CC BY
31© Н.Н.КОСТЮКОВА, В.А.БЕХАЛО, 2015 Н.Н.Костюкова, В.А.Бехало
ПНЕВМОКОККОВЫЕ БИОПЛЕНКИ КАК ФОРМА ПЕРСИСТЕНЦИИ: ОБРАЗОВАНИЕ, СТРУКТУРА, РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ, ИММУННЫЙ ОТВЕТ
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Представлен обзор работ о пневмококковых биопленках как форме персистенции. Рассмотрены следующие положения: формирование пневмококковой биопленки на абиотических и мукозных поверхностях, патогенетическое значение биопленочных пневмококков, их иммуногенность, а также устойчивость к антибиотикам и неблагоприятным факторам внешней среды. Показаны различия между свойствами биопленок, образованных in vivo и in vitro. Подчеркивается значение образования пневмококковой биопленки как способа выживания в течение длительного времени.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 55—62
Ключевые слова: персистенция, пневмококк, биопленки
N.N.Kostyukova, V.A.Bekhalo
PNEUMOCOCCAL BIOFILMS AS A FORM OF PERSISTENCE: FORMATION, STRUCTURE, ROLE IN PATHOGENESIS, IMMUNE RESPONSE
Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
A review of studies on pneumococcal biofilms as a form of persistence is presented. The following provisions are examined: formation of pneumococcal biofilm on abiotic and mucosal surfaces, pathogenetic significance of biofilm pneumococci, their immunogenicity, as well as resistance to antibiotics and unfavorable environmental factors. Differences between biofilm properties, that are formed in vivo and in vitro, are shown. The significance of pneumococcal biofilm formation as means of survival for a long time is underscored.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 55—62
Key words: persistence, pneumococcus, biofilms
Подобно большинству бактериальных обитателей слизистых оболочек дыхательных путей, Streptococcus pneumoniae в процессе колонизации образует биопленку Биопленка представляет собой необратимо прикрепленное к поверхности сообщество микроорганизмов одного или нескольких видов, встроенное в матрикс, образованный самими микроорганизмами [2,6,15,18] В настоящее время образование биопленки рассматривают как стратегию выживания бактериальной популяции, а также как резервуар микроорганизма для захвата новых поверхностей и новых хозяев. Способность к образованию биопленок в разной степени присуща всем штаммам популяции вида S. pneumoniae [5, 20, 27, 32]. Более того, уже признано, что колонизация мукозного эпителия заключается именно в образовании биопленки [5, 12, 24, 32, 39] и что биопленка является формой персистенции пневмококка в организме человека [12, 20, 30]. Иными словами, бактерионосительство, то есть бессимптомная колонизация пневмококком дыхательных путей, реализуется в виде биопленки. Переход острой пневмококковой инфекции в хронический процесс также сопровождается образованием биопленки. Биопленка, в свою очередь, является формой персистенции пневмококка. Однако, чтобы сформулировать данные положения, наука должна была пройти немалый путь. Существенный прогресс на этом пути наметился в последнее 10-летие ХХ века и позднее. Изучение пневмококковых биопленок вначале происходило на абиотических поверхностях, преимущественно на стекле и полистироле, а также в проточных культурах. Позднее параллельно стали разрабатываться способы воспроизведения биопленок in vivo. Удалось моделировать колонизацию дыхательных путей при интраназальном заражении инбредных мышей и воспроизвести элементы колонизации на культурах эпителия дыхательных путей человека [12, 24]. Успешному изучению биопленок
способствовало расширение возможностей электронной микроскопии, особенно сканирующей конфокальной лазерной, а также использование люминесцентных, в том числе биолюминесцентных красителей [2, 4 ,6,8]. Огромный вклад в изучение биопленок внесли генетические методы [2, 6]. Однако вплотную именно пневмококковыми биопленками исследователи занялись только в нулевые годы XXI века, но продолжают интенсивно заниматься ими и в настоящее время.
Бактерионосительство является основным источником и резервуаром возбудителя пневмококковой инфекции. Введенная недавно массовая иммунизация пневмококковыми типоспе-цифическими вакцинами привела к снижению заболеваемости генерализованными и локализованными формами пневмококковой инфекции, но значение этого мероприятия в отношении носительства пневмококка и, тем более, в составе биопленок, остается неясным.
Образование биопленки пневмококком, как и другими бактериями, начинается с адгезии (прилипания) бактериальных клеток к эпителию слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Перед этим пневмококк должен преодолеть ряд факторов защиты слизистой оболочки — вязкий слой слизи, биение ресничек, действие секреторных антител, противостояние со стороны сопутствующей флоры. Проникновению пневмококка сквозь слой слизи способствует отрицательный заряд его поверхностных структур (капсульный полисахарид, а также холин-связывающие белки PspA и CbpA) [3, 22]. Биение ресничек останавливает токсин пневмококка пневмолизин Ply, а фермент нейраминидаза Nan способствует разжижению слизи. Адгезия к эпителиальным клеткам происходит за счет поверхностных белков — адгезинов CbpA, PhoP, PsrP, специфически связывающихся с соответствующим рецепторами на эпителиальных клетках, и с помощью так называемых «липких молекул» (MSCRAMM), прикрепляющихся ко многим компонентам соединительной ткани и крови человека [3]. Существенную роль в адгезии к эпителию играют пили — многочисленные тончайшие волоски белковой природы, выросты клеточной стенки пневмококка, обладающие липкими концами. Пили экспрессиру-ют не все штаммы пневмококка [ 3, 33].
Закрепившись на эпителии, клетки пневмококка получают возможность размножаться и формировать колонии, то есть колонизировать эпителий. Именно в этот период из колоний образуются агрегаты (скопления), которые начинают обрастать матриксом — своеобразной субстанцией, вырабатываемой самими бактериями и призванной защищать их от неблагоприятных условий внешней среды. В первые часы адгезия носит обратимый характер, однако с появлением матрикса образовавшаяся биопленка уже прочно прикреплена к эпителиальной поверхности.
Матрикс превращает бактериальное сообщество в единую структуру. Материал матрикса образуется самими бактериями. Матрикс пневмококковой биопленки состоит из белков, полисахаридов и ДНК, образующейся при аутолизе бактерий с помощью аутолитических ферментов — муреин-амидаз, прежде всего CbpD, а также LytA и LytC [3, 22, 30], и элементов тканей хозяина [12]. Холин-связывающий белок пневмококка CbpD вызывает «фратрицид» (или «братоубийство») некомпетентных клеток популяции пневмококка путем лизиса, обеспечивая компетентные клетки источниками питания, трансформирующей ДНК, а также способствуя усилению защитного матрикса [11, 30]. Разрушению части популяции с последующим выходом ДНК способствует и активация пневмококковых профагов, переходящих в литические [14]. Находящаяся в матриксе экзогенная ДНК служит постоянным материалом для естественной трансформации внутри биопленки [6]. Именно в биопленке происходит активация генетической трансформации пневмококков. Так, при одновременном нахождении в биопленке двух штаммов частота трансформации in vivo превышает 102, в то время как при экспериментальном сепсисе трансформация в крови происходит в десятки миллионов раз реже [25]. Отдельные микроколонии скреплены с помощью ДНК [20]. ДНК присутствует в свободном состоянии и в виде комплекса с белком, преимущественно с лизоцимом пневмококка LytC [16]. Полисахариды матрикса имеют другой состав, чем капсульный полисахарид [16]. Сканирующая электронная микроскопия замороженных биопленок выявила, что пневмококковый матрикс напоминает соты, в полости которых находятся бактериальные клетки [ 30].
Оказалось, что разные штаммы — клинические изоляты не одинаковы в отношении формирования биопленки [20, 24], по крайней мере in vitro, на абиотических поверхностях, и могут быть разделены примерно на две группы: с высоким и с низким биопленко-образующим индексом (BFI). Кроме этого показателя штаммы различаются по числу живых и неживых клеток в биопленках и по кинетике их образования. С помощью метода флюоресцентной гибридизации in situ [4] и визуализации путем конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Hall-Stoodley L. et al. [20] изучили процесс формирования биопленки in vitro у 6 штаммов пневмококка, относящихся к двум разным упомянутым группам. Все штаммы формировали биопленку к 6 дню наблюдения. Через 24 часа с начала наблюдения все штаммы
были прикреплены к поверхности и представляли собой гетерогенную структуру, состоящую из отдельных клеток, коротких цепочек и мелких скоплений ланцетовидных клеток. К 3 дню скопления клеток разных штаммов стали различаться — одни формировали крупные многослойные «башни» высотой 25 мкм, у других эти скопления не превышали 5 — 10 мкм, но образовывалось много мелких плотных микроколоний. Толщина биопленок обоих вариантов разнилась более, чем в 2 раза. Состав матрикса биопленок in vitro негомогенен: «башенки» скреплены полисахаридами и не содержат ДНК. Оказалось, что клетки двух вариантов по BFI различались и по устойчивости к азитромицину. В этом, а также в других исследованиях[10, 21, 24, 30, 41] выявлена модуляция капсул в процессе формирования биопленки. Во время прохождения через слой слизи капсула хорошо выражена, так как пневмококку на этой стадии необходима защита от фагоцитов, антител и прочих неблагоприятных факторов [3, 33]. При соприкосновении с поверхностью эпителия капсула истончается и местами исчезает, благодаря чему обнажаются и выступают упомянутые адгезивные молекулы, расположенные на поверхности бактериальной клетки под капсульным слоем. Капсула мешает не только плотной адгезии к эпителию, но и скреплению бактериальных клеток между собой в составе агрегатов [10, 29] . Однако часть клеток внутри «башенок» экспрессирует капсулы [20]. Модуляция капсул в процессе формирования биопленки регулируется геном cpsA, который ингибирован на стадии адгезии [20, 34, 39, 41] и не зависит от BFI-штамма. В процессе образования биопленки происходит селекция бескапсульного фенотипа, однако отрывающиеся с поверхности планктонные клетки опять обладают капсулами.
В образовании биопленок in vitro отмечено участие токсина — пневмолизина, который по данным Shak С. et al. [44] также играет роль адгезина, скрепляющего клетки пневмококка друг с другом, но только в первые 24 часа.
Изучение процесса образования биопленок in vivo на слизистой оболочке носовой перегородки мышей, зараженных пневмококком интраназально, внесло некоторые коррективы в описанную схему [12]. Во-первых, оказалось, что в состав матрикса биопленки, образованной in vto, помимо продуктов бактериального происхождения, входят белки и клетки эпителиальной ткани хозяина и клетки воспаления. Во-вторых, выяснилась неодинаковая значимость бактериальных факторов в формировании биопленок, отличная от таковой при образовании биопленок на абиотических поверхностях [12] . Так, безусловно необходимы для образования биопленок in vitro и in vivo поверхностный адгезивный белок PsrP — богатый серином и обеспечивающий прикрепление пневмококка к легочной ткани, а также сцепление клеток пневмококка друг с другом; SpxP — энзим пируват-оксидаза, ответственный за продукцию пневмококком перекиси водорода и защищающий от нее [36]; CiaRH — двухкомпонентная кислород-чувствительная система, опосредующая ответ пневмококка на стресс и защищающая его от лизиса[12, 28]. А факторы, считавшиеся необходимыми для пленкообразования in vitro [30], in vivo проявили себя менее активно. Так, мутант, не имевший главного адгезина CbpA, формировал биопленки, но более тонкие и менее сложные по структуре, чем исходный родительский штамм. Мутанты, не вырабатывающие LytA и Ply, формировали тоже более тонкие пленки, содержащие небольшие агрегаты клеток пневмококка [12]. Менее значимым оказался и белок LuxS — S-рибозил-гомосерин лиаза, ответственная за лактоновый аутоиндуктор АЬ2, участвующий в системе QS при образовании биопленки. In vivo биопленка вначале формируется на поверхности эпителиального слоя, но затем эпителий слущивается и пленка оказывается прямо на базальной мембране [12].
Максимальное число живых клеток в биопленке in vivo наблюдалось на 3 — 5 дни после интраназального заражения и постепенно снижалось на два порядка к 14 дню. In vivo не найдено корреляции между способностью колонизовать слизистую мышей и плотностью биопленки, но величина бактериальных агрегатов, образуемых in vivo, относительно (не полностью) совпадала с их размерами in vitro [12]. Биопленки, выращенные in vitro, менее организованные, чем in vivo [24]. Эти сведения о различиях биопленок, формируемых in vitro и in vivo, необходимы, во-первых, для того, чтобы результаты исследований, полученных in vitro, не переносились автоматически на биопленки in vivo и, во-вторых, для разработки мер борьбы с биопленками на абиотических поверхностях — пластиковых трубках, протезах и прочих приспособлениях, применяющихся в медицине. Биопленки, сформированные на культурах эпителиальной ткани, близки к таковым, образованным in vivo [24].
Оказалось, что биопленки в равной мере способны образовывать штаммы пневмококка, выделенные как от носителей, так и от больных с генерализованной инфекцией [20, 23]. Начальные этапы формирования биопленки, по крайней мере, в первые 18 часов in vitro, не зависели от исходной вирулентности (степени патогенности) штамма [23].
Бактерии, формирующие биопленку, представляют собой фенотип, отличающийся от планктонных клеток, и эти отличия проявляются, в частности, в снижении вирулентности. Еще в
2006 г. Oggioni N.R. et al. [34] показали, что пневмококки, вызвавшие сепсис и выделенные из крови, по вирулентности сходны с планктонными клетками. Биопленочные клетки пневмококка, в сравнении со своими высоко вирулентными планктонными собратьями, значительно менее вирулентны, вплоть до неспособности вызывать бактериемию у мышей [12, 39 ]. Marks L.R. et al. показали, что пневмококки из биопленки, выросшей на тканевой культуре бронхиального эпителия, неспособны проникать в клетки. Биопленочные пневмококки имели в 33 раза сниженную инвазивность по сравнению с планктонными в культуре клеток носоглоточного эпителия [12]. Снижение вирулентности связано, прежде всего, с истончением и даже отсутствием капсул у бактерий, заключенных в биопленку. Одной из причин ослабления вирулентности пневмококков, заключенных в биопленки, является снижение ими выработки токсина пневмолизина на стадии зрелости [39]. Наряду со сниженной инвазивностью биопленочные пневмококки, как и следовало ожидать, оказались «гиперадгезивными» [12, 39] и активно колонизировали респираторный эпителий по сравнению с планктонными. Повышенная адгезивная активность объясняется увеличением продукции поверхностных адгезивных белков PhoP, CbpA, PsrP и нейраминидазы NanA, расщепляющей сиаловую кислоту слизи и, тем самым, обнажающей скрытые рецепторы эпителия для адгезинов пневмококка [35, 39]. Увеличение продукции фосфорилхолина PhoP и его связывание с С-реактивным белком крови приводит к образованию комплекса, активирующего комплемент по классическому пути. Этот комплекс, в свою очередь, усиливает опсонизацию клеток пневмококка, что делает его менее защищенным от фагоцитоза и литического действия комлемента.
В популяции пневмококков, находящихся в биопленке, селекционируются клетки фенотипа так называемых прозрачных колоний, с тонкими капсулами или без них, но богатых тейхоевой кислотой с адгезинами PhoP, CbpA и PsrP. Планктонные клетки этих же штаммов обычно образуют опалесцирующие колонии благодаря обилию капсульного полисахарида. По этим причинам у носителей чаще выделяют прозрачные колонии, а из крови и ликвора — опалесцирующие [10, 39]. Капсулированные клетки мутных или опалесцирующих колоний в начале образования биопленки подвергаются массовой гибели, способствуя формированию матрикса благодаря выходу ДНК и других клеточных субстанций. Однако при переходе пневмококков из биопленки к новому хозяину вначале снова восстанавливаются мутные капсулированные варианты, необходимые для создания новой биопленки, после чего разрушаются. Следовательно, гибель и восстановление клеток зависит от фазовых вариаций пневмококка [48], возникающих в процессе формирования и существования биопленки [10, 39, 44]. Полагают, что мутные варианты ответственны, в конечном итоге, за образования матрикса, а высокоадгезивные прозрачные — за захват нового хозяина [39].
Планктонные клетки, оторвавшиеся от биопленки, сохраняли высокую способность колонизировать носоглотку мышей, но были авирулентны при внутрибрюшинном введении, хотя вызывали пневмонию при заражении интратрахеально. Был сделан вывод, что оторвавшиеся от биопленки планктонные клетки представляют собой промежуточный фенотип со специфически нарушенной способностью к транслокации в кровоток и выживания в нем [39]. Однако в работе Marks L. R. et al. [26] показано, что переход к манифестным, местным и инвазивным формам происходит за счет фенотипа диспергированных клеток, то есть только что оторвавшихся от зрелой биопленки. Эти дисперсные клетки в опытах на культуре бронхиального эпителия и на мышиных моделях проявляли более слабую адгезивность, чем биопленочные и даже планктонные (бульонные) пневмококки, но превосходили их по инвазивности, токсичности и способности к диссеминации в организме. Экспрессия генов, кодирующих капсулы (cps), токсинообразование (ply), адгезию и инвазию (pavA) и мутность колоний (локус licD2) проявлялась сильнее, чем у биопленочных и даже бульонных клеток, а экспрессия генов, ответственных за адгезию и колонизацию, снижена.
Дисперсия пневмококковых биопленок и образование фенотипа, способного вызвать манифестный инфекционный процесс, в том числе генерализованный, происходит благодаря сигналам со стороны организма хозяина. К числу таких сигналов Marks L. R. et al. [26] относят гипертермию (>37°С), так как в норме температура в носоглотке близка к 34°С, а также сигнальные молекулы — АТФ, глюкоза, норэпинефрин (нейротрансмиттер), появляющиеся при нарушении среды носоглотки. При бессимптомном существовании биопленки в носоглотке имеется равновесие между ней и условиями среды. К числу важнейших факторов нарушений этого равновесия авторы относят вирусную инфекцию. Образующийся под влиянием сигналов хозяина дисперсный фенотип ответственен не только за манифестацию инфекции, но и за передачу пневмококка новому хозяину.
Оказалось, что формирование различных по вирулентности фенотипов зависит от локализации пневмококков в организме человека. Так, клетки, принадлежащие к одному и тому же серотипу 3 и к одинаковым сиквенс-типам, но выделенные из разных участков тела, различа-
лись по вирулентности. Фенотип, образовавший биопленку на слизистой полости среднего уха, не вызывал бактериемию у мышей при интраназальном заражении, но активно колонизировал эпителий их носоглоточной и ушной полости. Напротив, изоляты из крови нестабильно колонизировали носоглотку при интраназальном заражении, но быстро проникали в кровь [44]. Эти данные находятся в некотором противоречии с наблюдениями Lizcano А. et al. [23], не нашедших различий между происхождением штаммов и их способностью вызывать колонизацию или бактериемию. Возможно, это расхождение связано с тем, что авторы работали с биопленочными культурами из не одних и тех же локусов (Lizcano А. et al. брали изоляты из носоглотки, а Trappetti С. et al. [44] — из среднего уха), то есть с уже сформировавшимися разными фенотипами. Во всяком случае, необходимо признать, что в процессе формирования и разрушения биопленки, в зависимости от условий, образуется несколько фенотипов пневмококка, различающихся по ряду признаков, в том числе по органотропности и вирулентности
[9, 26].
Пневмококки, находящиеся в биопленке, отличаются от планктонных клеток и по имму-ногенным свойствам. Исследований, касающихся иммунного, в том числе защитного, ответа на бактериальные биопленки и их элементы, пока немного [1,8]. Прежде всего, матрикс создает механическую преграду между бактериями и факторами защиты хозяина — фагоцитами, антителами, комплементом. Но кроме этой преграды на иммунный ответ влияют и изменения антигенных свойств биопленочных бактерий. В многоплановой работе Sanchez С. et al. [40] в проточных культурах показано, что причиной этих изменений является белковый профиль биопленочных пневмококков, значительно отличающийся от такового у их планктонных собратьев. Еще в 2006 г. при изучении белкового профиля бактерий, заключенных в зрелую биопленку in vitro, было показано, что она содержала до 30% новых белков по сравнению с планктонными формами в экспоненциальной фазе роста [9]. Sanchez С. et al. [40], используя в качестве антигенных препаратов лизаты биопленочных и планктонных пневмококков в им-муноблоттинге с сыворотками мышей, иммунизированных убитыми биопленочными клетками, выявляли антитела далеко не ко всем антигенным вариантам. В сыворотках мышей отсутствовали многие перекрестно-реагирующие (межтиповые) антитела, характерные для сывороток людей, перенесших пневмококковую пневмонию. Эти же сыворотки мышей (иммунизированных биопленочными пневмококками) не защищали от экспериментальной ин-вазивной инфекции, вызванной планктонными клетками. Такие сыворотки слабо «узнавали» или вовсе «не узнавали» многие белки в лизатах планктонных клеток. Природу интересующих авторов белков определяли с помощью матрично-связанной лазерной десорбционно-ионизирующей время-пролетной спектрометрии. Единственный протективный антиген пневмококка, встречавшийся и в биопленочных, и в планктонных клетках, был белок PsrP. Этот белок играет двойную роль в адгезии — участвует в адгезии к легочному эпителию (точнее, к его компоненту — кератину 10) и скрепляет клетки пневмококка между собой при формировании биопленки [38]. Интересно, что этот протективный белок встречается и у других видов альфа-гемолитических стрептококков. Однако он выявлен только у 50 — 60% циркулирующих штаммов пневмококка, независимо от их происхождения, и связан с определенными серотипами и даже генетическими клонами [31]. Количество других важнейших для вирулентности пневмококковых белков — энолазы, пируват-оксидазы, пневмолизина в биопленочных клетках было резко снижено. Низкая эффективность протективных антигенов пневмококков, заключенных в биопленки, подтверждается случаями возникновения инвазивных форм у детей, несмотря на предшествующую колонизацию. Снижение общего количества белков в биопленочных бактериях свидетельствует об их пониженной синтетической и метаболической активности, о чем упоминали первые исследователи биопленок [15], и что связано с изменениями в генах, кодирующих белки [20, 29].
На культуре макрофагов, а также в опытах in vivo было показано, что в процессе развития биопленки в носоглотке мышей наблюдается снижение провоспалительных цитокинов — TNF-a, IL-6, IL-ф. Это проявляется в отсутствии признаков воспаления при колонизации и формировании биопленки [12]. Интересно, что мутанты по белку PsrP при колонизации вызывают сильную продукцию провоспалительных цитокинов [12]. Сделан вывод, что пневмококки, заключенные в биопленку, представляют собой слабо иммуногенный фенотип. Низкая иммуногенность биопленочных пневмококков вкупе с их сниженной инвазивностью объясняет отсутствие симптомов воспаления при длительном носоглоточном носительстве.
Имеются сведения о фагоцитарной реакции на биопленки. Феномен проникновения лейкоцитов в биопленки, несмотря на наличие матрикса, известен, особенно на абиотических поверхностях [1]. Однако активность фагоцитоза биопленочных клеток зависит как от вида микроорганизма, так и от степени зрелости биопленки [8]. В частности, в отношении пневмококка показано [17], что в этом процессе участвуют провоспалительные цитокины, синтез
которых, как уже говорилось, снижен, если не подавлен [12]. При этом, несмотря на усиленное потребление кислорода, снижена выработка фагоцитами губительной для бактерий перекиси водорода [1, 8]. В блестяще выполненном исследовании [17] in vitro показано, что повышенная устойчивость биопленочных пневмококков к профессиональным фагоцитам человека объясняется выявленным авторами снижением путей активации комплемента в биопленке. Следовательно, фагоцитоз также не вносит существенного вклада в защиту от биопленок, особенно зрелых. Однако известно, что погибшие нейтрофилы могут проявлять губительное действие на биопленочные бактерии с помощью так называемых нейтрофильных экстрацел-люлярных «ловушек» NET [8, 13]. Эти «ловушки» состоят из сети актина и нитей ДНК распавшихся нейтрофилов, удерживающей бактерицидные пептиды и ферменты, и призванные «добивать» бактериальные патогены [43]. Они локализуют бактерии, предотвращая их распространение, и осуществляют их гибель [13]. Brinkmann V et al. [13] считают образование NET проявлением врожденного иммунитета.
Следует указать, что не всегда при развитии пневмококковой биопленки отсутствуют признаки воспаления. Так, при формировании биопленки (и необязательно пневмококковой) на слизистых оболочках полости среднего уха и синусов носа наблюдается затяжной хронический воспалительный процесс [5, 12, 37], реализующийся в виде хронического или рецидивирующего среднего отита. При этом в очаге воспаления наблюдается приток фагоцитов — макрофагов и нейтрофилов и образование NET. В воспалительном экссудате среднего отита в «ловушках» обнаруживаются частички биопленки, содержащие пневмококки, не погибшие под действием бактерицидных агентов нейтрофилов. По мнению исследователей именно NET являются причиной рецидивирующих и хронических средних отитов у детей [43, 37]. Попавшие в нейтрофильные «ловушки» частицы биопленки вместе с пневмококками оказываются защищенными от факторов фагоцитарного киллинга, благодаря чему колонизация из бессимптомной переходит в хроническое или рецидивирующее местное воспаление, характерное для полости среднего уха.
Одной из важнейших особенностей биопленочных бактерий является их устойчивость к внешним физическим факторам. Исследования, выполненные на планктонных клетках, свидетельствовали о низкой устойчивости пневмококка к высыханию, хотя некоторые из них говорили об обратном. Возможность длительного сохранения пневмококка на предметах внешней среды заподозрили еще R.G.Hodges and C.M.McLeod в 1946 г. (цит. по [27]) на основании эпидемиологических наблюдений. Скорее всего, различия результатов были связаны с тем, что некоторые авторы имели дело с планктонными пневмококками, а другие — с организованными в биопленки. В недавно опубликованной работе Marks L.R. et al. [27] показано, что биопленочные пневмококки высоко устойчивы к высыханию по сравнению с планктонными (бульонными), сохраняя при этом инфективность, т.е способность колонизировать носоглотку мышей. В отличие от планктонных клеток, выживающих на поверхности рук не долее 3 мин, биопленочные пневмококки сохранялись на поверхности рук три часа (срок наблюдения). Жизнеспособные пневмококки высевались с поверхности мягких игрушек в детском саду. Эти наблюдения выявили немаловажную роль биопленок в бытовом пути передачи пневмококка от инфицированного лица новому хозяину с помощью рук и предметов обихода (не отрицая при этом главенствующей роли аэрозольного механизма).
Уже первые исследователи бактериальных биопленок указывали на более высокую устойчивость биопленочных бактерий к антибиотикам [2, 6, 15, 18], в том числе и пневмококков. Так, пневмококки из 6-дневной зрелой биопленки in vitro были в 1000 раз устойчивее к ази-тромицину, чем планктонные, в зависимости от штамма [20]. Многократное приобретение устойчивости к гентамицину и жнициллину биопленочных пневмококков было показано in vivo [24]. В недавно опубликованной работе [45] на моделях пневмококковых биопленок in vitro — молодых (наивных) и 11-дневных индуцированных, т.е. сформированных из клеток, отрывающихся от наивных биопленок, четко показано, что, во-первых, пневмококки в индуцированных биопленках более устойчивы к антибиотикам трех различных классов, чем в наивных, и, во-вторых, эта устойчивость неодинакова по отношению к разным классам антибиотиков. Наиболее активными в отношении зрелых индуцированных биопленок оказались фторхинолоны (левофлоксацин, моксифлоксацин), после них с небольшим отрывом шел пенициллин. Кларитромицин (макролид) был менее активен, причем одинаково по отношению к обоим видам биопленки. Причины устойчивости биопленочных пневмококков к антибиотикам мало изучены. Известно, что они аналогичны таковым, присущим и планктонным клеткам [7]. При этом, формируется множественная устойчивость к антибиотикам разных групп. Одна из возможных причин — формирование в биопленках клеток-персисторов, то есть фенотипа с заторможенным метаболизмом [6,7], на что указывает работа Sanchez С. et al. [40]. Персисторы фактически не содержат молекулярных мишеней для антибиотиков. Несомненную
роль играет и матрикс, защищающий от диффузии антибиотиков в толщу биопленки [2, 6, 7]. Кроме того, известно, что отдельные элементы матрикса ингибируют активность некоторых антибиотиков. Недостаток кислорода в биопленке также способствует накоплению разных мутаций, в том числе и антибиотикорезистентности [6, 7].
Многоклеточные бактериальные сообщества, которые представляют собой биопленки, регулируются системой QS, то есть системой межклеточных сигналов [2, 6, 30]. Именно в составе биопленок бактерии наиболее интенсивно обмениваются сигналами, которые координируют активность отдельных клеток. Система QS играет роль и в организации биопленки пневмококка [46]. Важнейшим регулятором системы QS является ген luxS. Этот ген выявлен у всех изученных штаммов пневмококка, независимо от их происхождения. Он регулирует уровень транскрипции гена lytA, кодирующего соответствующий белок — аутолизин LytA. Считается, что luxS является ключевым регулятором QS при образовании ранних (первые 24 часа) биопленок. Именно в этот период в формировании биопленок участвует пневмолизин Ply, освобождающийся благодаря аутолизину LytA, а позднее его роль не выявляется [5, 39]. Наиболее известной сигнальной молекулой QS при образовании пневмококковой биопленки является пептид-гомосериновый лактоновый аутоиндуктор А1-2. В его синтезе и участвует белок LuxS. Для поздней стадии образования биопленки существенную роль играет пептид CSP, участвующий в формировании компетентных клеток популяции пневмококка, необходимых для генетической трансформации. Как уже указывалось выше, от некомпетентных клеток популяция избавляется с помощью фратрицида. Более подробно механизм действия системы QS при формировании биопленок пневмококка описан в обзорах [ 1, 5, 30].
Представленные данные свидетельствуют, что значение биопленки, образуемой пневмококком, как и другими бактериями, состоит в защите популяции, увеличении вероятности ее постоянного обновления, а также в дополнительной возможности захвата нового хозяина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бехало В.А., Бондаренко В.М., Сысолятина Е.В., Нагурская Е.В. Иммунобиологические особенности бактериальных клеток медицинских биопленок. Журн. микробиол. 2010, 4: 97-104.
2. Гинцбург А.Л., Ильина Т.С., Романова Ю.М. «Quorom sensing» или социальное поведение бактерий. Журн. микробиол. 2011, 5: 86-93.
3. Костюкова Н.Н., Бехало В.А. Факторы патогенности пневмококка и их протективные свойства. Журн. микробиол. 2014, 3: 67-77.
4. Лямин А.В., Боткин Е.А., Жестков А.В. Методы выявления биопленок в медицине: возможности и перспективы. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2012, 14 (1): 17-22.
5. Маянский А.Н., Чеботарь И.В.,Лазарева А.В., Маянский Н.А. Пневмококковые биопленки. Молекулярная генетика, микробиол., вирусол. 2015, 1.
6. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки, как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина. Журн. микробиол. 2011, 3: 99-109.
7. Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Кончакова Е.Д., Лазарева А.В., Чистякова В.П. Антибиотикорезистент-ность биопленочных бактерий. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2012, 14 (1): 51-58.
8. Чеботарь И.В. Механизмы антибиопленочного иммунитета. Вестник РАМН. 2012, 12: 22-29.
9. Allegrucci M., Hu F.Z., Shen K. et al. Phenotypic characterization of Streptococcus pneumoniae biofilm development. J. Bacteriol. 2006, 188: 2325-2335.
10. Allegrucci M., Sauer K. Characterization of colony morphology variants isolated from Streptococcus pneumoniae biofilms. J. Bact. 2007, 189 (5): 2030-2038.
11. Berg K.H., Blornstad T.F., Ohnesborg J., Haverstein L.S. Properties and biological role of Streptococcal fratricines. Appl. Envir. Microbiol. 2012, 78 (10): 3515-3522.
12. Blanchette-Cain K., Hinojosa C.A., Akula Suresh Babu R. et al. Streptococcus pneumoniae biofilm formation is strain dependent, multifactorial, and associated with reduced invasiveness and immunoreactivity during colonization. Mbio. 2013, 4 (5): e00745-00713.
13. Brinkmann V., Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J. Cell Biol. 2012, 198 (5): 773-783.
14. Carrolo M., Frias M.J., Pinto F.R. et al. Prophage spontaneous activation promotes DNA release enhancing biofilm formation in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 2010, 5 (12): e15678.
15. Corsterton J.W, Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999, 284: 1318-1322.
16. Domenech M., Garcia E., Prieto A., Moscoso M. Insight into the composion of the intercellular matrix of Streptococcus pneumoniae biofilms. Environ. Microbiol. 2013a, 15: 502-516.
17. Domenech M., Ramos-Sevilliano E., Garcia E. et al. Biofilm formation avoids complement immunity and phagocytosis of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 2013b, 81 (7): 2606-2615.
18. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms ofclinical relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15: 167-193.
19. Gilley R.P., Orihuela C.J. Pneumococcal biofilms are not invasive: implications on nasopharyngeal colonization. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014, 4: 163-170.
20. Hall-Stoodley L., Nistico L., Sambanthamoorthy K. et al. Characterization ofbiofilm matrix, degradation by DNase treatment and evidence ofcapsule downregulation in Streptococcus pneumoniae clinical isolates. BMC Microbiol. 2008, 8: 173-199.
21. Hammerschmidt S., Wolf S., Hocke A. et al. Illustration ofpneumococcal polysaccharide capsule during adherence and invasion of epithelial cells. Infect. Immun. 2005, 87 (8): 453-467.
22. Jedrzejas M.Y. Pneumococcal virulence factors: structure and function. Microboiol. Mol. Biol. Rev. 2001, 65: 187-207.
23. Lizcano A., Chin T., Sauer K. et al. Early biofilm formation on microtiter plates is not correlated with the invasive disease potential of Streptococcus pneumoniae. Microb. Pathog. 2010, 48: 124-130.
24. Marks L.R., Parameswaran G.J., Hakansson A.P. Pneumococcal interactions with epithelial cells are crucial for optimal biofilm formation and colonization in vitro and in vivo. Infect. Immun. 2012, 80 (8): 27442760.
25. Marks L.R., Reddinger R.M., Hakansson A.P. High levels of genetic recombination during nasopharyngeal carriage and biofilm formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 2012, 3 (5): e00200-e00212.
26. Marks L.R., Davidson B.A., Knight P., Hakansson A.P. Interkingdom signaling induces Streptococcus pneumoniae biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to disease. mBio. 2013, 4 (4): 438413.
27. Marks L.R., Reddinger R.M., Hakansson A.P. Biofilm formation enhances fomite survival Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes. Infect. Immun. 2014, 82 (3): 1141-1146.
28. Mascher T., Heintz M., Zähner D. et al. The CiaPH system of Streptococcus pneumoniae prevents lysis during stress induced by treatment with cell wall inhibitors and by mutations in pbp2x involved in ß-lactam resistance. J. Bacteriol. 2006, 188 (5): 1959-1968.
29. Moscoso M., Claverys J.P. Release of DNA by competent Streptococcus pneumoniae: kinetics, mechanism and stability of the liberated DNA. Mol. Micribiol. 2004, 54 (3): 783-794.
30. Moscoso M., Garcia E., Lypez R. Pneumococcal biofilms. Internat. Microbiol. 2009, 12: 77-85.
31. Munoz-Almagro C., Selva L., Sanchez C.J. et al. PsrP, a protective pneumoccoccal antigen, is highly prevalent in children with pneumonia and is strongly associated with clonal type. Clin.Vaccine Immunol. 2010, 17 (11): 1672-1678.
32. Munoz-Elias E., Marcano J., Camilli A. Isolatoion of Streptococcus pneumoniae biofilm mutants and their characterization during nasopharyngeal colonization. Infect. Immune. 2008, 76 (11): 5049-5061.
33. Nelson A.L., Roche A.M., Gould J.M. et al. Capsula enhances pneumococcal colonization by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 2007, 75 (1): 83-90.
34. Oggioni M.R., Trappetti C., Kadioglu A. et al. Switch from planctonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Mol. Microbiol. 2006, 61 (5): 1196-1210.
35. Parker D., Soong G., Planet P. et al. The NanA neuraminidase of Streptococcus pneumoniae is involved in biofilm formation. Infect. Immun. 2009, 77 (9): 3722-3730.
36. Pericone Ch.D., Park S., Imalay J.A., Weiser J.N. Factors contributing to hydrogen peroxide resistance in Streptococcus pneumoniae include pyruvate oxidase (SpxB) and avoidance of the toxic effects of the Fenton reaction. J. Bacteriol. 2003, 185 (23): 6815-6825.
37. Reid S.D., Hong W., Dew K.E. et al. Streptococcus pneumoniae forms surface-attached communities in the middle ear of experimentally infected chinchillas. J. Infect. Dis. 2009, 199: 786-794.
38. Sanchez C., Shivshankar P., Stol K. The pneumococcal serine-rich repeat protein is an intraspecies bacterial adhesin that promotes bacterial aggregation in vivo and in biofilms. PLoS Pathog. 2010, 6 (8): e1001044.
39. Sanchez C.J., Kumar N., Lizcano A. et al. Streptococcus pneumoniae in biofilms are unable cause invasive disease due to altered virulence determinant production. PLoS One. 2011a, 6 (12): e28738.
40. Sanchez C., Hurtgen B., Lizcano A. et al. Biofilm and planctonic pneumococci demonstrate disparate im-munoreactivity to human convalescent sera. BMC Microbiol. 2011b, 11: 245-257.
41. Shainheit M.G., Mule M., Camilli A. The core promoter of the capsule operon of Streptococcus pneumoniae is necessary for colonization and invasive disease. Infect. Immun. 2014, 82 (2): 694-705.
42. Shak J.R., Lunderwick H.P., Howery K.E., Sakai F. et al. Novel role for the Streptococcus pneumoniae toxin pneumolysin in the assembly of biofilms. mBio. 2013, 4 (5): e00655-00613.
43. Thornton R.B., Wiertsema S.P., Kirkham L-A.S. et al. Neutrophil extracellular traps and biofolms in middle ear effusion of children with acute recurrent otitis media — a potential treatment target. PLoS One. 2013, 8 (2): e53837.
44. Trappetti C., van den Maten E., Amin Z. et al. Site of isolation determines biofilm formation and virulence phenotypes of Streptococcus pneumoniae serotype 3 clinical isolates. Infect. Immun. 2013, 81 (2): 505-513.
45. Vandevelde N.M., Tulkens P.M., Van Bambeke F. Antibiotic activity against naive and induced Streptococcus pneumoniae in vitro pharmacodinamic model. Antimicrib. Agents. Chemother. 2014, 58 (3): 1348-1358.
46. Vidal J.E., Ludewick H.P., Kunkel R.M. et al. The LuxS-dependent quorum-sensing system regulates early biofilm formation by Streptococcus pneumoniae strain D39. Infect. Immun. 2011, 79 (10): 4050-4060.
47. Walsh R.L., Camilli A. Streptococcus pneumoniae is dessication tolerant and infectious upon rehydratation. mBio. 2011, 2 (3): e00092-00011.
48. We1ser J.N., Austrian R., Sreenivasan P.K., Masure H.R. Phase variation in pneumococcal opacity: relationship between colonial morphology and nasopharyngeal colonization. Infect. Immun. 1994, 62 (6): 2582-2589.
Контактная информация: Костюкова Н.Н.,
123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (499)193-61-51
