилированию генома инфицированных клеток, в частности промоторов некоторых генов-супрессоров опухолей [18]. Вместе с этим ДНМТ могут метилировать промотор иРА, ключевого регулятора ИОЕ Метилирование промотора иРА наблюдается в 99,7% случаев у пациентов с ХГВ. Гипоактивация HGF затрудняет регенерацию печени и способствует развитию фиброза [34]. Другой механизм действия ИВх заключается в связывании ДНМТЗА напрямую. В норме ДНМТ3А связана с регионами генов IGFBP3 и CDH6. В присутствии ИВх ДНМТ3А диссоциирует с промотором этих генов, повышая экспрессию Ю-FBP3 и CDH6 [21].
формации клеток и развитии рака. Гепатоцеллюлярная карцинома, одно из самых тяжёлых и распространённых последствий XrB, характеризуется большой нестабильностью генома в некоторых участках хромосом [35]. Известно, что HBx-белок играет важную роль в канцерогенезе при хронической инфекции HBV. Этот белок относят к многофункциональным трансактиваторам, его влияние распространяется на репликацию вируса, регуляцию транскрипции как ккзДНК, так и многих генов клетки, прогрессирование клеточного цикла, репарацию ДНК, апоптоз (может служить как проапоптотическим, так и антиапоптотическим фактором) и стабильность генома [36]. HBx-белок участвует в дупликации центросом, вызывает аберрантное формирование веретена деления, неправильную агрегацию хромосом при митозе и повышает риски анеуплоидии. Цитоплазматический HBx-белок индуцирует оксидативный стресс, продукцию активных форм кислорода (АФК) и повреждение генома клеток. Так, в экспериментах in vitro с белком HBx с сигналом ядерной локализации образования АФК не происходит (рис. 8). Напротив, HBx-белок с сигналом ядерного экспорта вызывает значительное образование АФК и индуцирует образование у-ШАХ-фокусов (фокусов фосфорилированного гистона H2AX, ассоциированного с двухцепочечными разрывами генома) [35]. Позитивные и негативные аспекты гиперэкспрессии ДНМТ представлены в табл. 3.
Недавно в масштабном исследовании с использованием ядерно-магнитно-резонансной метаболомики было исчерпывающе изучено действие HBx на метаболизм клеток HepG2 и SK-HEP-1. Эписомальная продукция HBx в клетках нарушает метаболизм глюкозы, липидов, амино-
Нестабильность генома при инфекции HBV: действие HBx и ДНМТ
Нестабильность генома играет ключевую роль в злокачественной транс-
Рис. 8. Вирус гепатита В вызывает образование фокусов гистона у-И2АХ, ассоциированного с двухцепочечными разрывами ДНК. а: только цитоплазматический белок ИВх, но не внутриядерный ИВх (HBx-NLS) вызывает образование фокусов у-И2АХ (ярко-белые фокусы в ядре) [36 с модификациями]; б: процентная доля клеток с у-ШАХ-фокусами, трансфицированными ИВх^Е8 и HBx-NLS [36 с модификациями]; в: образование фокусов у-ШАХ в клетках HepG2-1.1merHBV с активным циклом ИВУ, транс-фицированных ДНМТ1 или ДНМТ3А; г: окрашивание гепатоцитов пациента с хроническим гепатитом В на у-ШАХ гистон (стрелками указаны фокусы у-ШАХ); д: среднее число фокусов на клетку в гепатоцитах человека без заболеваний печени (З), пациента с ХГВ (В) и пациентов с ХГВ и коинфекцией вирусом гепатита дельта (В + Б).
обзоры
48 ч
72 ч
Необработанные
Ad-N
Ad-HBx
Рис. 9. Генотоксическое действие НВх-белка НБУ а: хромосомные разрывы в клетках HepG2, инфицированных плазмидами с Ad-HБx и контролем Ad-N. Слева представлены изображения метафаз-ных хромосом. Стрелки указывают на разрывы в хромосомах. Справа приведены процентные доли хромосомных разрывов; б: повреждение ДНК в клетках HepG2 по длине ДНК-комет. Слева представлены изображения ДНК-комет, справа — длина хвостов ДНК в процентах; в: результаты вестерн-блоттинга НВх, Н2АХ и у-Н2ДХ в клетках HepG2 после обработки Ad-HBx и Ad-N. Слева представлены флюоресцентные изображения, справа —
расчёт среднего числа фокусов у-ШАХ на клетку.
кислот и особенно нуклеиновых кислот и синтез ДНК. Установлено, что значительные изменения происходят в экспрессии 966 генов, экспрессия 381 усилена более чем в 2 раза, а экспрессия еще 585 генов снижается примерно в 2 раза в сравнении с контролем. В той же работе продукция HBx-белка индуцирует масштабные хромосомные аберрации (рис. 9). Доля клеток с разрывами хромосом в метафазе составила 21,67 ± 2,89 и 26,67 ± 2,89% через 48 ч после трансдукции HepG2 и SK-HEP-1 соответственно. Через 72 ч после трансдукции эти значения составляли 15,00 ± 5,00 и 16,67 ± 5,77%. Кроме того, увеличивается как общее повреждение ДНК, продемонстрированное с помощью оценки длины хвостов комет (comet assay), так и число двухцепочечных разрывов по окраске на фосфори-лированный гистон у H2AX. Фосфорилированная форма гистона H2AX (y-H2AX) участвует в регуляции репарации ДНК и часто используется для оценки повреждения ДНК. Ранее было показано, что число фокусов y-H2AX и уровень белка y-H2AX значительно повышены у пациентов с диспластическими узлами, гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК) и в неопухолевых тканях пациентов с ГЦК. Некоторые авторы предлагают использовать y-H2AX для оценки рисков развития ГЦК [37].
В наших работах установлено, что активация HBV на модели клеток HepG2-1.1merHBV с регулируемым tet-оп-промотором вызывает образование многочисленных фокусов y-H2AX. Кроме того, ряд факторов, включая гиперэкспрессию HBx-белка, ДНМТ3А и ДНМТ1, могут усиливать повреждение генома, вызывать образование многочисленных у-Н2АХ-фокусов и изменять экспрессию генов, ассоциированных с DDR (MRE11, DNA-PKcs) [38]. Мы обнаружили, что многочисленные фокусы y-H2AX генерируются в активных клетках уже на 3-и
сутки эксперимента. Количество спонтанных фокусов y-H2AX также немного увеличивается, но остается значительно меньшим по сравнению с клетками с активной инфекцией HBV (2—6 фокусов на клетку против 13—16 фокусов на клетку; p < 0,001). Трансфекция ДНМТ1 и ДНМТ3А вызывает значительное увеличение числа фокусов y-H2AX к 4-м суткам, что сравнимо с клетками, гиперэкспрессирующими HBx.
Роль ДНМТ в сигнальных каскадах DDR может заключаться в гиперметилировании DDR-кодирующих генов и тем самым в нарушении клеточного ответа на повреждение ДНК. В физиологических условиях DDR действует через несколько реакций, включая детекцию повреждений ДНК, репарацию ДНК и процессы, регулирующие остановку клеточного цикла или гибель клетки. Например, ДНМТ1 может метилировать гемиметилированные локусы генов и таким образом ингибировать транскрипцию либо напрямую участвовать в DDR [39]. Индукция оксидативного стресса при обработке пероксидом водорода приводит к привлечению ДНМТ1 к повреждённому хроматину и, возможно, к аберрантному метилированию ДНК и подавлению транскрипции [40]. Тип повреждения ДНК генома при инфекции HBV (по крайней мере частично) сходен с обработкой пероксидом, наблюдаемой в работе S. Kim и соавт. [35]. Это говорит о том, что продукция АФК в ответ на цитоплазматический HBx может вызывать HBV-связанное повреждение генома хозяина.
Впервые мы продемонстрировали, что трансфекция ДНМТ1 и ДНМТ3A при активной инфекции HBV стимулирует значительное увеличение формирования фокусов y-H2AX к 4-м суткам. Среднее количество фокусов Y-H2AX варьирует от 24,8 ± 1,25 для ДНМТ1 до 26,2 ± 1,27 для ДНМТ3A. Эти количества сравнимы с таковы-
reviews
ми HBx-трансфекции (27,1 ± 1,64). Помимо этого мы показали, что у-ШАХ-фокусы детектируются у пациентов с XrB, причем число этих фокусов значительно выше у пациентов с коинфекцией вируса гепатита дельта.
Следовательно, HBx дизрегулирует многочисленные процессы клеток и индуцирует повреждение генома; стимулирует продукцию ДНМТ, которые оказывают аддитивное негативное действие на репарацию двух-цепочечных разрывов. Усиленное повреждение генома клеток у пациентов с коинфекцией HBV пока остаётся неизученным, но скорее всего оно связано с ДНК-повреждающим действием самого дельта-агента.
Заключение
Ранее было высказано предположение, что гиперэкспрессия ДНМТ может участвовать в персистенции ккзДНК, поддержании и контроле пула ккзДНК [40]. Однако влияние ДНМТ на размер пула ккзДНК впервые было описано нами на модели клеток HepG2-1.1merHBV после трансфекции ДНМТ3А. Кроме того, метилирование CpG-островков в ккзДНК может дополнительно служить сигналом для привлечения гистонмодифицирую-щих и хроматинремоделирующих комплексов и метилирования гистонов, связанных с ккзДНК. Метилирование гистонов еще больше снижает транскрипцию мишени и усиливает степень компактизации ккзДНК. Высокая стабильность и низкая доступность ккзДНК даже для экспериментальных воздействий, таких как технологии APOBEC-дезаминаз [41] и сайт-специфических нуклеаз [42], остаются главной проблемой на пути разработки эффективного метода лечения XrB и элиминации ккзДНК. Релаксирование генома ккзДНК при помощи факторов эпигенетического ремоделирования может способствовать достижению более высоких показателей нуклеоли-тического расщепления HBV и разработкам селективных и эффективных препаратов для лечения ХГВ.
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ №16-15-10426.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Sunbul M. Hepatitis B virus genotypes: Global distribution and clinical importance. World J. Gastroenterol. 2014; 20(18): 5427—34.
2. Ganem D., Prince А.М. Hepatitis B virus infection — natural history and clinical consequences. New Engl. J. Med. 2004; 350(11): 1118—29.
3. Zoulim F. New insight on hepatitis B virus persistence from the study of intrahepatic viral cccDNA. J. Hepatol. 2005; 42(3): 302—8.
4. Zhang X., Hou J., Lu M. Regulation of hepatitis B virus replication by epigenetic mechanisms and microRNAs. Front. Genet. 2013; 4: 202.
5. Liu X., Xu Q., Chen W., Cao H., Zheng R., Li G. Hepatitis B virus DN\-induced carcinogenesis of human normal liver cells by virtue of nonmethylated CpG DNA. Oncol. Rep. 2009; 21(4): 941—7.
6. Li H., Yang F., Gao B., Yu Z., Liu X., Xie F. et al. Hepatitis B virus infection in hepatocellular carcinoma tissues upregulates expression of DN\ methyltransferases. Int. J. Clin. Exp. Med. 2015; 8(3): 4175—85.
7. Guo Y.H., Li Y.N., Zhao J.R., Zhang J., Yan Z. HBc binds to the CpG islands of HBV cccDNA and promotes an epigenetic permissive state. Epigenetics. 2011; 6(6): 720—6.
8. Koumbi L., Karayiannis P. The epigenetic control of hepatitis B virus modulates the outcome of infection. Front. Microbiol. 2015; 6: 1491.
9. Haines K.M., Loeb D.D. The sequence of the RNA primer and the DN\ template influence the initiation of plus-strand DN\ synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 2007; 370(3): 471—80.
10. Wong D.K., Yuen M.F., Yuan H., Sum S.S., Hui C.K., Hall J. et al. Quantitation of covalently closed circular hepatitis B virus DN\ in chronic hepatitis B patients. Hepatology. 2004; 40(3): 727—37.
11. Pollicino T., Belloni L., Raffa G., Pediconi N., Squadrito G.,
Raimondo G. et al. Hepatitis B virus replication is regulated by the acetylation status of hepatitis B virus cccDNA-bound H3 and H4 histones. Gastroenterology. 2006; 130(3): 823—37.
12. Belloni L., Pollicino T., De Nicola F., Guerrieri F., Raffa G., Fanciulli M. et al. Nuclear HBx binds the HBV minichromosome and modifies the epigenetic regulation of cccDNA function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 2009; 106(47): 19975—9.
13. Bock C.T., Schwinn S., Locarnini S., Fyfe J., Manns M.P., Trautwein C. et al. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome. J. Mol. Biol. 2001; 307(1): 183—96.
14. Egger G., Liang G., Aparicio A., Jones P.A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 2004; 429(6990): 457—63.
15. Jurkowska R., Jeltsch A. Silencing of gene expression by targeted DNA methylation: concepts and approaches. Methods Mol. Biol. 2010; 649: 149—61.
16. Saito Y., Kanai Y., Sakamoto M., Saito H., Ishii H., Hirohashi S. Expression of mRNA for DNA methyltransferases and methyl-CpG-binding proteins and DNA methylation status on CpG islands and pericentromeric satellite regions during human hepatocarcinogenesis. Hepatology. 2001; 33(3): 561—8.
17. Vivekanandan P., Thomas D., Torbenson M. Methylation regulates hepatitis B viral protein expression. J. Infect. Dis. 2009; 199(9): 1286—91.
18. Vivekanandan P., Daniel H.D., Kannangai R., Martinez-Murillo F., Torbenson M. Hepatitis B virus replication induces methylation of both host and viral DNA. J. Virol. 2010; 84(9): 4321—9.
19. Tian Y., Yang W., Song J., Wu Y., Ni B. Hepatitis B virus X protein-induced aberrant epigenetic modifications contributing to human hepatocellular carcinoma pathogenesis. Mol. Cell. Biol. 2013; 33(15): 2810—6.
20. Zhu Y.Z., Zhu R., Fan J., Pan Q., Li H., Chen Q. et al. Hepatitis B virus X protein induces hypermethylation of p16(INK4A) promoter via DNA methyltransferases in the early stage of HBV-associated hepatocarcinogenesis. J. Viral. Hepat. 2010; 17(2): 98—107.
21. Zheng D.L., Zhang L., Cheng N., Xu X., Deng Q., Teng X.M. et al. Epigenetic modification induced by hepatitis B virus X protein via interaction with de novo DNA methyltransferase DNMT3A. J. Hepatol. 2009; 50(2): 377—87.
22. Zhu Y.Z., Zhu R., Shi L.G., Mao Y., Zheng G.J., Chen Q. et al. Hepatitis B virus X protein promotes hypermethylation of p16(INK4A) promoter through upregulation of DNA methyltransferases in hepatocarcinogenesis. Exp. Mol. Pathol. 2010; 89(3): 268—75.
23. Vivekanandan P., Kannangai R., Ray S.C., Thomas D.L., Torbenson M. Comprehensive genetic and epigenetic analysis of occult hepatitis B from liver tissue samples. Clin. Infect. Dis. 2008; 46(8): 1227—36.
24. Guo Y., Li Y., Mu S., Zhang J., Yan Z. Evidence that methylation of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in liver tissues of patients with chronic hepatitis B modulates HBV replication. J. Med. Virol. 2009; 81(7): 1177—83.
25. Vivekanandan P., Thomas D., Torbenson M. Methylation regulates hepatitis B viral protein expression. J. Infect. Dis. 2009; 199(9): 1286—91.
26. Wei X., Xiang T., Ren G., Tan C., Liu R., Xu X. et al. miR-101 is down-regulated by the hepatitis B virus x protein and induces aberrant DNA methylation by targeting DNA methyltransferase 3A. Cell. Signal. 2013; 25(2): 439—46.
27. Miller R.H., Robinson W.S. Integrated hepatitis B virus DNA sequences specifying the major viral core polypeptide are methylated in PLC/ PRF/5 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 1983; 80(9): 2534—8.
28. Vivekanandan P., Thomas D., Torbenson M. Hepatitis B viral DNA is methylated in liver tissues. J. Viral. Hepat. 2008; 15(2): 103—7.
29. Kaur P., Paliwal A., Durantel D., Hainaut P., Scoazec J.Y., Zoulim F. et al. DNA methylation of hepatitis B virus (HBV) genome associated with the development of hepatocellular carcinoma and occult HBV infection. J. Infect. Dis. 2010; 202(5): 700—4.
30. Kim J.W., Lee S.H., Park Y.S., Hwang J.H., Jeong S.H. et al. Replicative activity of hepatitis B virus is negatively associated with methylation of covalently closed circular DNA in advanced hepatitis B virus infection. Intervirology. 2011; 54(6): 316—25.
31. Zhang Y., Li C., Zhang Y., Zhu H., Kang Y., Liu H. et al. Comparative Analysis of CpG Islands among HBV Genotypes. PLoS ONE. 2013; 8(2): e56711.
32. Lin S.C. Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA Is AssociatedwithMethylatedHistonesH3 andH4 andHeterochromatin
Вопросы Вирусологии. 2018; 63 (1)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-63-1-29-36
Complex Proteins: Implication of Their Roles in Viral Replication (Thesis). Hong Kong; 2017.
33. Hughes D.J., Marendy E.M.., Dickerson CA., Yetming K.D.., Sample C.E., Sample J.T. Contributions of CTCF and DNA methyltransferases DNMT1 and DNMT3B to epstein-barr virus restricted latency. J. Virol. 2012; 86(2): 1034—45.
34. Park E.S., Park Y.K., Shin C.Y., Park S.H., Ahn S.H., Kim D.H. et al. Hepatitis B virus inhibits liver regeneration via epigenetic regulation of uroki-nase-type plasminogen activator. Hepatology. 2013; 58(2): 762—76.
35. Kim S., Lee H.S., Ji J.H., Cho M.Y., Yoo Y.S., Park Y.Y. et al. Hepatitis B virus X protein activates the ATM-Chk2 pathway and delays cell cycle progression. J. Gen. Virol. 2015; 96(8): 2242—51.
36. Zhu M., Guo J., Li W., Lu Y., Fu S., Xie X. et al. Hepatitis B virus X protein induces expression of alpha-fetoprotein and activates PI3K/mTOR signaling pathway in liver cells. Oncotarget. 2015; 6(14): 12196—208.
37. Matsuda Y., Wakai T., Kubota M., Osawa M., Takamura M., Yamagi-wa S. et al. DNA Damage Sensor y-H2AX Is Increased in Preneoplastic Lesions of Hepatocellular Carcinoma. ScientificWorld Journal. 2013; 2013: 597095.
оригинальные исследования
38. Ha K., Lee G.E., Palii S.S., Brown K.D., Takeda Y., Liu K. et al. Rapid and transient recruitment of DNMT1 to DNA double-strand breaks is mediated by its interaction with multiple components of the DNA damage response machinery. Hum. Mol. Genet. 2011; 20(1): 126—40.
39. O'Hagan H.M., Wang W., Sen S., Destefano Shields C., Lee S.S., Zhang Y.W. et al. Oxidative damage targets complexes containing DNA methyltransferases, SIRT1 and polycomb members to promoter CpG islands. Cancer. Cell. 2011; 20(5): 606—19.
40. Jin B., Robertson K.D. DNA Methyltransferases (DNMTs), DNA Damage Repair, and Cancer. Adv. Exp. Med. Biol. 2013; 754: 3—29.
41. Lucifora J., Xia Y., Reisinger F., Zhang K., Stadler D., Cheng X. et al. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science. 2014; 343(6176): 1221—8.
42. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8(11): 2281—308.
Поступила 16.04.17 Принята в печать 20.06.17
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 578.833.26:578.53
Дёмина Т.В.1, КозловаИ.В.23, Ткачёв С.Е.4, Дорощенко Е.К.2, Лисак О.В.2, Савинова Ю.С.2, Сунцова О.В.2, Верхозина М.М.5, Джиоев Ю.П.3, Парамонов А.И.2, Киселёв Д.О.3, Злобин В.И.3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ СТРУКТУРЫ СИБИРСКИХ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА ЕВРОПЕЙСКОГО
СУБТИПА
1ФГБОУ ВО «Иркутский государственный аграрный университет им. А.А. Ижевского», 664038, г. Иркутск; 2ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», 664003, г. Иркутск; 3ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет», 664003, г. Иркутск 4ФГБНУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, 630090, г. Новосибирск; 5ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области», 664047, г. Иркутск
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ, TBEV) делится на 3 субтипа: дальневосточный (ВКЭ-ДВС, TBEV-FE), европейский (ВКЭ-Евр, TBEV-Eur) и сибирский (ВКЭ-Сиб, TBEV-Sib). В России их также принято называть соответственно генотипами 1, 2 и 3. Географически ВКЭ-Евр доминирует в Центральной и Северной Европе, но его представители встречаются и восточнее — по южной части лесной зоны внетропической Евразии вплоть до Восточной Сибири и Южной Кореи. Однако штаммы, изолированные за пределами Европы, остаются малоизученными. В предлагаемом исследовании определено 8 и сопоставлено 13 полных геномов сибирских изолятов ВКЭ-Евр. Анализ 152 депонированных в GenBank полногеномных последовательностей ВКЭ показал, что ВКЭ-Евр на территории всего евроазиатского ареала обладает более высокой степенью стабильности кодирующей части генома (3,1% различий) по сравнению с ВКЭ-ДВС (6,6%) и ВКЭ-Сиб (7,8%). При этом максимальные показатели различий отмечаются не между европейскими и сибирскими штаммами, как можно было бы ожидать, а между представителями из Европы. Это штаммы Mandl-2009 из норвегии и Hypr из Чешской Республики. исследованные штаммы из Сибири входят в состав компактного генетического кластера из 42 штаммов ВКЭ-Евр и подразделяются на 2 субкластера — западносибирский и восточносибирский варианты. Эти варианты отличаются по сочетаниям аминокислотных замен во всех белках, кроме NS2B. Западносибирский вариант в основном циркулирует на территории Алтая, а ближайшим родственником его представителей является штамм Absettarov из европейской части России. Штаммы, аналогичные восточносибирскому варианту европейского субтипа, зафиксированы на Алтае (штамм 84.2, 2007) и в Беларуси (N256, предположительно 1940).
Ключевые слова: клещевой энцефалит; вирус клещевого энцефалита; генотип; субтип; генетическая вариабельность; полипротеин; аминокислотные замены. Для цитирования: Дёмина Т.В., Козлова И.В., Ткачёв С.Е., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Савинова Ю.С., Сунцова О.В., Верхозина М.М., Джиоев Ю.П., Парамонов А.И., Киселёв Д.О., Злобин В.И. Определение и сравнительный анализ геномной структуры сибирских штаммов вируса клещевого энцефалита европейского субтипа. Вопросы вирусологии. 2018; 63(1): 29-36. DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-1-29-36
Для корреспонденции: Дёмина Татьяна Васильевна, д-р биол. наук, проф. каф. фак. биотехнологии и ветеринарной медицины при ФГБОУ ВО «Иркутский государственный аграрный университет им. А.А. Ижевского», 664038, г. Иркутск. E-mail:[email protected]
