CC BY
57
УДК 616.74-001.4-08:615.217.5
И.А. Шурыгина, М.Г. Шурыгин, Г.Б. Гранина, Н.В. Зеленин
ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ p38 И JNK МАР-КИНАЗ НА РЕПАРАТИВНЫЙ ПРОЦЕСС И ЭКСПРЕССИЮ ГЛАДКОМЫШЕЧНОГО а-АКТИНА В ПОПЕРЕЧНО-ПОЛОСАТОЙ МУСКУЛАТУРЕ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ
Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (Иркутск)
Изучена экспрессия а-гладкомышечного актина в скелетной мускулатуре при ее повреждении в условиях подавления активности. р38 и JNK МАР-киназных каскадов. Выявлена динамика изменения экспрессии изоформ, актина в области травмы, мышцы.. При этом, наиболее ранняя, и выраженная, активация, синтеза а-гладкомышечного актина в ответ, на альтерацию происходит, при блокаде JNK MAPK-каскада.
Ключевые слова: блокаторы p38 и JNK МАР-киназ, репарация
INFLUENCE OF P38 AND JNK МДР-KINASE BLOCKERS ON REPARATIVE PROCESS AND EXPRESSION OF SMOOTH MUSCULAR а-ACTIN IN SKELETAL STRIATED MUSCLES AT THE INJURIES
I.A. Shurygina, M.G. Shurygin, G.V. Granina, N.V. Zelenin
Scientific Center of Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS, Irkutsk
Expression of smooth muscular a-actin in skeletal muscles at its injury under the conditions of suppression of activity of р38 and JNK МАР-kinase cascades is studied. Dynamics of change of expression of actin isoforms in muscular injury area is revealed. At that the earliest and. the most expressed, activation, of synthesis of smooth muscular a-actin in response to alteration, happens at the blockade of JNK MAPK-cascade.
Key words: p38 и JNK МАР-kinase blockers, reparation
Известно, что актин — один из наиболее консервативных белков, обнаруженный во всех эукариотических клетках и отвечающий за их подвижность. Характерной особенностью акти-новых нитей цитоскелета является их динамичность — микрофиламенты цитоскелета способны собираться и разбираться в зависимости от физиологического состояния клетки [1].
Выделяют три основные изоформы актина — а, р, у. а-актин входит в состав сократительного аппарата мышечных клеток, р- и у-актины являются компонентами цитоскелета. Хотя разница между изоформами актина невелика, доказано, что а-актин поперечнополосатых, сердечных и гладких мышц различается между собой [1].
Повреждения мышечных клеток могут сопровождаться переходом к набору изоформ актина, характерных для ранних стадий миоге-неза [2, 3].
Целью настоящего исследования явилось изучение экспрессии а-гладкомышечного актина в скелетной мускулатуре при ее повреждении в условиях подавления активности р38 и ^К МАР-киназных каскадов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Рану мышцы моделировали у самцов крыс линии Wistar весом 220 — 250 г в возрасте 9 мес. Эксперимент выполнялся в соответствии с нормами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных»
(Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12.08.1977 г.) по протоколу, одобренному Комитетом по биомедицинской этике НЦРВХ СО РАМН.
Под кетаминовым наркозом (кетамин 25 мг/кг, дроперидол 1,25 мг/кг и атропин 0,2 мг/кг) у крыс паравертебрально в области грудной клетки наносили рану до собственной фасции длиной 5 см. Затем вводили в рану действующее вещество. На равном расстоянии накладывали пять швов, сближающих края полученной раны.
Исследование проведено у 3 групп животных по 27 животных в группе:
1-я группа — контрольная;
2-я группа — изучение воздействия блокатора р38 МАР-киназы SB 203580 (Tocris bioscience, кат. № 1202 Bath № 4 A/95665);
3-я группа — изучение воздействия блокатора JNK MAP-киназы SP 600125 (Tocris bioscience, кат. № 1496 Bath № 7 A/B 1710).
В качестве контроля служили 3 интактных животных.
Выведение животных из эксперимента проводили в сроки от 6 часов до 30 суток (6 и 12 часов,
1, 3, 7, 14 и 30 суток). Фрагменты мышцы фиксировали раствором FineFix (Milestone, Италия), осуществляли проводку и заливку в парафиновые блоки, изготавливали серийные срезы толщиной 3 мкм. Срезы окрашивали иммуногистохими-ческим методом с помощью набора Novolink Polymer Detection System, RE7150-K (Novocastra). В качестве первичных антител при иммуногисто-
химическом окрашивании применяли антитела к а-гладкомышечному актину в рабочем разведении 1 : 300. Докрашивали гематоксилином. Заключали в среду Permanent Slide Mounting Medium (REF = RE7137, Lot 713708).
РЕЗУЛЬТАТЫ
При иммуногистохимическом исследовании мышцы у интактных животных окраска на а-гладкомышечный актин не зарегистрирована.
В ранние сроки раневого процесса (6 часов) ни в одной группе не зафиксировано специфического окрашивания.
В контрольной группе уже с 12 часов зафиксирована окраска единичных мышечных волокон в зоне интактной мышцы, прилегающей к месту повреждения, при этом подобных проявлений в области повреждения не прослеживается. Окраска единичных волокон в интактной зоне регистрировалась в течение всех дальнейших сроков наблюдения. С 24 часов начинает выявляться окраска мышечных волокон в зоне нанесения травмы с пиком выраженности на 7-е сутки, в более поздние сроки окрашиваются единичные волокна (рис. 1). Кроме мышечных волокон в сроки 3 и 7 суток отмечена специфическая окраска эндотелиоцитов в зоне регенерации.
Рис. 1. Умеренная окраска на а-гладкомышечный актин мышечных волокон и эндотелиоцитов в области травмы мышцы, контрольная группа, 3-и сутки.
Применение блокатора р38 МАРК снижало интенсивность и длительность экспрессии гладкомышечного актина. Так, в интактной зоне наблюдалось низкоинтенсивное окрашивание в сроки от 24 часов до 30 суток. В зоне повреждения мышцы через 3 суток наблюдалось слабое окрашивание, преимущественно по периферии мышечного волокна, а также яркая окраска эндотелиоцитов в данной зоне, на 7 — 14-е сутки интенсивность окрашивания возрастала, а на 30-е сутки сохранялось лишь слабое окрашивание зоны регенерации мышцы (рис. 2).
Рис. 2. Слабо выраженная окраска на a-гладкомышечный актин в области травмы мышцы, умеренно ярко окрашенные эндотелиоциты, применение блокатора р38, 3-и сутки.
Применение блокатора JNK МАРК вело к разнонаправленным изменениям в экспрессии гладкомышечного актина в интактной зоне и зоне повреждения — в интактной зоне слабо окрашивались лишь единичные волокна с 1-х по 14-е сутки (рис. 3), в то время как в зоне повреждения умеренная окраска отмечена уже через 12 часов, с 1-х по 7-е сутки в области травмы отмечалась выраженная экспрессия гладкомышечного а-актина, интенсивность которой на 14-е и 30-е сутки резко снижается. В частности, на 3-и и 7-е сутки в области травмы наблюдалась яркая окраска мышечных волокон, большое количество ярко окрашенных эндотелиоцитов в области роста грануляционной ткани, а также значительное количество фибробластов, положительно окрашенных на гладкомышечный актин, что позволяет отнести данные клетки к миофибробластам (рис. 4).
Рис. 3. Окраска на а-гладкомышечный актин единичного мышечного волокна в интактной мышце, применение блокатора JNK, 3-и сутки.
с
Л , 2G11, 4 (8G), 1
Рис. 4. Яркая окраска на а-гладкомышечный актин в области травмы мышцы, окрашены мышечные волокна, эндотелиоциты, большое количество фибробла-стов, применение блокатора JNK, 3-и сутки.
Таким образом, нами зафиксировано изменение изоформ актина в области травмы мышцы, что, по нашему мнению, связано с репаративным процессом в зоне повреждения. При этом на
интенсивность экспрессии наибольшее влияние оказывал блокатор JNK, который вызывал раннюю и ярко выраженную экспрессию гладкомышечного актина в зоне повреждения мышцы.
Работа выполнена при поддержке грантов П803, П1250, 14.740.11.0176, финансируемых Министерством образования и науки РФ в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Хайтлина С.Ю. Механизмы сегрегации изоформ актина в клетке // Цитология. — 2007. - Т. 49, № 5. - С. 345-354.
2. Chaponnier C., Gabbiani G. Pathological situations characterized by altered actin isoform expression // J. Pathol. — 2004. — Vol. 204. — P. 384-395.
3. Moll R., Holzhausen H.-J., Mennel H.-D. et al. The cardiac isoform of a-actin in regenerating and atrophic skeletal muscle, myopathies and rhabdomyomatous tumors: an immunohistochemi-cal study using monoclonal antibodies // Virchows Arch. - 2006. - Vol. 449. - P. 175-191.
Сведения об авторах
Шурыгина Ирина Александровна - доктор медицинских наук, заместитель директора по научной и инновационной работе Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (664003, г. Иркутск, ул. Борцов Революции, 1; тел.: 8 (3952) 29-03-69)
Шурыгин Михаил Геннадьевич - доктор медицинских наук, заведующий научно-лабораторным отделом Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РаМн (664003, г. Иркутск, ул. Борцов Революции, 1; тел.: 8 (3952) 29-03-69)
Гранина Галина Борисовна - младший научный сотрудник научно-лабораторного отдела Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (664003, г. Иркутск, ул. Борцов Революции, 1; тел.: 8 (3952) 29-03-69) Зеленин Николай Вадимович - лаборант научно-лабораторного отдела Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (664003, г. Иркутск, ул. Борцов Революции, 1; тел.: 8 (3952) 29-03-69)
