CC BY
5
КОПЦ из гребней винограда активизируют процесс восстановления ацетальдегида, сохраняя редуктазную активность АДГ, обычно подавляемую этиловым спиртом. Это свойство проантоцианидинов позволяет снизить концентрацию высокотоксичного ацетальдегида в организме, что было замечено ранее в эксперименте на добровольцах. В пользу данного вывода указывает и отсутствие достоверно выраженного роста активности АлДГ с низкой Км ввиду поддержания концентрации ацетальдегида на уровне, не вызывающем дополнительную индукцию фермента.
Полученные данные указывают на участие проантоцианидинов в регуляции метаболизма ацетальдегида, образующегося при окислении этилового спирта в условиях in vivo, что определяет их положительную роль в предотвращении резкого накопления фактора формирования алкоголизма — ацетальдегида в организме.
Выводы. 1. Олигомерные проантоцианидины активно вовлекаются в процесс окисления этанола в организме, воздействуя на ферменты этанолокисляющей системы.
2. Под действием олигомерных проантоцианидинов наблюдается сохранение редуктазной активности АДГ печени при длительной алкоголизации животных, в результате чего ацетальдегид восстанавливается до этанола.
3. Олигомерные проантоцианидины препятствуют резкому нарастанию ацетальдегида в организме, косвенно участвуя в восстановлении его в менее токсичный этанол, что обусловливает образование "плато" концентрации этанола между 1-м и 2-м часом эксперимента на добровольцах.
4. Олигомерные проантоцианидины могут быть использованы для предупреждения выраженного токсического воздействия избыточных доз этилового алкоголя на организм.
JI итература
1. Брехман И. И. Что противопоставить вредному действию алкоголя. — Владивосток, 1994.
2. Буров Ю. В., Жуков В. Н., Кампов-Полевой А. Б. Методические рекомендации по экспериментальному (фармакологическому) изучению препаратов, предлагаемых для клинической апробации в качестве средств для лечения и профилактики алкоголизма. - М„ 1980.
3. Буров /О. В., Ведерникова И. Н. Нейрохимия и фармакология алкоголизма. — М., 1985.
4. Кошкина Е. А., Паронян И. Д., Павловская Н. И. // Рус. мед. журн. - 1996. - Т. 3, № 7. - С. 269-275.
5. Шишкин С. П., Островский /О. А/., Пронько П. С. // Вопр. мед. химии. - 1988. - Т. 34, № 5. - С. 129-133.
6. Bradford M. M // Anal. Biochem. - 1976. - Vol. 72, № 1. - P. 248-354.
7. Eriksson C. J. // Alcoholism.: Clin. Exp. Res. - 2001.
- Vol. 25, № 5. - Suppl. ISBRA. - P. 15S-32S.
8. Fine A. U Altern. Med. Rev. - 2000. - Vol. 5, № 2. -P. 144-151.
9. French S. W. // Can. J. Gastroenterol. - 2000. -Vol. 14, № 4 - P. 327-332.
10. Gershman H. // Arch. Biochem. - 1975. - Vol. 168, № 1. - P. 327-330.
11. Goedde H. W., Aganval D. P. // Pharmacol. Ther. -1990. - Vol. 45, № 3. - P. 345-371.
12. Halvorson M.. NoffsingerJ. K., Peterseon C. N. //Alcoholism.: Clin. Exp. Res. - 1993. - Vol. 17, № 2. -P. 495.
13. Henehan G. T., Oppenheimer N. J. // Biochemistry. — 1993. - Vol. 32, № 3. - P. 735-738.
14. Kitson T. A/., Kitson K. E., Moore S. A. 11 Cheni.-Biol. Interact. - 2001. - Vol. 130, № 1-3. - P. 57-69.
15. Moini II, Rimbach G., Packer L. // Drug Metab. Drug Interact. - 2000. - Vol. 17, № 1-4. - P. 237-259.
16. Ostrovsky Y. M., Pronko P. S., Shishkin S. N. et al. // Alcohol. - 1989. - Vol. 6, № 2. - P. 97-102.
17. Rahwan R. G. // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1975. -Vol. 34, № I. - P. 3-27.
18. Santos-Buelga C., Scalbert A. H J. Sci. Food Agric. — 2000. - Vol. 80, № 7. - P. 1094-1117.
19. Shimasue A., Murakami M., Tsubokura T. I I Hiroshima J. Med. Sci. - 1972. - Vol. 21, № 4. - P. 131-140.
20. Singleton V. L., Orthofer R., Lamuela-Raventos R. M. // Meth. Enzymol. - 1999. - Vol. 299. - P. 152-178.
21. Tottmar S. O. C., Pettersson H., Kiessling K. H. 11 Biochem. J. - 1973. - Vol. 135, № 4. - P. 577-586.
22. Tottmar C., Hellstrom E. // Pharmacol. Biochcm. Bchav.
- 1983. - Vol. 18. - Suppl. 1. - P. 103-107.
23. Tregear G. W„ Coghlan J. P. // Aust. N. Z. J. Med. -1981. - Vol. 11, № 2. - P. 118-122.
nocrryniuia 2911.02
Summary. The study evaluated the effects of a complex of oligomer proanthocyanidines derived from the crowns of the grapes Vitis vinifera on the oxidation of ethanol and on the activity of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase in the plasma of male volunteers given ethanol once, as well as in the rat liver during long-term alcohol use. Oligomer proanthocyanides were shown to be actively involved in the human and animal metabolism of ethyl alcohol in vivo. Under their action, the reductase activity was preserved, which prevented acetaldehyde from accumulating in the body since it reduces to less toxic ethanol. Oligomer proanthocyanidines from the crowns of the grape may be used to prevent a significant toxic effect of excess doses of ethyl alcohol on the body.
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2003 УДК 614.7:547.785.51-074
В. Н. Зиновьева, О. В. Островский, В. А. Анисимова, А. А. Спасов
ПОДАВЛЕНИЕ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ 2-АМИНОАНТРАЦЕНА ПРОИЗВОДНЫМ БЕНЗИМИДАЗОЛА
НИИ фармакологии и кафедра фармакологии Волгоградской медицинской академии
В настоящее время человечество все чаще сталкивается с проблемой загрязнения окружающей среды различными ксенобиотиками, что является результатом его интенсивной хозяйственной деятельности. Среди загрязнителей встречаются мутагенные соединения, которые способствуют росту частоты мертворождений, наследственных уродств и болезней, т. е. разбалансировке генома человека. Многие мутагены оказывают канцерогенное действие, увеличивая риск развития онкологических заболеваний. Канцерогенными являются, например, ароматические и гетероциклические амины, образующие в
организме млекопитающих под действием цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ генотоксичные метаболиты, мутагенную активность которых можно обнаружить в тесте Эймса, используя для биоконверсии промутаге-нов фракцию 59 гепатоцитов крысы (5, 7].
Избежать контакта с мутагенами не всегда удается, поэтому чрезвычайно актуальны поиск и разработка средств, защищающих геном человека. Антимутагенные свойства обнаружены у многих природных веществ, например у некоторых витаминов, порфиринов, флавонои-дов [6, 7, 10, 11 ]. Известны и синтетические антимугаге-
Рис. I. Влияние соединения РУ-185 на мутагенез, вызванный 2АА в клетках индикаторного штамма ТА98.
По оси абсцисс — концентрация 2АА, мкг но чашку; здесь и на рис. 2: по оси ординат — среднее число рсвертпнтов на чашку. Соединение РУ-185 вносили в концентрации: 1 — 0 мкг на чашку; 2 — 10 мкг на чашку; 3 — 100 мкг на чашку. Число ревертантов в отсутствии 2АА составило 24 ± 4; звездочка — различие статистически достоверно Ср < 0,001).
ны: ионол, производные бензимидазола бемитил и это-мерзол, некоторые дигидроксиароматические соединения 13. 4, 8|. Многие антимутагены являются антиокси-дантами. Их антимутагенные свойства обусловлены, по-видимому, способностью уменьшать уровень свободных радикалов, окисляющее действие которых на ДНК и приводит к возникновению мутаций.
Антимутагенную активность по отношению к прому-тагенным ароматическим и гетероциклическим аминам проявляют некоторые, в том числе и антиоксидантные, соединения фенольной природы (катехины, флавонои-ды, кумарины) [5, 6, 12]. Благодаря дигидроксифениль-ному радикалу в своей структуре соединением фенольной природы можно считать новое производное бензимидазола, получившее лабораторный шифр соединение РУ-185. Кроме того, соединение РУ-185 обладает анти-оксидантной активностью [2|. Целью настоящей работы было исследование способности соединения РУ-185 к антимутагенному действию против ароматического амина 2-аминоантрацена (2АА) в тесте Эймса.
В работе использовали штаммы Salmonella typhimuri-um ТА 100 и ТА98 из коллекции кафедры генетики МГУ им. М. В. Ломоносова (оригинатор Ames В. [9]) и следующие соединения: 2АА ("Sigma", США), диметилсуль-фоксид ("Львов Фарм", Украина) для растворения 2АА, циметидин ("Gedeon Richter", Венгрия), фенобарбитал ("Акрихин", Россия). Производные бензимидазола с лабораторными шифрами РУ-185, РУ-181 и РУ-13 были синтезированы в Институте физической и органической химии при Ростовском-на-Дону государственном университете. Экстракты зеленого чая (чай фирмы "Майский чай", Россия) приготовлялись, как описано в работе [5].
Опыты проводились по стандартной методике [9] с небольшими модификациями. Смесь соединения РУ-185, промутагена, фракции S9 для метаболической активации (МА) и бактерий высевали на чашки с минимальным агаром либо сразу, либо после 20-минутной преин-кубации при 37"С. В некоторых случаях проводилась преинкубация промутагена, фракции МА и бактерий в течение 20 мин при 37*С, затем к смеси добавляли соединение РУ-185 или циметидин либо оба вещества вместе, проводили вторую 20-минутную преинкубацию и смесь высевали. Результаты представлены как среднее количество появившихся после 48-часовой инкубации при 37"С колоний ревертантов на чашку из трех (М ± т). После вычитания среднего числа спонтанных ревертантов (негативный контроль) из среднего числа ревертан-
тов, полученного в каждом варианте опыта, с помощью /-критерия Стьюдента оценивали достоверность различия между вариантами. Для метаболической активации 2АА использовали фракцию S9 от беспородных белых крыс, которым для индукции ферментов микросомаль-ного окисления вводили фенобарбитал [9].
Соединение РУ-185 при проверке его антимутагенной активности в тесте Эймса использовали в широком диапазоне концентраций, в котором оно, как было показано ранее |1], не обладало собственной мутагенной активностью и не оказывало бактерицидного действия. В опытах с промутагеном 2АА, который после метаболической активации индуцирует реверсии у штаммов ТА98 и ТА100, у соединения РУ-185 было обнаружено антимутагенное свойство. Соединение РУ-185 при одновременном внесении его, 2АА, бактерий и фракции S9 на чашки заметно снижает количество гистидиновых ревертантов (рис. 1 и 2). Аналогичные результаты получены и в опытах с преинкубацией (данные не представлены). Ингибирование мутагенности 2АА соединением РУ-185 во всех случаях зависело от концентрации последнего (см. рис. 1 и 2).
Сведения о наличии у каких-либо синтетических соединений антимутагенной активности по отношению к 2АА не удалось обнаружить. В то же время антимутагенное действие против 2АА оказывают некоторые природные фенольные соединения. В частности, кумарины растительного происхождения ингибировали мутагенность 2АА в тесте Эймса на штамме ТА98 (12]. При этом более высокой антимутагенной активностью обладало кумари-новое соединение, содержащее в отличие от других ку-маринов два гидроксильных радикала в бензольном кольце. Поскольку фенильный радикал соединения РУ-185 также содержит две гидроксильные группы, мы предположили, что его антимутагенные свойства могут быть обусловлены этой особенностью структуры. С целью проверки этого предположения была изучена способность к ингибированию мутагенности 2АА у двух родственных соединению РУ-185 производных бензимидазола. Вещества РУ-181 и РУ-13 отличаются отсоединения РУ-185 структурой фенильного радикала, в котором гидроксильные группы либо заменены на мстокси-группы, либо вовсе отсутствуют.
Рис. 2. Действие производных бензимидазола и экстракта зеленого чая на мутагенез, вызванный 2АА в клетках штаммов ТА98 и ТА 100.
По оси абсцисс: а — аггамм TA98, б — штамм TAI00. 2АА вносили на чашки во всех вариантах (I мкг на чашку для штамма ТА98 и 0.5 мкг на чашку для штамма ТА100). /— контроль; 2— соединение РУ-181, 10 мкг на чашку; 3 — соединение РУ-181, 100 мкг на чашку; 4 — соединение РУ-13, 10 мкг на чашку; 5 — соединение РУ-13, 100 мкг на чашку; 6 — соединение РУ-185, 10 мкг на чашку; 7 — соединение РУ-185, 100 мкг на чашку; 8 — экстракт зеленого чая, 100 мкл на чашку; 9 — экстракт зеленого чая, 100 мкл на чашку и соединение РУ-185, 10 мкг на чашку. Число ревертантов в отсутствие 2АА для штамма ТА98 составило 21 ± 7, для штамма TAI00 — 101 ± 12; звездочка — различие статистически достоверно (р < 0,001).
Ч^м
R РУ-185
РУ-181
РУ-13
ОН ОН
О—сн3 О—сн.
Как видно из рис. 2, антимутагенного действия вещества РУ-13 и РУ-181 против 2АА не оказали. Вероятно, наличие дигидроксифенильной группировки в молекуле соединения РУ-185 играет существенную роль в проявлении им антимутагенных свойств.
Поданным литературы |5), выраженное антимутагенное действие против 2-АА в тесте Эймса оказывали экстракты зеленого чая, компоненты которого, по-видимому, и ингибируют биотрансформацию 2АА и инактиви-руют метаболиты промутагена |5]. Последнее показано при использовании для остановки биотрансформации 2АА менадиона, который добавляли к клеткам штамма TAI00 после 20-минутной преинкубации их с 2АА и ферментами МА. Экстракт зеленого чая, вводимый вместе с менадионом, снижал уровень ревертантов, вероятно, благодаря взаимодействию его компонентов с образовавшимися за время преинкубации метаболитами 2АА.
Для выяснения возможного механизма действия соединения РУ-185 на индуцированный 2-АА мутагенез мы воспользовались аналогичным приемом, заменив, однако, менадион циметидином. Циметидин, как известно, является ингибитором цитохром P-450-зависимых моно-оксигеназ [13]. В наших опытах он подобно менадиону оказался способен останавливать биотрансформацию 2-АА, так как одновременное добавление его и промутагена к бактериям значительно (до 60%), хотя и не полностью, ингибировапо индукцию гистидиновых ревертантов.
Результаты опытов с циметидином и соединением РУ-185 приведены в таблице. Когда бактерии преинку-бировали с 2АА и ферментами МА при 37'С в течение 40 мин в пробирках, а затем смесь высевали на чашки, количество гистидиновых ревертантов, индуцированных 2АА, было максимальным. Если через 20 мин преинку-
Дсйствие циметидина н соединения РУ-185 на индуцированный 2АА мутагенез в клетках индикаторного штамма S. typhimurium ТА 100
Вещества Концентрация, мкг на чашку Среднее число ревертантов на чашку
Контроль — 112 ± 9
2AA 0,5 722 ± 19
2AA+ 0.5
Циметидин 250 476 ± 13*
2AA+ 0,5
Циметидин+ 250
Соединение РУ-185 20 284 ± 21*
2АА+ 0,5
Циметидин+ 250
Соединение РУ-185 100 196 ± 7*
2АА+ 0,5
Соединение РУ-185 100 227 ± 16*
При меча ни е. Пропуск — отсутствие химических веществ в чашках (контроль), плюс — суммарное действие двух или трех вносимых веществ, звездочка — достоверное различие с действием одного промутагена 2АА (р < 0,001). Бактерии, 2АА (по 100 мкл) и систему МА (500 мкл) 40 мин прсинкубировали при 37'С и высевали либо через 20 мин преинкубации в смесь вносили другие вещества (по 100 мкл), прсинкубировали еще 20 мин, а затем высевали. Приведено среднее количество ревертантов на чашку из трех (М ± т).
бации в смесь вносили циметидин, мутагенный ответ уменьшался, что свидетельствовало о блокировании циметидином биоконверсии 2АА в генотоксичные метаболиты. При одновременном добавлении циметидина и соединения РУ-185 количество гистидиновых ревертантов снижалось еще в большей степени, причем уровень снижения зависел от концентрации соединения РУ-185. Можно предположить, что соединение РУ-185 и/или его метаболиты взаимодействуют с мутагенными метаболитами 2АА, образовавшимися за первые 20 мин преинкубации, и инактивируют их. В пользу этого свидетельствует и отсутствие аддитивного или синергического эффекта соединения РУ-185 и циметидина, поскольку уровни снижения мутагенного ответа при добавлении двух веществ или лишь одного соединения РУ-185 сопоставимы (см. таблицу). В то же время аддитивный эффект наблюдался при совместном действии соединения РУ-185 и экстракта зеленого чая (см. рис. 2). Эти данные можно считать косвенным подтверждением нашей гипотезы.
Таким образом, соединение РУ-185 снижает мутагенность промутагена 2АА, инактивируя, по-видимому, его мутагенные метаболиты. Антимутагенная активность соединения РУ-185, возможно, связана с наличием дигид-роксифенильного радикала в его структуре. Нельзя также исключить влияние соединения РУ-185 как антиокси-данта на процессы свободнорадикального окисления, которые могут усиливаться во время биотрансформации 2АА. В любом случае представляется интересным изучение антиканцерогенных свойств соединения РУ-185, поскольку, ингибируя генотоксичность 2АА, оно, возможно, способно действовать на стадию инициации канцерогенеза, вызываемого этим загрязнителем окружающей среды.
Литература
1. Зиновьева В. Н., Островский О. В., Никитин С. А., Анисимова В. А. // Вестн. Волгоград, мед. акад. № 4: Сб. науч. тр. - Волгоград, 1998. - Т. 54. - С. 43-46.
2. Косолапое В А., Спасов А. А., Островский О. В., Анисимова В. А. // Вестн. Волгоград, мед. акад. № 1: Сб. науч. тр. - Волгоград, 1995. - Т. 51. - С. 36-39.
3. Пашин Ю. В., Бентхен Т. И., Бахитова Л. М. и др. // Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1988. - № 1. -С. 463-466.
4. Середенин С. Б., Дурнев А. Д. Фармакологическая защита генома. — М., 1992.
5. Bu-Abbus A., Clifford М. N.. Walker R., Ioannides С. // Mutagenesis. - 1994. - Vol. 9. - P. 325-331.
6. Edenharder R., von Petersdorff I., Rauscher R. // Mutat. Res. - 1993. - Vol. 287. - P. 261-274.
7. Edenharder R., Worf- Wandelburg A., Decker M., Piatt K. L. // Ibid. - 1999. - Vol. 444. - P. 235-248.
8. Kahl R. // Lipid-Soluble Antioxidants / Eds. A. S. H. Ong, L. Packer. - Berlin, 1992. - P. 590-605.
9. Maron D. M., Ames B. N. // Mutat. Res. - 1983. -Vol. 113. - P. 173-215.
10. Odin A. P. Ц Ibid. - 1997. - Vol. 386. - P. 39-67.
11. Odin A. P. U Ibid. - Vol. 387. - P. 55-68.
12. Schimmer O., Eschelbach H. 11 Pharmazie. - 1997. -Bd 52. - S. 476-478.
13. Wright A. W., Winzor D. J., Reilly P. E. // Xenobiotica. - 1991. - Vol. 21. - P. 193-203.
Поступила 27.02.2002
Summary. The antimutagenic activity of a new benzimi-dazole derivative that has antioxidative properties was found in the Salmonella/microsome test. This compound reduced the level histidine revertants induced by the promutagen and carcinogen 2-aminoanthracene. Inhibition of the mutagenicity of 2-aminoanthracene appears to be associated with the in-activation of its genotoxic metabolites. The capacity of the benzimidazole derivative for antimutagenic effects is possibly due to a dihydroxyphenyl radical that is present in its structure.
