CC BY
130studies in asthma and immune-mediated diseases. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2009, 9 (5): 401-408.
48. Olenchock S.A., May J.J., Pratt D.S., Morey P.R. Occupational exposures to airborne endotoxins in agriculture. Prog. Clin. Biol. Res. 1987, 231: 475-487.
49. Pope S.M., Brandt E.B., Mishra A. et al. IL-13 induces eosinophil recruitment into the lung by an IL-5- and eotaxin-dependent mechanism. J. Allergy Clin. Immunol. 2001, 108 (4): 594-601.
50. Punnonen J., Aversa G., Cocks B.G. et al. Interleukin 13 induces interleukin 4-independent IgG4 and IgE synthesis and CD23 expression by human B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993, 90 (8): 3730-3734.
51. Ray A., Cohn L. Th2 cells and GATA-3 in asthma: new insights into the regulation of airway inflammation. J. Clin. Invest. 1999, 104 (8): 985-993.
52. Rivera J., Fierro N.A., Olivera A., Suzuki R. New insights on mast cell activation via the high affinity receptor for IgE. Adv. Immunol. 2008, 98: 85-120.
53. Roche WR., Beasley R., Williams J.H., Holgate S.T. Subepithelial fibrosis in the bronchi of asthmatics. Lancet. 1989, 1: 520-524.
54. Savelkoul H.F, Seymour B.W, Sullivan L., Coffman R.L. IL-4 can correct defective IgE production in SJA/9 mice. J. Immunol. 1991, 146 (6): 1801-1805.
55. Shimoda K., van Deursen J., Sangster M.Y. et al. Lack of IL-4-induced Th2 response and IgE class switching in mice with disrupted Stat6 gene. Nature. 1996, 380 (6575): 630-633.
56. Szabo S.J., Sullivan B.M., Peng S.L., Glimcher L.H. Molecular mechanisms regulating Th1 immune responses. Annu. Rev. Immunol. 2003, 21: 713-758.
57. Wang M., Zhang Y, Han D., Zhang L. Association between polymorphisms in cytokine genes IL-17A and IL-17F and development of allergic rhinitis and comorbid asthma in Chinese subjects. Hum. Immunol. 2012, 73 (6): 647-653.
58. Wills-Karp M., Luyimbazi J., Xu X. et al. Interleukin-13: central mediator of allergic asthma. Science. 1998, 282 (5397): 2258-2261.
59. Xiao C., Puddicombe S.M., Field S.J. et al. Defective epithelial barrier function in asthma. Allergy Clin. Immunol. 2011, 128 (3): 549-556.
60. Zhou L., Ivanov I.I., Spolski R. et al. IL-6 programs T(H)-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways. Nat. Immunol. 2007, 8 (9): 967-974.
Поступила 22.01.14
Контактная информация: Балмасова Ирина Петровна, д.м.н., проф.,
127473, Москва, ул. Делегатская, 20, стр. 1, р.т. (495) 365-98-55
© Н.Н.КОСТЮКОВА, В.А.БЕХАЛО, 2014
Н.Н.Костюкова, В.А.Бехало
ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ ПНЕВМОКОККА И ИХ ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Благодаря бурному развитию молекулярно-биологических и генетических методов исследования в инфектологии, а также использованию адекватных моделей (колонизация ткани респираторного эпителия человека, мышиные модели колонизации, сепсиса и менингита) за последние десятилетия достигнут существенный прогресс в области изучения факторов пато-генности пневмококка. Помимо известного фактора патогенности — капсульного полисахарида, у пневмококка к настоящему времени выявлено несколько десятков поверхностных белков, обеспечивающих адгезию, колонизацию и инвазию. Токсическим фактором и одновременно фактором инвазии в мозг является пневмолизин. Многие из известных факторов патогенности участвуют в образовании биопленки, способствующей длительной колонизации носоглотки. У части поверхностных белков и пневмолизина доказана их протективная активность, что создает основу для разработки новых рациональных пневмококковых вакцин как альтернативу полисахаридным.
Журн. микробиол., 2014, № 3, С. 67—77
Ключевые слова: пневмококк, Streptococcus pneumoniae, факторы патогенности, протективные антигены, пневмолизин, биопленка
N.N.Kostyukova, V.A.Bekhalo
PNEUMOCOCCUS PATHOGENICITY FACTORS AND THEIR PROTECTIVE PROPERTIES
Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
Owing to rapid development of molecular-biological and genetic methods of research in infectol-ogy as well as use of adequate models (tissue colonization of human respiratory epithelium, mice models of colonization, sepsis and meningitis), a significant progress in the field of pneumococcus pathogenicity factors has been made in the last decades. Aside from the well-known pathogenicity factor — capsule polysaccharide, to date several dozens of surface proteins providing adhesion, colonization and invasion have been detected in pneumococcus. Pneumolysin is a toxic factor and at the same time brain invasion factor. Many of the known pathogenicity factors play a role in formation of biofilm that facilitates prolonged colonization of nasopharynx. Protective activity has been proved for some of the surface proteins and pneumolysin that forms the base for development of novel rational pneumo-coccal vaccines as an alternative to polysaccharide.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 3, P. 67—77
Key words: pneumococcus, Streptococcus pneumoniae, pathogenicity factors, protective antigens, pneumolysin, biofilm
Пневмококковая инфекция продолжает беспокоить здравоохранение всего мира, в том числе и России [5]. В последней четверти ХХ века интерес исследователей к пневмококку — Streptococcus pneumoniae заметно возрос, так как участились сообщения о выделении штаммов, устойчивых к пенициллину и другим антибиотикам. Этот интерес усилился в 90-е годы в связи с внедрением массовой вакцинации против пневмококковой инфекции и возникновением потребности в эпидемиологической оценке новых вакцин. Несовершенство полисахаридных вакцин и, в частности, необходимость использования максимального числа типовых антигенов (из известных 92), в свою очередь, потребовало поиска новых кандидатных структур. Логично предположить, что наибольшей протективной активностью могут обладать антигены, являющиеся факторами патогенности возбудителя. Все вышесказанное способствовало значительной активации исследований по биологии и генетике пневмококка во всем мире. В настоящем сообщении представлен обзор основных сведений о факторах патогенности пневмококка с особым вниманием к их протективным свойствам.
S. pneumoniae относится к роду Streptococccus семейства Streptococcaceae, состоит из неподвижных клеток эллипсоидной формы размерами 1,25х0,5 мкм, расположенных в виде пар и цепочек. Имеются наблюдения, что инвазивные штаммы образуют в тканях, крови и даже на питательных средах более короткие цепочки и пары, так как их клетки при таком расположении слабее активируют комплемент и поэтому более устойчивы к опсоно-фагоцитарному уничтожению. Напротив, клетки в длинных цепочках более активны при прикреплении к эпителию дыхательных путей, где комплемент практически не представляет угрозы патогену [54].
Пневмококки грамположительны и имеют строение клеточной стенки, характерное для этой группы микроорганизмов. Снаружи клетка окружена капсулой, состоящей из полисахаридов. Капсульный полисахарид складывается из повторяющихся полисахаридных единиц и ковалентно связан с пептидогликаном — основой клеточной стенки бактерии. Из-за различий в химической структуре пневмококковых кап-сульных полисахаридов они неоднородны по антигенным свойствам. В настоящее время достоверно описано 92 серологических типа (СТ) [17]. Серологически близкие между собой СТ объединены в серогруппы под одним номером; СТ внутри серогрупп обозначены заглавными латинскими буквами. Не все СТ входят в серогруппы, некоторые из них являются единственными и поэтому обозначены только цифрой.
Капсула является важнейшим фактором патогенности пневмококка, так как не допускает депозита (наслоения) C3b компонента комплемента и антител на стенке бактерии, тем самым предотвращая фагоцитоз [43]. Соответственно типспецифиче-
ские антикапсулярныые антитела являются существенным фактором защиты организма человека, на чем основано применение современных пневмококковых вакцин. Однако, капсульный полисахарид является тимус-независимым антигеном, не формирует иммунологической памяти и практически не иммуногенен для детей первых лет жизни. Поэтому в настоящее время используют так называемые конъюгированные пневмококковые вакцины (КПВ), в которых типоспецифический полисахарид соединен с белковым носителем, одновременно не бесполезным (дифтерийным или столбнячным анатоксинами, протективными белками других патогенов и т.п.).
Экспрессия капсульного полисахарида детерминруется группой из 12 генов (локус cps) и является стойким внутривидовым признаком. Именно на примере пневмококка F.Griffith [25] в 1928 году выявил возможность изменения СТ при культивировании на среде, содержащей убитые клетки пневмококка другого СТ, т.е. продемонстрировал феномен генетической трансформации. В 1944 году O.T.Avery et al. [8] положили начало современной генетике, показав, что носителем генетических серотиповых свойств пневмококка является ДНК.
Серотиповой состав циркулирующих штаммов разнообразен и неоднороден в зависимости от территории, исторического периода, возраста обследуемых лиц, эпидемических условий, а также при разных клинических формах инфекции. На сегодня лишь менее 30 СТ вызывают свыше 90% инвазивной пневмококковой инфекции (ИПИ) — сепсиса и менингита, что свидетельствует о неодинаковой вирулентности (степени патогенности) СТ. При этом даже высоко инвазивные СТ неравномерно распространены по планете, изменяясь и во времени. Более подробно распространение разных СТ пневмококка при различных клинических формах в разных странах представлено в обзорах [31, 55, 62], в том числе в России [3].
В конце 90-х годов наиболее распространенные серотипы были введены в 7-валентную КПВ, однако вскоре после ее массового применения увеличилась циркуляция СТ, не входящих в вакцину, а также появились СТ, не встречавшиеся ранее [61]. Это стало причиной изготовления вакцин, содержащих уже 10 и 13 типовых полисахаридов. Ясно, что процесс увеличения их числа в КПВ будет продолжаться, поэтому одновременно интенсифицируется работа по поиску новых, видовых, протективных антигенов [61].
Неодинаковая вирулентность штаммов различных СТ многократно подтверждалась в опытах по заражению животных (обычно мышей). Зависимость вирулентности от типа капсульного полисахарида при генетической конверсии одного СТ в другой наглядно представлена в классической работе T.Kelly et al. [33]. Так, превращение высокопатогенного штамма СТ5 в СТ3 снизило его вирулентность, а слабопатогенный штамм СТ 6А, конвертированный в СТ3, наоборот, увеличил вирулентность в 100 раз. Позднее было показано, что это может быть связано с изменением взаимного расположения капсульного вещества и поверхностных белков. Некоторые из последних способствуют отложению С3Ь на бактериальной клетке и, следовательно, захвату ее фагоцитами, что проявляется снижением вирулентности. Некоторые же белки обладают антикомплементарной активностью и усиливают защищенность пневмококка [57]. При изменении серотипа меняется и «обнаженность» (доступность) ряда белков, ответственных за адгезию, т.е за колонизацию, а не за ИПИ. По-видимому, разделение СТ на «инвазивные» и «носительские» связано именно с неодинаковым взаиморасположением капсульных полисахаридов и белковых адгезинов на поверхности клетки. Это подтверждено при изучении изогенных мутантов с генетически «переключенными» капсульными типами в опытах колонизации носоглотки мышей и клеточных эпителиальных культур человека [57]. Более того, показано, что внутри СТ имеются клоны с разной степенью патогенного (инвазивного) потенциала. Не случайно не найдено резкой границы между «инвазивными» и «носительскими» СТ [1]. Не исключено, что в природе происходит генетическое «переключение» капсуль-ного типового полисахарида у одного и того же генотипа с целью «ускользания» от антител при массовой иммунизации населения, как и при естественном накоплении лиц, иммунных к определенным серотипам. Подробнее об инвазивных клонах кап-сульных СТ пневмококка и их изменениях после вакцинации сказано в [11, 14].
Зависимость вирулентности пневмококка от капсулы наглядно проявляется при так называемых фенотипических «фазовых вариациях» его колоний. Колонии, содержащие клетки с тонкими капсулами или без них — прозрачны, тогда как при усиленном капсулообразовании колонии выглядят опалесцирующими. Эта изменчивость используется пневмококком на разных стадиях инфекционного процесса [27]. У одного и того же штамма клетки прозрачных колоний менее вирулентны в опытах на животных, чем клетки опалесцирующих. При этом показано, что клетки прозрачных колоний более интенсивно колонизируют слизистые оболочки дыхательных путей по сравнению с клетками опалесцирующих колоний, что объясняют обнажением адгезинов при истончении или исчезновении капсулы, закрывавшей адгезивные белки [27]. Прозрачные колонии сильнее подвержены аутолизу, нежели опалесциру-ющие. Показано, что более толстая капсула способствует устойчивости к Р-лактамным антибиотикам и ванкомицину [22].
Капсулу пронизывают пили — тонкие нитевидные белковые выросты, ковалент-но связанные с пептидогликановым слоем клеточной стенки. В настоящее время у пневмококка описаны два типа пилей. Один из них ^-1) кодируется геном г1г, входящим в островок патогенности PI-1, обнаруженный далеко не у всех штаммов пневмококка. Однако обладающие этими пилями штаммы активнее колонизировали носоглотку мышей и были необходимы для прикрепления пневмококка к клеткам легочной ткани человека. В опытах иммунизации с последующим заражением мышей пилированные штаммы демонстрировали более высокую протективную активность [10]. Второй тип пилей ^-2) кодируется другой группой пяти генов, входящих в островок патогенности PI-2, и также способствует адгезии пневмококка [9], но встречается реже. Наличие островка патогенности PI-1 коррелирует с генотипом и определенными клональными комплексами (CC). Более того, штаммы этих CC обычно относятся к наиболее инвазивным СТ. Некоторые клональные комплексы (например, СС271), содержат оба варианта пилей [9, 59]. Пилюс PI-1 состоит из трех субъединиц белка Rrg, из которых способностью прилипать обладает RrgA [44]. Наличие пилей и соответствующих им генов обычно совпадает с повышенной устойчивостью к пенициллину, присущей данному генотипу [59]. Субъединицы пилина обладают протек-тивной антигенной активностью [18]. Пили пневмококка, как и других бактерий, относятся к факторам адгезии. Они участвуют и в формировании биопленки [42].
Однако пили (обычно одного из типов) встречаются не у всех штаммов пневмококка. Так, среди штаммов, выделенных от носителей и больных ИПИ в США в 1997 — 2000 гг., пили PI-1 выявлены только в 21,4% случаев независимо от источника выделения. Применение 7-валентной КПВ привело к снижению циркуляции наиболее инвазивных СТ из входящих в вакцину. При этом вдвое снизилась и частота обнаружения пилированных штаммов пневмококка — с 42,8% до 21,3% [12]. В другом исследовании распространенность пилированных (типа PI-1) штаммов резко возросла через 3 — 5 лет после вакцинации за счет появления новых СТ, не входивших в вакцину [53]. Эти изменения объясняют найденной недавно [13] способностью пневмококка не всегда экспрессировать пили, несмотря на наличие соответствующих генов, с целью «ускользания» от антител. Пилины пневмококка остаются в числе возможных кандидатов для вакцины.
Как у всех грамположительных бактерий, ригидной основой клеточной стенки пневмококка является пептидогликановый слой. Снаружи него расположены липо-тейхоевые и тейхоевые кислоты (ЛТК и ТК соответственно), содержащие холин. Изнутри к пептидогликану примыкает цитоплазматическая мембрана, также входящая в понятие «клеточная стенка». К ЛТК и ТК прикреплен фосфорил-холин (ChoP), связывающийся с рецептором активации пластинок человека (rPAF) и с С-реактивным белком [20] и играющий роль в адгезии и в трансцитозе пневмококка из мозговых сосудов в мозг [28, 41]. На клеточной стенке расположены три важнейших группы белков: холин-связывающие белки, липопротеины и белки c доменом пентапептидом LPХTG [62]. Некоторые из них несут двойные и даже тройные функции в плане патогенности пневмококка. СhoP является «докинг-структурой» для нековалентной связи холин-связывающих белков пневмококка с его поверхностью.
К фосфорил-холину нековалентно прикреплены так называемые холин-связывающие белки (Cbp, cholin-binding proteins). Среди них важнейшим в плане патогенности пневмококка являются PspA, PspC (он же — CbpA, SpsA) и литические ферменты — мурамил-амидаза LytA и др. Холин-связывающий белок PspA (Pneumococcal surface protein A) с вариабельной мол. массой от 67 до 99 кДа предотвращает фиксацию (отложение, депозит) комплемента на клетке бактерии благодаря сильному отрицательному заряду [29], тем самым спасая себя от опсонизации с последующим фагоцитозом. PspA встречается у всех капсульных штаммов пневмококка, выделенных при ИПИ [19]. Он достаточно обильно представлен в клетках штаммов оплесцирующих колоний, выделяющихся из крови и спинно-мозговой жидкости (СМЖ). PspA как антиген обладает протективной функцией. На добровольцах было показано, что уровень IgG и IgA к фрагменту этого белка (22 кДа) коррелирует со степенью восприимчивости индивидуумов к носительству пневмококка [39]. Несмотря на вариабельность PspA, описано не менее 31 серотипа [19], он содержит консервативный общий эпитоп и считается серьезным кандидатом для вакцины как альтернатива типоспецифическим полисахаридам.
Еще одна патогенная функция белка PspA — связывание человеческого лактофер-рина, обильно представленного на слизистой оболочке респираторного тракта [26].
Другой холин-связывающийся белок пневмококка CbpA (он же PspC, SpsA, Secretory pneumococcal surface protein А) с вариабельной мол. массой 59 — 105 кДа считается основным адгезином пневмококка. Штаммы, формирующие прозрачные колонии, особенно богаты CbpA, именно эти штаммы обычно выделяют от носителей. Он связывает полимерный иммуноглобулиновый рецептор pIgR на назо-фарингеальной слизистой оболочке человека, способствуя транслокации пневмококка через респираторный эпителий [28, 32, 41, 62]. CbpA связывает также уже упоминавшийся рецептор для PAF в клетках эндотелия мозговых сосудов и способствует переходу пневмококка через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) [46]. Другими функциями CbpA является связывание ключевого C3-компонента комплемента, останавливающее дальнейшую активацию других его компонентов. Далее CbpA связывает фактор Н (fH) — регулятор активации комплемента, предотвращая опсониза-цию клетки пневмококка [21]. ^едовательно, этот белок одновременно подавляет несколько механизмов защиты хозяина. Недавно было показано, что CbpA, вдобавок, связывается с ламининовым рецептором [47], что имеет важное значение при прохождении пневмококка через ГЭБ.
Белок CbpA встречается у 75% штаммов [16]. Считается, что ^pA является фактором колонизации и тканевой инвазии. Доказана его протективная активность против колонизации носоглотки и легких, а также бактериемии [16, 45].
Оба белка — PspA и CbpA (PspC) имеют сходную структуру. Их N-терминальный конец скручен в виде спирали, сложенной вдвое, и в форме палочковидного образования выступает из клеточной стенки, иногда пронизывая капсулу, а С-терминальная часть крепится к клеточной стенке [29]. Благодаря сходству С-терминальных участков и холин-связывающих областей белки PspA и CbpA обладают перекрестной защитной активностью [16]. У пневмококка найдены еще холин-связывающие белки — адгези-ны CbpD, CbpE [23], а CbpG — не только адгезин, но и фермент, расщепляющий поверхностный матрикс эпителия и обнажающий рецепторы для адгезии [36] и являющийся протективным антгеном.
К фосфорил-холину клеточной стенки нековалентно крепятся холин-связывающие литические ферменты — LytA, LytB, и LytC. LytA — мурамил-амидаза расщепляет компонент пептидогликана и используется пневмококком для отрыва делящихся клеток друг от друга. Именно этот фермент ответственен за аутолиз колоний, наблюдаемый in vitro. Однако аутолиз происходит и in vivo, что приводит к выходу наружу пневмолизина — цитотоксина, продуцируемого в цитоплазме. LytA участвует в образовании биопленки [37].
LytB (глюкозамидаза) способствует колонизации носоглотки [23]. LytC — мура-мидаза является лизоцимом, растворяет пептидогликановую оболочку многих бактерий, благодаря чему пневмококк подавляет нормальную флору слизистых поверх-
ностей респираторного тракта, что способствует его колонизации [2, 23]. Сам пневмококк устойчив к действию лизоцима (экзо- и эндогенного) благодаря двум энзимам — PdgA и Adg [Davis K.M. et al., цит. по 41].
Среди многочисленных поверхностных липопротеинов пневмококка фактором патогенности является белок PsaA, первоначально считавшийся только адгезином. Однако оказалось, что PsaA является частью транспортной системы АВ^ в которой он ответственен за связывание с субстратом. Комплекс белков Psa (PsaA, PsaB и PsaC) транспортируют ионы Mn++. При этом мутанты PsaA обладали сниженной адгезив-ностью и повышенной чувствительностью к окислительному стрессу, что позволило отнести этот поверхностный липопротеин к факторам патогенности [40]. Рецептором для него является кадхерин, которым богат эпителий легочной ткани. К числу факторов патогенности относят липопротеины PiaA и PiuA — также транспортеров АВС, участвующих в захвате железа. Перечисленные металл-связывающие липопротеины обладают протективными свойствами и поэтому считаются кандидатами в состав пневмококковых вакцин [32]. Липопротеинами являютя PmpA и SlrA, которые содействуют адгезии [30].
В отличие от адгезинов, имеющих специфические рецепторы на клетках эпителия и сосудистого эндотелия человека (PspA, CbpA, ^oP и др.), некоторые поверхностные белки пневмококка связываются с матриксными молекулами макроорганизма, распространенными в тканях и крови. Эти бактериальные белки принято обозначать MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). Адгезивные матриксные молекулы человека, имеющие интегриновые рецепторы, широко представлены в экстрацеллюлярном матриксе (ЭЦМ) соединительной ткани и слизистых оболочек. ЭЦМ обеспечивает структурную поддержку клеток и состоит преимущественно из гликолизированных белков, гликозамин-гликанов (гепарин-сульфат, хондроитин-сульфат, гиалуроновая кислота, коллаген, фибронектин, ламинин, витронектин). Легочная ткань наиболее богата ЭЦМ. Взаимодействие патогенов с ЭЦМ способствует их распространению по поверхности тканей и проникновению в них. К ЭЦМ также относят плазминоген, находящийся в жидкостях организма и превращающийся в плазмин — мощную серино-вую протеазу широкого спектра действия. Пневмококк (и многие другие патогены) присоединяет плазминоген, активируя его в плазмин, и с помощью плазмина вызывает деградацию тканей и фибриновых сгустков, обеспечивая себе распространение за счет белка хозяина. Пневмококк имеет ряд плазминоген-связывающих белков, к которым относятся уже упоминавшиеся концевой пилиновый белок RrgA и холин-связывающий CbpE с его доменом холин-эстеразой Pce [7], а также белки PavB, PfbA и PfbB, фермент энолаза, белок PsrA. Эти же белки связываются и с фи-бронектином [48] — гликопротеином, широко представленным на поверхности эпителия и в жидкостях организма. Особый интерес представляет полифункциональный PavB. Он был выявлен у всех изученных «инвазивных» штаммов пневмококка, независимо от серотипа [30]. Этот белок обладает консервативностью аминокислотных последовательностей и иммуногенен для человека, что делает его перспективным кандидатом для будущей пневмококковой вакцины [50]. Фибронек-тин-связывающий белок FbpA также обладает протективными свойствами [48]. Фермент энолаза связывается с плазминогеном, фибронектином, ламинином и коллагеном.
Богатый сериновыми повторами белок PsrP (сходный с таковым у Staphylococcus aureus и Streptococcus gordonii) прикрепляется к кератину 10 легочного эпителия и является фактором адгезии, а также обеспечивает сцепление пневмококковых клеток друг с другом при образовании биопленки. Этот высокомолекулярный белок (мол. масса 2300 кДа) обладает протективной активностью и может использоваться в составе вакцин против многих грамположительных бактерий.
Белки PavB, FbpA, FbpB, PsrP, а также гликолитические ферменты расположены на поверхности клеточной стенки и ковалентно крепятся к ней при помощи аминокислотного мотива LPХТG c участием сортаз. Одна из них — SrtA, высоко консервативный белок, встречающийся у всех клинических изолятов, является самостоятель-
ным фактором колонизации, зависящим от экспрессии капсул [49]. Фактор, связывающий пневмококк с витронектином, пока неизвестен.
Неклассифицированный поверхностный белок PavA (не сходный с PavB) тоже прикрепляется к фибронектину и способствует пенетрации в эпителиальные клетки дыхательных путей и легких, а также в эндотелий мозговых сосудов, участвуя в возникновении менингита [51]. Итак, пневмококковые белки MSCRAMM являются полифункциональными, способствующими колонизации и инвазии патогена в организм человека.
Не менее значительную роль в патогенности пневмококка играют экзоферменты, также прикрепленные к клеточной стенке с помощью пентапептида LPXTG. Важнейшим из них является гликолитический фермент нейраминидаза (сиалидаза), представленная тремя белками NanA, NanB и NanC. Энзим отщепляет сиаловую кислоту от гликопротеинов, липопротеинов и олигосахаридов, входящих в состав тканей и жидкостей организма, деградируя их и делая доступными для инвазии патогена. NanA и NanB разжижают поверхностную слизь, обнажая рецепторы для адгезии пневмококка. NanA встречается у всех изолятов пневмококка, NanB — почти у всех [32], тогда как NanC выявлен преимущественно у штаммов, выделенных при менингитах [62]. Опыты in vivo показали, что NanA и NanB необходимы пневмококку для колонизации и распространению по респираторному тракту и легочным альвеолам [46], а также для выживания в крови [35].
К числу гликозидаз, кроме Nan, относится Р-галактозидаза BgaA. Этот фермент однако действует и как адгезин, непосредственно связываясь с эпителием [34]. Ферментом, расщепляющим гликоконъюгаты слизи на эпителии, является и N-ацетил-глюкозаминидаза StrH.
Существенную роль в патогенности играет фермент гиалурон-лиаза (гиалурони-даза), разрушающая гликаны, входящие в состав соединительной ткани человека — гиалуронан и некоторые хондроитины. Разрушение соединительной ткани способствует распространению пневмококка в органах и тканях организма. Гиалуронидаза встречается у всех штаммов, вызывающих менингит, но далеко не у всех носительских штаммов [4]. Интраназальное введение мышам пневмококка вместе с гиалуронидазой приводит к развитию сепсиса и менингита [4].
Пневмококки выделяют IgA-протеазу, разрушающую секреторный иммуноглобулин IgA1 [32]. Другая сериновая протеаза PrtA встречается у всех штаммов пневмококка и является протективным антигеном, хотя ее истинная патогенная функция пока неясна [40]. Недавно показано, что многие штаммы пневмококка разрушают мукозный барьер конъюнктивы, респираторного и женского генитального тракта с помощью металлопротеиназы ZmpC [24].
Все описанные выше факторы патогенности участвуют в колонизации слизистых оболочек и/или в последующей инвазии в ткани и органы человека. Однако полную клиническую картину, вызванную патогеном, обусловливают его токсические факторы. У пневмококка таким фактором является тиол-зависимый цитолизин пневмо-лизин Ply. Выше уже упоминалось, что Ply выделяется из клетки при ее разрушении под действием аутолитических ферментов LytA и LytB. Однако недавно было показано, что Ply входит и в состав клеточной стенки пневмококка, так как его выход не всегда связан с ее разрушением [52]. Ply не имеет специального пептида для выхода из цитоплазмы, и точный механизм его высвобождения пока неизвестен. Пневмолизин встречается почти у всех инвазивных штаммов пневмококка [4]. Он выделяется при лечении больных антибиотиками, разрушающими бактериальную клетку, например, цефтриаксоном; рифампицин такого действия не оказывает [40]. Пневмолизин связывается с холестерином клеточных мембран и образует в них поры, приводящие к лизису клетки. Ply замедляет биение ресничек эпителия респираторного тракта и эпендимы мозга, содействуя их колонизации [32, 46]. Пневмолизин непосредственно разрушает клетки эндотелия микрокапилляров легочных альвеол и мозга, а также межклеточные связи мозговых сосудов, содействуя инвазии пневмококка в мозг [7, 32, 40, 41]. Проникновение пневмококка в эндотелий мозговых сосудов происходит благодаря связыванию Ply с рецептором для PAF. Таким способом пневмолизин вы-
зывает нарушение ГЭБ, приводящее к развитию менингита и прямой гибели нейронов [32, 40]. В сублетальных концентрациях Ply активирует комплемент по классическому пути, несмотря на отсутствие антител. Детоксицированный пневмолизин является протективным антигеном. Недавно показано, что Ply, независимо от гемолитической способности, участвует в образовании биопленок как адгезин для скрепления клеток пневмококка [58].
Другим токсическим фактором, непосредственно повреждающим ткани, является перекись водорода (Н2О2), обильно выделяющаяся в окружении размножающихся клеток пневмококка, не продуцирующего каталазы. При развитии гнойного менингита Ply и Н2О2 повреждают ткани мозга не только непосредственным действием, но и путем каспазо-зависимого апоптоза нейронов и клеток глии [15, 28].
Как использует пневмококк свое мощное вооружение? Попав в виде аэрозоля на слизистую оболочку верхних дыхательных путей, патоген, в первую очередь, защищает себя от гибели в слизи, используя свой поверхностный отрицательный заряд (за счет капсулы и белков PspA и CbpA) [29]. Размножаясь на поверхности, постепенно разжижая слизь с помощью Nan и др. ферментов, патоген соприкасается с эпителием. От биения ресничек его защищает Ply, от бактерий-конкурентов — лизоцим LytC. Капсула на этих этапах не экспрессируется или выражена слабо и не мешает адгезинам прикрепляться к эпителию и элементам соединительной ткани [27]. Происходит колонизация участков слизистой оболочки благодаря адгезии пневмококка с помощью специфических адгезинов CbpA, PhoP, пилей, а также многочисленных поверхностных молекул MSCRAMM (PavB, PfbA и B, ферменты PsrP, SrtA, BagA, StrA, IgAl-протеаза, металлопротеазы).
В процессе колонизации формируется биопленка [37, 42]. На ранних сроках биопленка состоит преимущественно из прозрачных микроколоний, содержащих бес-капсульные высоко адгезивные, аутоагрегированные клетки пневмококка [6]. Через 3 — 4 дня формируется экстрацеллюлярный матрикс биопленки, его уже образуют капсулированные клетки [6], более инвазивные. Эти фенотипические изменения в процессе формирования биопленки коррелируют с изменениями в клетках популяции — планктонные клетки более инвазивны, нежели находящиеся в биопленке [56]. Marks L.R. et al. [37] показали, что штаммы S. pneumoniae, обладающие высокой способностью к колонизации in vivo и не склонные к дальнейшей инвазии, образуют плотные массивные биопленки. Напротив, слабые «колонизаторы» формируют тонкие биопленки, но более склонны к инвазии в подлежащие ткани и кровь [37, 60]. Так, штаммы, выделенные из крови, значительно слабее формируют биопленки, чем штаммы аналогичных серотипов и сикенс-типов, выделенные из среднего уха. Клетки пневмококка, заключенные в биопленку, существенно более устойчивы к действию гентамицина и пенициллина, чем планктонные [38]. В биопленке частота генетического обмена между клетками пневмококка возрастает в 107 раз и составляет 102 [38]. В образовании биопленки принимают участие: адгезины CbpA, ChoP, PsrP, концевой пилин RrgA, аутолизин LytA, пневмолизин Ply. Для образования биопленки необходим белок LuxS — аутоиндуктор AI-2 синтазы [60].
Колонизация пневмококком слизистых оболочек верхних дыхательных путей и образование биопленки протекает бессимптомно и расценивается как здоровое бактерионосительство [37]. Распространение колонизации в нижние отделы респираторного тракта, в том числе в легкие и полость среднего уха, проявляется клиническими симптомами воспаления. Процесс колонизации может сопровождаться инвазией пневмококка в эпителий с последующим проникновением в кровь СМЖ. Современные взгляды на превращение бессимптомного носительства в ту или иную манифестную форму пневмококковой инфекции отражены в многочисленных публикациях [28, 37, 41]. Кратко и схематично эти процессы происходят следующим образом.
Инвазия пневмококка в клетки респираторного эпителия осуществляется, в первую очередь, с помощью CbpA, связывающегося с иммуноглобулиновым рецептором rig и рецептором для фактора активации пластинок rRAF [20] эпителиальной клетки. К этому же рецептору прикрепляется другая поверхностная структура патогена — ChoP, также участвующая в инвазии [20].
В кровоток из инфицированных тканей пневмококк проникает путем эндоцито-за эндотелиальными клетками и разрыва межклеточных связей с помощью протеаз и плазмина, прикрепленного к клеткам патогена [49] (PavB, FbpA и B), энолазы, гиа-луронидазы.
Инвазия пневмококка из кровотока в мозг с последующим развитием гнойного менингита происходит путем трансцитоза сквозь эндотелий мозговых сосудов. В этом участвуют CbpA путем соединения с rPAF и ламинином [47], ^oP [47], фибриноген-связывающий белок PavA [51], пневмолизин Ply, непосредственно повреждающий эндотелий [46]. Одновременно пневмококк разрушает межклеточные связи эндотелия с помощью присоединения плазминогена и превращения его в протеазу плазмин [7] и гиалуронидазы [4]. Повреждение нейронов и клеток глии мозга осуществляется с помощью пневмолизина и образующейся Н2О2 [15, 28].
На всех этапах соприкосновения пневмококка с внутренней средой организма (межтканевые пространства, кровь и др.) пневмококк защищает себя от комплемент-опосредованного фагоцитоза с помощью экспрессии капсулы и поверхностных белков PspA, CbpA и пневмолизина.
Пневмококк обладает, по меньшей мере, несколькими десятками факторов па-тогенности, значительная часть которых изучена на молекулярном и генетическом уровне. Примерно у одной трети из них выявлена способность формировать специфическую иммунную защиту от колонизации и/или генерализованной инфекции. Не исключено, что в ближайшие годы могут быть созданы новые пневмококковые вакцины взамен препаратов с множеством типовых антигенов и белковых носителей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алешкин В.А., Караулов А.В., Слободенюк И.И., Афанасьев С.С., Урбан Ю.Н., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Егорова Е.А., Метельская В.А., Алешкин А.В., Гречишникова О.Г., Байракова А.Л., Несвижский Ю.В., Рубальский Е.О. Молекулярно-генетическая и филогенетическая характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных менингитом и носителей. Журн. микробиол. 2013, 5: 53-60.
2. Бухарин О.В., Васильев Н.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцим микроорганизмов. Томск, 1985.
3. Козлов З.С., Чигарян А.Н., Козлова Л.В., Муравьев А.К. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей до 5 лет в отдельных районах Российской Федерации. Клин. микробиол. антимикроб. химиотерапия. 2011, 13 (2): 177-187.
4. Костюкова Н.Н.. Волкова М.О., Кветная А.С., Иванова В.В., Марков О.П. Факторы патоген-ности штаммов Streptococcus pneumoniae, вызвавших менингит. Журн. микробиол. 1996, 3: 47-49.
5. Ряпис Л.А., Брико Н.И. Проблема пневмококковых инфекций в России. Эпидемиол. инфекц. бол. 2010, 1: 4-8.
6. Allegrucci M., Sauer k. Characterization of colony morphology variants isolated from Streptococcus pneumoniae biofilms. J. Bact. 2007, 189 (5): 2030-2038.
7. Attali C., Floret C., Durmont C. et al. Streptococcus pneumoniae choline-binding protein E interaction with plasminogen/plasmin stimulates migration across extracellular matrix. Infect. Immun. 2008, 76 (2): 466-476.
8. Avery O.T., MacLeod C.M., McCarty M. Studies on the chemical nature ofthe substance including transformation by desoxyribonucleinic acid fraction, isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 1944, 79: 137-158.
9. Bagnoli F., Moscheroni M., Donati C. et al. A second pilus type in Streptococcus pneumoniae is prevalent in emerging serotypes and mediates adhesion to host cells. J. Bact. 2008, 190: 5480-5492.
10. Barocci M.A., Rites J., Zogai X. et al. A pneumococcus pilus influences virulence and host inflammatory responses. PNAS. 2006, 103 (8): 2857- 2862.
11. Barroso D.E., Godoy D., Castineras T.M. P-lactam resistance, serotype distribution and genotypes meningitis-causing Streptococcus pneumoniae, Rio-de-Janeiro, Brazil. Pediatric Infect. Dis. J. 2012, 31 (1): 30-36.
12. Basset A.,Trzcinski K., Hermos K. et al. Association of the pneumococcal pilus with certain capsular sertypes but not with increased virulence. J. Clin. Invest. 2007, 45 (6): 1684-1689.
13. Basset A., Turner K.H., Boush E. Expression of the type 1 pneumococcal pilus is bistable and negatively regulated by the structural component RrgA. Infect. Immun. 2011, 79 (8): 2974-2983.
14. Beall B., McEllistrem M.C., Gertz R.E. et al. Pre- and postvaccination clonal compositions of invasive pneumococcal serotypes for isolates collection in the United States in 1999, 2001 and 2002. J. Clin. Microbiol. 2006, 44 (3): 999-1017.
15. Braun J.S., Sublett J.E., Freyer D. et al. Pneumococcal pneumolysin and H2O2 mediate brain cell apoptosis during meningitis. J. Clin. Invest. 2000, 109 (1): 19-27.
16. Brooks-Walter A.D., BrilesD.E., Hollingshead S.K. The pspC gene of Streptococcus pneumoniae encodes a polymorphic protein, PspC, which elicites cross-reactive antibodies to PspA and provides immunity to pneumococcal bacteriemia. Infect. Immun. 1999, 67: 6533-6542.
17. Calix J.J., Nahm M.M. A new pneumococcal serotype 11E has variable inactivated wejE gene. J. Infect. Dis. 2010, 202 (1): 29-38.
18. Cianfaldini C., Cansoni S., Hellringman M. et al. Pilus subunits protects mice against lethal challenge. Infect. Immun. 2007, 75 (2): 1059-1062.
19. Crain M.J., Waltman WD., Turner J.S. et al. Pneumococcal surface protein A (PspA) is serologically highly variable and is expressed by all clinically Important capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 1990, 58: 3293-3299.
20. Cundell D.R., Gerard N.P., Gerard C. et al. Streptococcus pneumoniae anchor to activated human cells by the receptor for platelet activating factor. Nature. 1995, 377 (6548): 435-438.
21. Dave S.,Carmiele S.,Hammershmidt S. et al. Dual role of PspC, a surface protein of Streptococcus pneumoniae in binding human secretory IgA and factor H. J. Immunol. 2004, 173 (1): 471-477.
22. Fernebro J., Anderson J., Sublett J. et al. Capsular expression in Streptococcus pneumoniae negatively effects spontaneous and antibiotic-induces lysis and contributes to antibiotic tolerance. J. Infect. Dis. 2004, 189 (2): 328-338.
23. Gosnik K.K., Mann E.R., Guglielmo Ch. et al. Role of novel choline-binding proteins in virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 2000, 68 (10): 5690-5695.
24. Govindarjan B., Menon B., Spurr-Michard S. A metalloproteinase secreted by Streptococcus pneumoniae removes membrane mucin MUC 16 from the epithelial glycocalix barrier. PLoS one. 2012, 7 (3): e32418.
25. Griffith F. The significance of pneumococcal types. J. Hyg. (Lond.). 1928, 27: 113-159.
26. Hammerschmidt S., Bethe G., Remane P.H., Shhatwal G.S. Identification ofpneumococcal surface protein A as a lactoferrin-binding protein of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 1999, 77 (4):1683-1687.
27. Hammerschmidt S., WolfS., Hocke A. et al. Illustration ofpolysaccharide capsule during adherence and invasion of epithelial cells. Infect. Immun. 2005, 87 (8) :453-467.
28. Henriques-Normark B., Tuomanen E.J. The pneumococcus: epidemiology, microbiology and pathogenesis. Gold Spring Harb. Perspect. Med. 2013, 3: a010215.
29. Jedrzejas M.Y. Pneumococcal virulence factors: structure and function. Microboiol. Mol. Biol. Rev. 2001, 65: 187-207.
30. Jensch I., Gamez G., Rothe et al. PavB is a surface exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 2010, 77: 2243.
31. Johnson H.L., Deloria-Knoll M., Levine O.S. et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 2010, 7 (10) pii: e10003-48.
32. Kadioglu A., Weiser J.N., Paton J.C., Andrew P.W The role ofStreptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nature Reviews. Microbiology. 2008, 6: 288301.
33. Kelly T., Dilbart J.P., Youther J. Effect ofgenetic switching capsular type ofvirulence Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 1994, 64 (5): 1813-1819.
34. Limoli D.H., Sladek J.A., Fuller L.A. BgdA acts as an adhesion to mediate attachment of some pneumococcal strains to human epithelial cells. Microbiology. 2011, 157: 2369-2381.
35. Manco S. Pneumococcal neurominidases A and B both have essential roles during infection of the respiratory tract and sepsis. Infect. Immun. 2006, 74 (7): 4014-4020.
36. Mann B., Orihuela C.J., Antikainen J. et al. Multifunctional role of choline — binding protein G in pneumococcal pathogenesis. Infect. Immun. 2006, 74 (2): 821-829.
37. Marks L.R., Parameswaran G.J., Hakansson A.P. Pneumococcal interactions with epithelial cells are crucial for optimal biofilm formation and colonization in vitro and in vivo. Infect. Immun. 2012, 80 (8): 2744-2760.
38. Marks L.R., Reddinger R.M., Hakansson A.P. High levels of genetic recombinations during na-sopharyngeal carriage and biofilm formation. MBio. 2012, 3 (5): e00200-12.
39. McCool T.L., Cate T.R., Moy G., Wiser J.N. The immune response to pneumococcal proteins during experimental pneumococcal carriage. J. Exp. Med. 2002, 195 (3): 359-365.
40. Mitchell A.M., Mitchell T.J. Streptococcus pneumoniae: virulence factors and variations. Clin. Microbiol. Infect. 2010, 16 (5): 411-418.
41. Mook-Kanamory B.B., Geldhoff M., van der Poll T. et al. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 2011, 24 (3): 557-591.
42. Münoz-Elias E.J., Marcano J., Camilli J. Isolation of Streptococcus pneumoniae biofilm mutants and their characterization during nasopharyngeal colonization. Infec. Immun. 2008, 76 (11): 50495061.
43. Musher D.M. Infections caused by Streptococcus pneumoniae: clinical spectrum, pathogenesis, immunity and treatment. Clin. Infect. Dis. 1992, 14: 801-809.
44. Nelson A.L., Rias J., Bagnoli F et al. RrgA is a pilus-associated adhesin of Streptococcus pneu-moniae. Mol. Microbiol. 2007, 66 (2): 329-340.
45. Ogunniyi A.D., Grabovich M., Boriles D.E. et al. Development of a vaccine against invasive pneumococcal disease based on combinations ofvirulence proteins of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 2007, 75 (1): 350-357.
46. Orichuela C.J., Gao G.L., Francis P.P. et al. Tissue-specific contributions ofpneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 2004, 190 (9): 1661-1669.
47. Orichuela C.J., Manden J., Tornton J. et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood-brain barrier in experimental meningeal model. J. Infect. Dis. 2009, 199 (6): 1638-1646.
48. Papasergi S., Garibaldi M., Tuscano G. et al. Plasminogen- and fibronectin binding protein B is involved in the adherence of Streptococcus pneumoniae to human endothelial cells. J. Biol. Chem. 2010, 285 (10): 7517-7524.
49. Paterson G.K., Mitchell I.G. The role of Streptococcus pneumoniae sortase A in colonization and pathogenesis. Microb. Infect. 2006, 8 (1): 145-153.
50. Paterson G.K., Orichuela C.J. Pneumococcal microbial surface components recognizing matrix molecules targeting of the extracellular matrix. Mol. Microbiol. 2010, 77 (11): 1-5.
51. Pracht D., Elm Ch., Gerber J. et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion and inflammatiom. Infect. Immun. 2005, 73 (5): 2680-2689.
52. Price K., Camille A. Pneumolysin localizes to the cell wall of Streptococcus pneumoniae. J. Bact. 2009, 191 (7): 2163-2168.
53. Regev-Yochay G., Hanage W.R., Trzcincki R et al. Re-emergence of the type1 pilus among Streptococcus pneumoniae isolates in Massachusetzs. Vaccine. 2010, 28 (30): 4842-4846.
54. Rodriges J.L., Dalia A.B., Weiser J.N. Increased chain length promotes pneumococcal adherence and colonization. Infect. Immun. 2012, 80 (10): 3454-3459.
55. Rodgers G.L., Aruedes A., Cohan R., Dagan R. Global serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates causing otitis media in children: potential implications for pneumococcal conjugate vaccines. Vaccine. 2009, 27 (29): 3801-3810.
56. Sanchez C.J., Kumar N., Lizcano A. et al. Streptococcus pneumoniae in biofilms are unable cause invasive disease due to altered virulence determinant production. PLoS one. 2011, 6 (12): e28738.
57. Sanches C.J., Hinjosa C.A., Shivshancar P., Camberline E. et al. Changes in capsular serotype after the surface exposure of pneumococcal adhesins and impact virulence. PLoS one. 2011, 6 (10): e26587.
58. Shak J.R., Lunderwikk H.P., Howery et al. Novel role for the Streptococcus pneumoniae in the assembly of biofilms. MBio. 2013, 4 (5): e00655-13
59. Sjöstrom K., Blomberg C., Fernebro J. et al. Clonal success of piliated penicillin nonsusceptible pneumococci. PNAS. 2007, 104 (31):12907-12912.
60. Trappetti C., van den Maten E., Amin Z. et al. Site of isolation determines biofilm formation and virulence phenotypes of Streptococcus pneumoniae serotype 3 clinical isolates. Infect. Immun. 2013, 81 (2): 505-513.
61. Weinberger D.M., Malley R., Lipsitch M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 2011, 738 (9807): 1962-1973.
62. Zancolli M., Canepa P., Ceravolo A. et al. Determinations of invasiveness and ability to cause invasive pneumococcal disease, pneumonia and acute otitis media of different serotypes ofStreptococcus pneumoniae. J. Prev. Med. Hyg. 2011, 42: 47-54.
Поступила 20.12.13
Контактная информация: Костюкова Наталья Николаевна, д.м.н., проф.,
123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (499)196-61-51
