CC BY
32
УДК 616.981.452(571.15)576.8:575
С.В.Балахонов1, М.В.Афанасьев1, М.Ю.Шестопалов1, А.С.Остяк1, С.А.Витязева1, В.М.Корзун1, Д.Б.Вержуцкий1, Е.П.Михайлов2, А.И.Мищенко2, А.В.Денисов2, Н.И.Ивженко2, Е.Н.Рождественский2, Е.Н.Висков2, Л.А.Фомина2
ПЕРВЫЙ СЛУЧАЙ ВЫДЕЛЕНИЯ YERSINIA PESTIS SUBSP. PESTIS В АЛТАЙСКОМ ГОРНОМ ПРИРОДНОМ ОЧАГЕ ЧУМЫ.
СООБщЕНИЕ 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИЗОЛЯТА
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока», Иркутск; 2ФКУЗ «Алтайская противочумная станция», Горно-Алтайск
Выполнена комплексная микробиологическая, молекулярно-генетическая и масс-спектрометрическая идентификация штамма Yersinia pestis основного подвида, который был изолирован в июне 2012 г. впервые за все время обследования Алтайского горного природного очага чумы. Установлена высокая универсальная вирулентность этого штамма. Результаты плазмидного скрининга, мультилокусного VNTR- и масс-спектрометрического анализов продемонстрировали, что этот штамм наиболее близок к варианту возбудителя чумы, циркулирующему на территории природного очага Хуух-Сэрх-Мунх-Хаирхан, Баян-Ульгийский аймак, Монголия.
Ключевые слова: возбудитель чумы, основной подвид, Алтайский горный природный очаг чумы, Yersinia pestis, вирулентность, плазмидный скрининг, мультилокусный VNTR-анализ, масс-спектрометрический анализ.
S.V.Balakhonov1, M.V.Afanas’ev1, M.Yu.Shestopalov1, A.S.OstyakJ, S.A.Vityazeva', V.M.Korzun1,
D.B.Verzhutsky1, E.P.Mikhailov2, A.I.Mishchenko,2 A.V.Denisov2, N.LIvzhenko2, E.N.Rozhdestvensky2,
E.N.Viskov2, L.A.Fomina2
The First Case of Yersinia Pestis Subsp. Pestis Isolation in the Territory of Altai Mountain Natural Plague Focus. Communication 1. Microbiological Characteristics, Molecular-Genetic and Mass-Spectrometric Identification of the Isolate
1 Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far East, Irkutsk;2Altai Plague Control Station, Gorno-Altaisk
Performed is a complex microbiological, molecular-genetic and mass-spectrometric identification of Yersinia pestis main ssp. strain, which was isolated for the first time in the history of surveillance over the Altai mountain natural plague focus in June, 2012. Determined is its high universal virulence. Plasmid screening, multi-locus VNTR- and mass-spectrometric analyses have revealed the strain to be more closely related to the plague agent variant, circulating in the territory of the natural focus Khuukh-Serkh-Munkh-Khairkhan, Bayan-Ul’giisk aimak, Mongolia.
Key words: Altai mountain natural plague focus, plague agent, main subspecies, Yersinia pestis, virulence, plasmid screening, multi-locus VNTR-analysis, mass-spectrometric analysis.
Планомерное эпизоотологическое обследование Алтайского горного природного очага чумы начато в 1950 г. [9]. Первые штаммы чумного микроба были выделены в 1961 г. [3]. С этого времени эпизоотии различной интенсивности в поселениях мелких млекопитающих, преимущественно монгольской пищухи, которая является основным носителем инфекции в очаге, регистрируют ежегодно. Всего за период 1961-2012 гг. изолировано 2373 штамма возбудителя чумы. В очаге циркулирует своеобразный вариант чумного микроба, который был выделен в самостоятельный подвид Yersinia pestis subsp. altaica [1]. Данные штаммы чумного микроба имеют ряд характерных особенностей. В частности, они, в отличие от классических изолятов основного подвида, на 1-2-е сутки ферментируют рамнозу, глицерин, не разлага-
ют арабинозу или ферментируют ее в поздние сроки, не обладают нитрифицирующей и денитрифицирующей активностью, проявляют зависимость от фенилаланина, цистеина, лейцина и аргинина, вирулентны для белых мышей и авирулентны для морских свинок, обладают избирательной вирулентностью для носителей в очаге, продуцируют пестицин I и обладают парадоксальной чувствительностью к нему. В очаге выделялись и измененные варианты чумного микроба, отличающиеся от типичных штаммов по вирулентности, чувствительности к пестицину I, ферментативной активности, способности к пигмент-сорбции на среде с гемином, с утратой одной из трех плазмид и некоторым другим свойствам [4]. С 1990 г. в очаге изолируют варианты возбудителя чумы, имеющие дополнительную питательную потребность в
триптофане. Выявлена гетерогенность Yersinia pestis subsp. altaica по VNTR-локусу (5’-СААА-3’)п, выражающаяся в неоднородности штаммов, выделяемых в очаге, по количеству повторов тетрануклеотида СААА [6]. Частота встречаемости ауксотрофов по триптофану и различных VNTR-вариантов по локу-су (5’-СААА-3’)п характеризуется выраженной пространственной приуроченностью [4, 7]. Все это свидетельствует о фенотипической и генотипической гетерогенности циркулирующего в очаге возбудителя Y. pestis subsp. altaica. До 2012 г. в очаге ежегодно регистрировали только Y pestis subsp. altaica, однако в июне 2012 г. в ур. Большие Сары-Гобо в ходе планового эпизоотологического обследования от трупа длиннохвостого суслика был изолирован штамм чумного микроба (Y. pestis 1454), который при первичной идентификации по своим биохимическим свойствам и вирулентности отличался от типичных штаммов алтайского подвида, циркулирующих в очаге.
Цель настоящей работы - комплексная фено-и генотипическая идентификация штамма Y. pestis 1454 с привлечением мультилокусного VNTR- и масс-спектрометрического анализов.
Материалы и методы
В работе изучали штамм Y. pestis 1454, а также 84 штамма чумного микроба, изолированных в природных очагах чумы Сибири и Монголии и использованных в сравнительных молекулярно-генетических экспериментах. В качестве контрольного в ряде тестов применяли вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ. Фенотипическую идентификацию штаммов выполняли с использованием традиционных микробиологических тестов [8]. Для определения LD50 штамма Y. pestis 1454 использовали беспородных, но стандартных по условиям содержания и массе, лабораторных животных: белые мыши (18-19 г) и морские свинки (180-220 г), которых заражали подкожно в правую заднюю лапу в дозах: для белых мышей от 5 до 625 м.к. в 0,5 мл; для морских свинок от 10 до 1250 м.к. в 1,0 мл. Эксперименты на животных проводили в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Расчет LD50 выполняли по И.П.Ашмарину и А.А.Воробьеву [2].
Молекулярно-генетические исследования. Скрининг плазмид штаммов чумного микроба проводили, как описано нами ранее [4]. Для выделения геномной ДНК из исследуемых культур применяли набор «ДНК-сорб-В» (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, Москва). Для выполнения мультилокусного VNTR-анализа использовали 25 локусов тандемных повторов в геноме Y. pestis [11]. Размер полученных ампликонов определяли методом капиллярного электрофореза на ДНК-анализаторе ABI Prism® 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США; Hitachi, Япония) путем сравнения с маркером молекулярного веса GeneScan™ 500 LIZ™ Size Standard.
Продукты амплификации локусов, ожидаемый размер которых превышал 500 п.н. (локусы yp2769ms06 и yp3057ms09), анализировали методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле, размер полученных фрагментов определяли с помощью маркера молекулярного веса ДНК - GeneRuler™ 100 bp dNa Ladders (Fermentas, Литва), и программного пакета Quantity One v.4.4.0 (BioRad, США). Исходя из размера (в п.н.) получаемого ампликона, определяли число тандемных повторов в каждом из 25 исследованных ло-кусов. Полученный таким образом 25-символьный цифровой паттерн исследуемых штаммов сравнивался с аналогичными паттернами штаммов Y. pestis, выделенных в сибирских и монгольских природных очагах чумы. Построение филогенетического древа осуществлялось методом присоединения «ближайших соседей» (Neighbor-Joining, NJ) при помощи программного комплекса Bionumerics v 6.01 (Applied Maths, Бельгия).
Масс-спектрометрический анализ. Взвесь суточной культуры исследуемого штамма Y. pestis 1454 обрабатывали этиловым спиртом, 70 % муравьиной кислотой с последующим добавлением ацетонитрила [12]. По 1 мкл полученного экстракта переносили в лунки MSP-чипа, образцы подсушивали на воздухе, сверху наносили 1 мкл насыщенного раствора матрицы (а-Циано-4-Гидроксикоричная кислота в 50 % ацетонитрила и 2,5 % трифторуксусной кислоты). В качестве калибровочного стандарта и положительного контроля анализа использовался белковый экстракт штамма E. coli DH5a (ref. № 255343; Bruker Daltonics, Германия). Спектры собирались в автоматическом режиме на масс-спектрометре Microflex™ LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Германия) с использованием программы Flex Control (ver. 3.3, build 108). Для анализа спектров, генерации библиотек и идентификации применяли программное обеспечение MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Германия). Кластерный анализ осуществлялся с использованием функции Principal Component Analysis программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0, а также методом «ближайших соседей» (Neighbor-Joining, NJ) при помощи программного комплекса Bionumerics v 6.01 (Applied Maths, Бельгия).
Результаты и обсуждение
В 2012 г. эпизоотический участок Большие и Малые Сары-Гобо обследовался дважды - в июне и сентябре. Площадь обследования составила 143 км2. На зараженность чумой бактериологически исследовано 263 зверька (из них монгольских пищух -217, плоскочерепных полевок - 18, даурских пищух - 17, длиннохвостых сусликов - 10, горностаев - 1), 784 блохи, 13 иксодовых клещей, материал получен с семи точек обследования. Кроме штамма Y. pestis 1454 других изолятов в этом году здесь не было, положительных серологических реакций на чуму не выявлено. При проведении углубленного
осеннего обследования всей территории участка следы эпизоотии также визуально не отмечены. В 2012 г. на Уландрыкском участке очаговости, в котором расположено место выделения необычного для очага штамма, эпизоотические проявления зарегистрированы еще на двух территориях. Возбудитель чумы, изолированный на них, относится к алтайскому подвиду.
Территория участка Большие и Малые Сары-Гобо преимущественно заселена монгольской пищухой. Плотность поселений этого зверька здесь в весенний период 2012 г. была очень высока и составила 13,8 жилых нор на 1 га, осенью она резко снизилась и была равна 4,6 жилых нор на 1 га. Средняя многолетняя численность монгольской пищухи на Уландрыкском участке очаговости, определенная за 1980-2011 гг., составляет весной 3,6±0,20 (число учетов 167), осенью - 6,1±0,19 (число учетов 238) жилых нор на 1 га. Резкое снижение численности зверька осенью, вероятнее всего, обусловлено сильными дождями, прошедшими летом, что, в целом, для высокогорных степей Юго-Восточного Алтая не характерно. Плотность населения даурской пищухи, более влаголюбивого вида, в ур. Большие Сары-Гобо, наоборот, от весны к осени сильно увеличилась и соответственно равнялась 0,5 и 2,7 жилых нор на 1 га. В оптимальных биотопах Уландрыкского участка очаговости численность суслика находилась на среднем уровне и составила 4,7 особей на 1 га в весенне-летний период и 4,0 особи на 1 га осенью (среднемноголетние показатели по очагу 3,2, и 5,5 соответственно). Численность алтайского сурка была низкая и равнялась весной 0,5, осенью - 0,4 жилых бутанов на 1 га.
В результате микробиологической идентификации штамма Т pestis 1454 установлено, что он обладал следующими характеристиками: на агаре и в бульоне Хоттингера вырастал в виде R-формы, характерной для чумного микроба; не обладал подвижностью; лизировался чумным и псевдотуберкулезным фагами; ферментировал (в течение первых суток) глицерин, арабинозу, ксилозу, глюкозу, манно-зу, левулезу, мальтозу и не ферментировал (до 10 сут наблюдения) рамнозу, галактозу, лактозу, сахарозу, дульцит, сорбит, инозит; не обладал уреазной активностью; восстанавливал нитраты в нитриты; сорбировал гемин на среде Джексона-Берроуза; обладал фибринолизин-пестицин 1-плазмокоагулазной активностью; продуцировал капсульный антиген, обладал зависимостью роста от ионов Са2+ при температуре 37 °С; стрептомицин-чувствителен. По потребностям в аминокислотах нуждался в метионине. По результатам изучения ферментативной активности штамм Т pestis 1454 относится к основному подвиду чумного микроба.
При определении LD50 установлено, что штамм Т pestis 1454 высоковирулентен для обоих видов использованных лабораторных животных, поскольку LD50 для белых мышей составила 2,94 м.к., для мор-
1 2 3 4 5
Рис. 1. Результаты плазмидного анализа штамма Y. pestis 1454:
I - Y. pestis subsp. altaica И-3530 (pYP, pYV, pYT);
2 - Y. pestis subsp. altaica И-3532 (pYP, pYV, pYT); 3 - Y. pestis 1454 (pYP, pTP33, pYV, pYT); 4 - Y. pestis subsp. pestis И-3533 (pYP, pTP33, pYV, pYT); 5 - Y pestis subsp. pestis И-3534 (pYP, pTP33, pYV, pYT)
ских свинок - 4,47 м.к. При вскрытии обнаружена паталого-анатомическая картина септической формы чумы. Гибель животных наступила вследствие специфической инфекции, что подтверждено выделением чистой культуры штамма Y. pestis 1454 от всех павших животных.
Анализ плазмидного профиля, как представлено на рис. 1, показал наличие у штамма Y. pestis 1454 четырех плазмид - pYP, pTP33, pYV, pYT, что отличало его от всех ранее выделявшихся в очаге алтайских штаммов Y pestis, обладавших типичным для возбудителя чумы набором из трех плазмид. Плазмида pYT у штамма Y. pestis 1454 по электрофоретической подвижности соответствовала аналогичной плазмиде, детерминирующей капсульный антиген Fra1 у типичных Y. pestis subsp. pestis, в отличие от алтайских штаммов, у которых данный внехромосомный репликон варьирует по размеру и обычно больше типичной pYT. Ранее нами показано, что данный плазмидовар характерен для Тувинского природного очага чумы и некоторых очагов Монгольского Алтая, в частности, очага Хуух-Сэрх-Мунх-Хаирхан. Монгольские специалисты также сообщают об обнаружении штаммов возбудителя чумы основного подвида данного четырехплазмидного варианта в более поздние сроки [10].
VNTR-анализ проведен по 25 вариабельным локусам: yp0120ms01, yp1290ms04, yp1935ms05, yp2769ms06, yp2916ms07, yp3057ms09, yp0559ms15, yp1814ms20, yp1895ms21, yp4042ms35, yp4425ms38, yp0581ms40, yp0718ms41, yp1018ms44, yp1108ms45, yp1335ms46, yp2058ms51, yp2612ms54, yp3060ms56, yp4280ms62, yp1118ms69, yp1580ms70, yp1925ms71, yp3236ms73, yp3245ms74. Полученные VNTR-профили исследованного штамма импортировались в базу данных BioNumerics, содержащую спектры 84 штаммов Y. pestis, относящихся к разным подвидам и выделенных на территории Тувинского, Алтайского горного, Забайкальского, Кавказского и природных очагов Монголии. Результаты сравнительного анализа представлены на рис. 2.
VNTR
£
ч:
ч:
Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis
ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. a ssp. £ ssp. i
iltaica 1789 iltaica 1803 iltaica I-3429 (571) iltaica 1666 iltaica I-3476 (2242) iltaica 1445-49 iltaica 1638 iltaica I-3474 (248) iltaica I-3447 (2400) iltaica I-3478 (3131) iltaica 2839 iltaica 1413 iltaica I-2629 iltaica 1-3446(1374) iltaica 912 iltaica 1564 iltaica 1614 iltaica I-3386 iltaica 1182 iltaica 1672 iltaica 1060 iltaica 909 iltaica I-3368 iltaica 2838 iltaica 443 iltaica 201 iltaica 1-3132 iltaica 1-3194 iltaica I-3085 iltaica I-3088 ilegeica I-2236 ssp. pestis I-3524 (212-14) ssp. pestis 267 ssp. pestis I-3364 ssp. pestis I-3383 ssp. pestis I-3378 ssp. pestis I-3380 ssp. pestis I-3472 (850) ssp. pestis I-3482 (480) ssp. pestis 662 ssp. pestis I-3522 (801) ssp. pestis 802 ssp. pestis I-3502 (272) ssp. pestis 1-3431 (896) ssp. pestis 1-3520(306) ssp. pestis 1-3449(1095) ssp. pestis I-3470 (625-628) ssp. pestis 29 ssp. pestis 52 ssp. pestis 190-197 ssp. pestis 1-1610 ssp. pestisl-3353 ssp. pestis I-3483 (468-472) ssp. pestis 603 ssp. pestis 604 ssp. Pestis I-3484 (573) ssp. pestis 2sh ssp. pestis 682-690 ssp. pestis 2847 ssp. pestis 2901 ssp. pestis I-3485 (979) ssp. pestis 1-2381 ssp. pestis 1-3450(1552) ssp. Pestis I-3504 (793) ssp. pestis I-3239 ssp. pestis I-3240 ssp. pestis 1-3241
Altai, East pt. Kuray mount Altai, East pt. Kuray mount Altai, East pt. Kuray mount Altai, Chagan-Uzun Altai, Sered. Chagan-Uzuna Altai, NizTarhati Altai, Serbistu Altai, Sered. Elangasha Altai, Sered. Chagan-Uzuna Altai, Sered. Chagan-Uzuna Altai, Versh. Ulandrika Altai, Niz Ulandrika Mongolia
Altai, Sered. B. Shibet
Altai, M. Sari-Gabo
Altai, M. Sari-Gabo
Altai, M. Sari-Gabo
Altai, Sered Ulandrika
Altai, Sered Ulandrika
Altai, Sered Ulandrika
Altai, Versh Ulandrika
Altai, Versh Ulandrika
Altai, Kochkor-Bas
Altai, Versh. Ulandrika
Altai, Kochkor-Bas
Altai, Niz Ulandrika
Mongolia, Bayanhongor
Mongolia, Uburhangay, Taragt
Mongolia, Uburhangay, Zun Bayan-Ulan
Mongolia, Uburhangay
Mongolia, Shanedava
Tuva, Mongun-Taiga, Suur-Taiga
Tuva, Mongun-Taiga, Suur-Taiga
Tuva, Mongun-Taiga
Tuva, Mongun-Taiga
Tuva, Mongun-Taiga
Tuva, Mongun-Taiga
Tuva, Mongun-Taiga, Ouk-Hem
Tuva, Mongun-Taiga, Ouk-Hem
Tuva, Mongun-Taiga, Kurgak-Sai
Tuva, Mongun-Taiga, Kurgak-Sai
Tuva, Mongun-Taiga, Kurgak-Sai
Tuva, Mongun-Taiga,Bich-Chal-lash
Tuva, Mongun-Taiga,Chal-lash
Tuva, Mongun-Taiga.Ush-Dorgun
Tuva, Tolailyg, Buure
Tuva, Suur-Taiga, Mongun-Taiga
Tuva, Mongun-Taiga, Suur-Taiga
Tuva, Mongun-Taiga, Suur-Taiga
Tuva, Tolailyg, Buure
Tuva, Kara-Beldir, Ak-Adir
Tuva, Uzun-Hem, Mongun-Taiga
Tuva, Mongun-Taiga, Suur-Taiga
Tuva, Tolailyg,niz
Tuva, Tolailyg,niz
Tuva, Tolailyg, Ak-karasug
Tuva, Mongun-Taiga, Charlik-Hovu
Tuva, Mongun-Taiga, Uzun-Hem
Tuva, Mongun-Taiga, Chinge-put
Tuva, Mongun-Taiga.Ush-Dorgun
Tuva, Mongun-Taiga, Kurgak-Sai
Tuva, Kara-Beldir, Tolaity
Tuva, Kadir-Oruk, Mongun-Taiga
Tuva, Barlyk, Onachi, p25
Mongolia, Bauan-Ulegey aimak, Deluun somon
Mongolia, Bauan-Ulegey aimak, Deluun somon
Mongolia, Bauan-Ulegey aimak, Deluun somon
| Y. pestis ssp. pestis 1454
Altai, B. Sari-Gabo ~~|
-4
4:
Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis Y. pestis
ssp. pestis I-3226 ssp. pestis I-3268 ssp. pestis I-3327 ssp. pestis I-2770 ssp. pestis 1-2771 ssp. pestis 1-2761 ssp. pestisl-3236 ssp. pestis I-947 EV NIIEG
ssp. pestis 1-3154 (TWJ) ssp. pestis 1-1983 ssp. pestis 1-1978 ssp. pestis 1-1996 ssp. pestis I-4 ssp. pestis I-24 ssp. pestis I-76 ssp. caucasica C-376
Tuva, Boro-Shay
Tuva, Boro-Shay
Tuva, Boro-Shay
Tuva, Sagly, Chingiz-Ti-Tig
Tuva, Sagly, Saily
Tuva, Sagly, Sagly river
Tuva, Barlyk, Onachi
Mongolia, Ubsanur, Turgen somon
Zabaykale, Ketyi
Zabaykale, Ketyi
Zabaykale, Ust-Buluktyi
Zabaykale, Borzinsky distr, Chindat lake
Zabaykale, Zun-Gorey lake, Kulustay
Zabaykale, Guljenga
Armenia, Spitak
2003
2003
2000
2003
2003
2005
2005 2003 2003 2003
2006 2003
1977 2001 2003 2003 2003 1995 2000 2003 2006 2007 1994 2006 2003 2003 1984
1986
1982
1983
1972 2007 2007 1992 1994 1994 1994
2003
2004 2007 2007 2007 2006 2000 2007 2001
2003
2005 2005 2005 1967 1992
2004
2005
2005 2004 2012 2012 2012 2012 2004
1973 2001
2006 1988 1988 1988 2012
1987
1990
1991
1978 1978 1978
1988 1964
1970
1970
1970
1939
1942
1945
1958
Ctenophyllus hirticrus Paradoxopsyllus kalabukhovi Ochotona pallasi Frontopsylla hetera Paradoxopsyllus scorodumovi Ochotona pallasi Ctenophyllus hirticrus Amphalius runatus Paradoxopsyllus scorodumovi Ochotona pricei Rhadinopsylla dahurica Paradoxopsyllus scorodumovi Ochotona pallasi Paradoxopsyllus scorodumovi Amphalius runatus Ochotona daurica Ochotona pallasi Amphalius runatus Ctenophyllus hirticrus Paradoxopsyllus scorodumovi Amphalius runatus Ctenophyllus hirticrus Lepus tolai
Rhadinopsylla dahurica Ctenophyllus hirticrus Amphalius runatus Microtus brandii Microtus brandii Microtus brandii Microtus brandii Ochotona daurica Spermatophillus undulatus Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Dermacentor nuttalli Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Dermacentor nuttalli Gamasoidea Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Spermatophillus undulatus Citellophilus tesquorum Rhadinopsylla li transbaicalica Spermatophillus undulatus Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Spermatophillus undulatus Citellophilus tesquorum Neopsylla mana Citellophilus tesquorum Spermatophillus undulatus Spermatophillus undulatus Rhadinopsylla li transbaicalica Dermacentor nuttalli Citellophilus tesquorum Spermatophillus undulatus Paramonopsyllus scalonae Citellophilus tesquorum Oropsylla silantiewi Marmota baibacina Spermatophillus dauricus Spermatophillus undulatus Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Spermatophillus undulatus Rhadinopsylla li transbaicalica Citellophilus tesquorum Amalaraeus penicilliger Oropsylla asiatica Spermatophillus dauricus
Spermatophillus dauricus Spermatophillus dauricus Spermatophillus dauricus Spermatophillus dauricus Spermatophillus dauricus Marmota sibirica Microtus socialis
Рис. 2. Дендрограмма по результатам У№ГО-анализа, иллюстрирующая степень родства штамма У. резИз 1454 (выделен рамкой) с геновариантами, изолированными на территориях некоторых природных очагов чумы
L f t К
с
„ L___________________
uuLlill.1.1___________
_______
JuiUiJL______
41
Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis EV Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis 1454 Y. pestis ssp. Y. pestis ssp.
altaica I-3447 (1396) altaica I-3476 (2242) altaica I-3474 (248) altaica I-3429 (571) altaica I-3478 (3131) altaica I-3368 altaica I-3373 altaica I-3446 (1374) altaica 1-3475(1940) pestis I-3485 (979) pestis I-3484 (573) pestis 1-3483(468-472) pestis 1-3520(306)
pestis 1-3470 (625-628) pestis 1-3472(850) pestis 1-3268 pestis 1-3502 (272) pestis 1-3482 (480) pestis 1-3236 pestis 1-3431 (896) pestis I-3504 (793) pestis 1-3450(1552) pestis I-3353
pestis I-3240 pestis 1-3449(1095)
Altai, Sered. B. Shibet 2001
Altai, Sered. Chagan-Uzuna 2003
Altai, Sered. Elangasha 2003
Altai, East pt. Kuray mount 2000
Altai, Sered. Chagan-Uzuna 2003
Altai, Kochkor-Bas 1994
Altai, Stacionar 1994
Altai, Sered. B. Shibet 2001
Altai, East pt. Kuray mount 2003
Tuva, Mongun-Taiga, Kurgak-Sai 2004
Tuva, Tolailyg, Ak-karasug 2004
Tuva, Mongun-Taiga, Suur-Taiga 2004
Tuva, Mongun-Taiga,Ush-Dorgun 2007
Tuva, Suur-Taiga, Mongun-Taiga 2003
Tuva, Mongun-Taiga, Ouk-Hem 2003
Tuva, Boro-Shay 1990
Tuva, Mongun-Taiga,Bich-Chal-lash 2006
Tuva, Mongun-Taiga, Ouk-Hem 2004
Tuva, Barlyk, Onachi 1988
Tuva, Mongun-Taiga,Chal-lash 2000
Tuva, Barlyk, Onachi, p25 2006
Tuva, Kadir-Oruk, Mongun-Taiga 2001
Tuva, Uzun-Hem, Mongun-Taiga 1992
Altai, B. Sari-Gabo 2012
Mongolia, Bauan-Ulegey aimak, Deluun somon 1988 Tuva, Tolailyg, Buure 2001
Рис. 3. Дендрограмма, построенная на основании сравнения масс-спектрометрических профилей исследованных штаммов
В результате VNTR-анализа исследуемый штамм Т pestis 1454 оказался отличным от штаммов, выделяемых, в том числе и в текущем году на территориях Алтайского горного и Тувинского природных очагов чумы, и попал в одну группу со штаммами, изолированными в конце 80-х годов на территории природного очага чумы Хуух-Сэрх-Мунх-Хаирхан (Дэлуун-сомон Баян-Ульгийский аймак, Монголия). Между монгольскими штаммами 80-х годов и штаммом Т pestis 1454 наблюдались минимальные различия в двух локусах: yp3060ms56 и yp4280ms62.
В качестве дополнительного инструмента индикации и углубленной идентификации исследуемого штамма применялся сравнительный анализ его белкового спектра со спектрами штаммов, относящихся к основному и алтайскому подвидам, выделенных на территории Тувинского, Алтайского горного природных очагов чумы и природных очагов Монголии. Результаты представлены на рис. 3.
Исследуемый штамм при сравнении с рефе-ренсными спектрами чумного микроба обновленной базы В^урег 3.0 однозначно идентифицировался как Т pestis. Штамм Т pestis 1454 попал в кластер, сформированный штаммами основного подвида, в одну группу со штаммом И-3240, выделенным на территории природного очага чумы Хуух-Сэрх-Мунх-Хаирхан (Дэлуун-сомон, Баян-Ульгийский аймак, Монголия) в 1988 г.
Таким образом, идентификация и изучение штамма Т pestis 1454 показали, что он относится к основному подвиду чумного микроба Т pestis subsp. pestis с характерными культурально-морфологическими, биохимическими свойствами, набором основных детерминант вирулентности и обладает высокой универсальной вирулентностью для лабораторных
животных. Результаты молекулярно-генетических исследований позволили установить наибольшее сходство этого штамма со штаммами изолированными в конце 80-х годов прошлого столетия на территории природного очага чумы Хуух-Сэрх-Мунх-Хаирхан (Дэлуун-сомон, Баян-Ульгийский аймак Монголии). Фенотипические характеристики штамма У резИз 1454 также обнаруживают высокую степень его сходства с последними.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Апарин Г.П., Балахонов С.В., Тимофеева Л.А., Логачев А.И. Нумерический анализ фенотипических свойств и общая геномная характеристика штаммов чумного микроба, относящихся к различным подвидам. Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нобиол. 1987; 11:16-20.
2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: МЕДГИЗ; 1962. 179 с.
3. Балабкин А.К., Шамова А.М., Саржинский В.А., Лазарев Б.В., Горбачева Л.А. О природном очаге чумы в Горном Алтае. Докл. Иркут. противочум. ин-та. 1962; 4:3-5.
4. Балахонов С.В., Вержуцкий Д.Б., Корзун В.М., Вершинин
Е.А., Немченко Л.С., Чипанин Е.В. Современное состояние природных очагов чумы Сибири. Журн. инф. патол. 2009; 16(3): 16-20.
5. Балахонов С.В., Цэнджав С., Эрдэнэбат А. Новые плазмидовары штаммов возбудителя чумы, изолированных в Монголии. Мол. генет. 1991; 11:27-9.
6. Балахонов С.В., Шестопалов М.Ю., Романова И.Ф. Результаты VNTR-анализа по локусу (5'-CAAA-3')n штаммов Yersinia pestis из активных природных очагов чумы Сибири. Мол. генет. 2009; 3:14-7.
7. Логачев А.И., Корзун В.М., Михайлов Е.П., Рождественский Е.Н., Балахонов С.В. Распространенность триптофанзависимых вариантов Yersinia pestis на территории Алтайского горного природного очага чумы. Пробл. особо опасных инф. 2012; 3(113Д:20-5.
8. Онищенко Г.Г, Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная
диагностика особо опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. М.: Медицина, Шико; 2009.
C. 27-60.
9. Тарасова В.Е. К вопросу обнаружения чумы среди грызунов в Горном Алтае. Докл. Иркут. противочумн. ин-та. 1962; 3:11-3.
10. Erdenebat A., Batbold J., Dashnyam B. Plasmid content and distribution of Y. pestis isolated in Mongolia. Scientific Journal.
Center for Infectious Diseases With Natural Foci. 2001; 9:187-91
11. Le Fleche P., Hauck Y., Onteniente L., Prieur A., Denoeud
F., Ramisse V., Sylvestre P., Benson G., Ramisse F., Vergnaud G. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis. BMC Microbiol. 2001; 1:2.
12. Marklein G., Josten M., Klanke U., Muller E., Horre R., Maier T., Wensel T., Kostrzewa M., Bierbaum G., Hoerauf A. Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass-spectromeltry for fast and reliable identification of clinical yeast isolates. J. Clin. Microbiol. 2009; 47:2912-17.
References
1.Aparin G.P., Balakhonov S.V, Timofeeva LA., Logachev A.I. [Numerical analysis of the phenotype properties and general genome characteristics of the plague agent strains pertaining to different subspecies]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1987; 11:16-20.
2. AshmarinI.P., Vorob'evAA. [Statistical Methods in Microbiological Investigations]. L.: MEDGIZ; 1962. 179 p.
3. Balabkin A.K., Shamova A.M., Sarzhinsky VA., Lazarev B.V, Gorbacheva L.A. [About the natural plague focus in the territory of Gorny Altai]. [Reports of the Irkutsk Anti-Plague Institute]. 1962; 4:3-5.
4. Balakhonov S.V., Verxhutsky D.B., Korzun V.M., Vershinin E.A., Nemchenko L.S., Chipanin E.V [Current state of the natural plague foci in Siberia]. Zh. Infek. Patol. 2009; 16(3):16-20.
5. Balakhonov S.V., Tsendzhav S., Erdenebat A. [New plasmidovars of the plague agent strains, isolated in Mongolia]. Molek. Genet. 1991; 11:27-9.
6. Balakhonov S.V., ShestopalovM.Yu., Romanova I.F. [Results of the VNTR-analysis for (5’CAAA-3’)n locus of Yersinia pestis strains, isolated from active natural plague foci oiSiberia]. Molek. Genet. 2009; 3:14—7.
7. Logachev A.I., Korzun V.M., Mikhailov E.P., Rozhdestvensky E.N., Balakhonov S.V. [Distribution of tryptophan-dependent Yersinia pestis variants in the Altai mountain natural plague focus]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2012; (113):20-5.
8. Onishchenko G.G., Kutyrev VV, editors. [Laboratory Diagnostics of Particularly Dangerous Infections: Practice Guidelines]. M.: Meditsina, Shiko; 2009. P. 27-60.
9. Tarasova V.E. [Concerning detection of plague agent in rodents in the territory of Gorny Altai]. [Reports of the Irkutsk Anti-Plague Institute]. 1962; 3:11-3.
10. Erdenebat A., Batbold J., Dashnyam B. Plasmid content and distribution of Y. pestis isolated in Mongolia. Scientific Journal. Center for Infectious Diseases With Natural Foci. 2001; 9:187-91.
11. Le Fleche P., Hauck Y., Onteniente L., Prieur A., Denoeud F., Ramisse V, Sylvestre P., Benson G., Ramisse F., Vergnaud G. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis. BMC Microbiol. 2001; 1:2.
12. Marklein G., Josten M., Klanke U., Muller E., Horre R., Maier T., Wensel T., Kostrzewa M., Bierbaum G., Hoerauf A. Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass-spectrometry for fast and reliable identification of clinical yeast isolates. J. Clin. Microbiol. 2009; 47:2912-17.
Authors:
Balakhonov S.V., Afanas’ev M.V., Shestopalov M.Yu., Ostyak A.S., Vityazeva SA., Korzun V.M., Verzhutsky D.B. Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far East. 78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russia. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru
Mikhailov E.P., Mishchenko A.I., Denisov A.V., Ivzhenko N.I., Rozhdestvensky E.N., Viskov E.N., Fomina LA. Altai Plague Control Station.
2, Zavodskaya St., Gorno-Altaisk, 649002, Russia. E-mail: chuma@mail. gorny.ru
Об авторах:
Балахонов С.В., Афанасьев М.В., Шестопалов М.Ю., Остяк А.С., Витязева СА., Корзун ВМ., Вержуцкий Д.Б. Иркутский научноисследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока. 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78. E-mail: adm@chumin. irkutsk.ru
Михайлов Е.П., Мищенко А.И., Денисов А.В., Ивженко Н.И., Рождественский Е.Н., Висков Е.Н., Фомина Л.А. Алтайская противочумная станция. Республика Алтай, Горно-Алтайск, 649002, Заводская ул., 2. E-mail: chuma@mail.gorny.ru
Поступила 22.02.13.
