CC BY
42
УДК 616-001-092.9:615.214.2
Г.Б. Гранина Н.В. Зеленин 2, И.А. Шурыгина М.Г. Шурыгин С.А. Лепехова В.Н. Зеленин 1
ПОДАВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ JNK MAPK В РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА КОЛЛАГЕНА ПРИ РАНЕВОМ ПРОЦЕССЕ
1 Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (Иркутск) 2 Иркутский государственный медицинский университет (Иркутск)
Изучено влияние ингибитора JNK MAP-киназы SP 600125 на синтез коллагена на модели кожномышечной раны. Эксперимент, проведен, на 36 крысах линии. Wistar. Выявлено, что локальное подавление активности. JNK MAP-киназы, избирательным, ингибитором. SP 600125 существенно влияет, на морфологические характеристики, формирующегося, рубца в области кожно-мышечной раны., приводя к достоверно более раннему и. более выраженному синтезу коллагена в зоне формирующегося, рубца. Различия между опытной и. контрольной группами были, достоверны на 3-и, 7-е, 14-е и. 30-е сутки. Выявленную связь сниженной активности JNK MAPK с усилением, коллагенообразования можно использовать для. влияния, на репаративный процесс с целью оптимизации заживления, раны. Ключевые слова: репарация, МАР-киназа, JNK, соединительная ткань
SUPPRESSION OF ACTIVITY OF JNK MAPK IN REGULATION OF COLLAGEN SYNTHESIS AT WOUND PROCESS
G.B. Granina N.V. Zelenin 2, I.A. Shurygina M.G. Shurygin S.A. Lepekhova ‘, V.N. Zelenin 1
1 Scientific Center of Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS, Irkutsk
2 Irkutsk State Medical University, Irkutsk
We studied, the influence of inhibitor of JNK MAP-kinase SP 600125 on the collagen synthesis at the model of musculocutaneous wounds. The experiment was conducted, on 36 Wistar rats. It was revealed, that local suppression of JNK MAP-kinase activity by selective inhibitor SP 600125 considerably affects morphologic characteristics of forming cicatrice in musculocutaneous wounds and causes significantly earlier and. more apparent collagen synthesis in the area of scarring. Differences between experimental and. control groups were significant on 3rd, 7th, 14th and. 30th days. Discovered, connection, between depressed, activity of JNK MAPK and. amplification of collagenation can be used, for influence the reparative process in order to optimize wound, healing.
Key words: reparation, MAP-kinase, JNK, conjunctive tissue
Потребности медицины в новых методах и способах управления морфогенезом при заболеваниях, сопровождающихся избыточным или недостаточным образованием соединительной ткани, определяются универсальностью пролиферации соединительной ткани при репаративной регенерации и при этом высокой частотой отклонений от оптимальной выраженности фибробластической фазы воспаления.
Как известно, основу соединительной ткани составляет коллаген I и III типов. По данным им-муноморфологического анализа, коллаген III типа составляет основу коллагеновых волокон соединительной ткани и незрелых волокон грануляционной ткани, в то время как грубые и зрелые волокна состоят в основном из коллагена I типа. В процессе биосинтеза коллагена при формировании рубца вначале преобладает коллаген III типа. Предполагается, что этот коллаген синтезируют неполностью дифференцированные фибробласты и что он за счет своей структурной стабильности обеспечивает более благоприятные биомеханические параметры формируемого рубца в период недостаточной зрелости волокон коллагена I типа. Суммарное накопление коллагена в ткани рубца является главным фактором, определяющим его механические свойства [2, 3].
Настоящая работа направлена на разработку принципиально новых подходов к воздействию на формирование соединительной ткани при недостаточной синтетической активности фибробластов посредством воздействия на универсальные внутриклеточные МАР-киназные (MAPK — Mitogen Activated Protein Kinase) механизмы регуляции тканевого роста.
В качестве объекта исследования выбраны JNK MAP-киназы (c-Jun N-terminal kinase — киназа N-концевой части фактора транскрипции Jun), под контролем которых находится активация генов, участвующих в развитии воспалительной реакции [4].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для достижения поставленной цели нами применялось изучение процесса коллагенообразования на модели асептической кожно-мышечной раны с использованием крыс линии Wistar (вес — 220 — 250 г, возраст — 9 месяцев). Эксперимент проведен на 36 животных. Эксперимент выполнялся в соответствии с нормами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к
приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755), согласно протоколу, одобренному Комитетом по биомедицинской этике НЦРВХ СО РАМН.
Опытной группе животных локально вводился ингибитор JNK MAP-киназы SP 600125 (Tocris bioscience, кат. № 1496 Bath № 7 A/B 1710). Контрольной группе локально вводилось плацебо. Исследование проведено в сроки 3, 7, 14 и 30 суток раневого процесса. Проведена фиксация образцов ткани раствором FineFix (Milestone, Италия). Окраска проводилась по методу Ван-Гизона. Морфометрию проводили с использованием программы ImageJ Национального института здоровья (США) разработанным нами способом [1]. Морфометрическим методом проводили измерение количества коллагена на исследуемых препаратах в зоне рубца, в дерме на границе раны, а также в интактной дерме.
Определяли медиану, 25 — 75% квартили. Оценка достоверности между группами выявлялась методом Манна-Уитни. Внутригрупповые различия определяли с помощью теста Крускола-Уоллиса. Критический уровень значимости критериев принимался равным 0,05. Анализ данных проводился с использованием статистического пакета R (R project (http://www.r-project.org)).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При исследовании выявлено, что в контрольной группе животных концентрация коллагена в зоне
формирования рубца повышалась с 3-х до 30-х суток, закономерно достигая максимума к 30-м суткам наблюдения (медиана — 73,54 %, 25 — 75% квартили — 66,87 — 78,01 %). Концентрация коллагена в зоне интактной дермы достоверно не изменялась за период наблюдения. В дерме, расположенной вблизи раны, наблюдалось достоверное повышение концентрации коллагена к 14-м суткам наблюдения (р = 0,029).
При применении ингибитора ^К МАР-киназы SP 600125 при меньшей выраженности инфильтра-тивной фазы воспаления значительно повышалась интенсивность коллагенообразования в области раны. Так, уже на 3-и сутки раневого процесса количество коллагена в 4 раза превышало соответствующий показатель в группе контроля (медиана - 44,44 (23,26-70,30) и 11,57 (8,53-27.85) соответственно; г = 4,00; р = 0,00063) (рис. 1).
Сходные различия наблюдались в течение всего периода наблюдения (табл. 1). Различия были достоверны в сроки 3, 7, 14 и 30 суток.
В то же время применение SP 600125 значимо не влияло на концентрацию коллагена ни в интактной дерме, ни в зоне, расположенной вблизи раны.
Таким образом, локальное подавление активности ^К МАР-киназы избирательным ингибитором SP 600125 существенно влияет на морфологические характеристики формирующегося рубца в области кожно-мышечной раны, приводя к достоверно более раннему и выраженному синтезу коллагена в зоне формирующегося рубца. Выявленную связь
Рис. 1. Выраженность коллагенообразования в области раны кожи на 3-и сутки при локальном применении SP 600125 (А) и у животного контрольной группы (Б). Окраска по Ван-Гизону.
Количество коллагена в области в зоне формирующегося рубца
Таблица 1
Срок Контрольная группа Опытная группа z Р
Me 25% квартиль 75% квартиль Me 25% квартиль 75% квартиль
3-и сутки 11,57 8,53 27,85 44,44 23,26 70,30 4,00 0,00063
7-е сутки 25,21 15,61 36,92 46,74 36,34 57,65 3,18 0,001496
14-е сутки 55,41 41,10 74,38 77,01 69,00 81,22 3,31 0,000949
30-е сутки 73,54 66,87 78,01 78,14 72,77 81,14 2,29 0,021938
сниженной активности ^К МАРК с усилением коллагенообразования можно использовать для влияния на репаративный процесс с целью оптимизации заживления раны.
Работа выполнена при поддержке грантов П803 «Проведение поисковых научно-исследовательских работ по направлению «Физико-химическая молекулярная и клеточная биология» и П1250 «Проведение поисковых научно-исследовательских работ по направлению «Фундаментальная медицина и физиология» в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Способ определения относительной площади волокон коллагена в гистологическом препарате : пат. 2332665 Рос. Федерация : МПК G01NЗЗ/48
(2006.01) / Шурыгин М.Г., Дремина Н.Н., Шуры-гина И.А., Мачхин И.Н., Антипина С.Л. ; заявитель и патентообладатель ГУ Науч. центр реконстр. и восстанов. хирургии ВСНЦ СО РАМН. — № 2006142273/15 ; заявл. 29.11.06 ; опубл. 27.08.08, Бюл. № 24. — 8 с. : ил.
2. Bellini A., Mattoli S. The role of the fibrocyte, a bone marrow-derived mesenchymal progenitor, in reactive and reparative fibroses // Laboratory Investigation. — 2007. — Vol. 87. — P. 858 — 870.
3. Flavell S.J., Hou T.Z., Lax S. et al. Fibroblasts as novel therapeutic targets in chronic inflammation // Br. J. Pharmacol. — 2008. — Vol. 153. — P. 241 —246.
4. Oltmanns U., Issa R., Sukkar M. et al. Role of c-jun N-terminal kinase in the induced release of GM-CSF, RANTES and IL-8 from human airway smooth muscle cells // Br. J. Pharmacol. — 2003. — Vol. 139, N 6. — P. 1228—1234.
Сведения об авторах
Гранина Галина Борисовна - клинический ординатор Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН.
Зеленин Николай Вадимович - студент 4 курса лечебного факультета Иркутского государственного медицинского университета.
Шурыгина Ирина Александровна - д.м.н., в.н.с. Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН.
Шурыгин Михаил Геннадьевич - д.м.н., зав. научно-лабораторным отделом Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (664003, г Иркутск, ул. Борцов Революции, 1; тел.: 8 (3952) 29-03-69; e-mail: shurygin@rambler.ru).
Лепехова Светлана Александровна - к.б.н., зав. отделом экспериментальной хирургии с виварием Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН.
Зеленин Вадим Николаевич - д.м.н., в.н.с. Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН.
