Апробация метода масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией для идентификации возбудителя чумы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© коллектив авторов, 2014

УДК 616.98:579.842.23]-073.175:543.42.062.08

Афанасьев М.в., остяк А.С., Балахонов С.в.

АПРОБАЦИЯ МЕТОДА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ С МАТРИЧНО-АКТИВИРОВАННОЙ ЛАЗЕРНОЙ ДЕСОРБЦИЕЙ/ИОНИЗАЦИЕЙ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, 664047, Иркутск

C использованием современного метода идентификации микроорганизмов MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа проведено исследование выборки штаммов Y. pestis основного и алтайского подвидов. Выполнена оценка биологической безопасности метода пробоподготовки, для пополнения идентификационной базы BioTyper получены спектры типовых штаммов Y. pestis. Расширенную идентификационную базу использовали для оценки возможности применения технологии MALDI-TOF для идентификации и таксономической дифференциации Y. pestis от других представителей рода Yersinia. При исследовании наблюдалось полное соответствие результатов масс-спектрометрической идентификации и классического культурального метода. На основании масс-спектрометрической характеристики исследуемой выборки удалось провести дифференциацию штаммов Y. pestis подвида pestis от штаммов подвида altaica. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности применения масс-спектрометрического анализа для достоверной меж- и внутривидовой дифференциации возбудителя чумы. Простота и скорость пробоподготовки и выполнения анализа, низкая стоимость расходных материалов позволяют рассматривать метод MALDI-TOF масс-спектрометрической идентификации как весьма перспективный для лабораторной диагностики возбудителя чумы.

Ключевые слова: Yersinia pestis; MALDI-TOF-MS-идентификация; биомаркеры. M.V. Afanasiyev, A.S. Ostiyak, S.VBalakhonov

THE APPROBATION OF TECHNIQUE OF MASS SPECTROMETRY WITH MATRIX-ACTIVATED LASER DESORPTION/IONIZATION FOR IDENTIFICATION OF PLAGUE AGENT

The Irkutsk antiplague research institute of Rospotrebnadzor, 664047 Irkutsk, Russia

The study of .sampling of strains of Y. pestis of main and altaw subspecies was implemented. The modern technique of identification of microorganisms was applied using MALDI-TOF mass spectrometry analysis. The evaluation of biological safety of method of sampling preparation was implemented. To supplement the identification base "BioTyper" the spectrum of typical strains of Y. pestis were obtained. The enhanced identification base was used to evaluate possibilities of application of MALDI-TOF technology for identification and taxonomic differentiation of Y. pestis from other representatives of genus of Yersinia. In the process of study a complete concordance of results of mass spectrometry identification and classic cultural method was observed. On the basis ofmass spectrometry characteristic of analyzed sampling the differentiation between strains of Y. pestis of subspecies pestis and strains of subspecies altaica was implemented.

The study results testify the effectiveness of application of mass spectrometry analysis for reliable interspecies and intraspecific differentiation ofplague agent. The simplicity and velocity of sampling preparation and implementation of analysis and low cost of active storage allow considering the MALDI-TOF technology of mass spectrometry identification as highly perspective method for laboratory diagnostic of plague agent.

Keywords: Yersinia pestis; MALDI-TOF identification; biomarker.

Введение. Чума — природно-очаговая инфекция с преимущественно трансмиссивным механизмом передачи, вызываемая Yersinia pestis. Наличие в мире, в частности на территории Российской Федерации активных природных очагов чумы, угроза проникновения и распространения инфекции в человеческой популяции, потенциальная возможность использования возбудителя чумы в качестве агента биологического терроризма обусловливает необходимость совершенствования мер диагностики, профилактики, терапии и мониторинга этой инфекции [1]. Быстрая и эффективная индикация и идентификация возбудителя чумы является одной из важнейших задач клинической микробиологии, определяющей своевременную постановку диагноза, а также реализацию полного объема противоэпидемических и профилактических мероприятий. На сегодняшний день в лабораторной диагностике чумы используют как классические микробиологические методы, основанные на изучении фенотипиче-ских свойств возбудителя, так и новые, в основе которых лежит молекулярно-генетический анализ [2—6]. Несмотря

Для корреспонденции:

Афанасьев Максим Владимирович, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. Адрес: 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 E-mail: [email protected]

на ряд преимуществ методов генодиагностики, изоляция чистой культуры возбудителя и определение его свойств остаются "золотым стандартом" клинической микробиологии. С этим связан большой интерес к новым методам, позволяющим проводить углубленное изучение полученного изолята на молекулярном уровне.

Одним из таких методов является времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (англ. Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry — MALDI TOF-MS). Идентификация исследуемого объекта осуществляется на основании сравнительного анализа его белковых профилей, являющихся видоспецифичными, а в некторых случаях — и штаммоспецифичными [7]. Суть метода заключается в матрично-опосредованной "мягкой" ионизации клеточных белков исследуемого патогена с последующим определением отношения массы к заряду ионов; на основе этих данных формируются характерные спектры [8]. Собранные в процессе анализа спектры исследуемых микроорганизмов сравнивают с референсными спектрами, присутствующими в базе данных. По степени совпадения определяют результат относительно таксономической принадлежности исследуемого объекта.

Для MALDI-TOF-MS необходимо наличие обширной базы данных референсных спектров исследуемых патогенов. Ком-

мерчески доступные базы данных масс-спектрометрической платформы BioTyper ("Bruker Daltonics", Германия), поставляемой в Российскую Федерацию, не содержат спектров возбудителей особо опасных инфекций, в частности чумы. В связи с этим существует необходимость создания собственной референсной базы данных для успешной идентификации указанной группы микроорганизмов.

Учитывая все вышесказанное, цель исследования — создание референсных спектров Y. pestis, а также апробация метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации для идентификации возбудителя чумы, представляется достаточно актуальной и перспективной.

Материалы и методы. В работе использовали 27 штаммов Y. pestis подвидов altaica и pestis, выделенных на территории Горно-Алтайского и Тувинского природных очагов чумы и Монголии. Все штаммы обладали типичными, характерными для соответствующего подвида Y. pestis фенотипи-ческими и генетическими свойствами.

Для масс-спектрометрического анализа штаммы выращивали на питательном агаре для культивирования микроорганизмов общего назначения, рН 7,2 (ФБУН ГНЦ ПМБ, Обо-ленск) в течение 24 ч при 28oC. Дополнительно 7 штаммов из указанной группы культивировали на агаре Хоттингера, рН 7,2 (Иркутский НИПЧИ) в тех же условиях. Экстракцию белков проводили следующим образом: исследуемый материал обрабатывали 70% этанолом, 70% раствором муравьиной кислоты с последующим добавлением ацетонитрила [9].

Проверке на специфическую стерильность подвергались полученные по описанному выше протоколу белковые экстракты 3 штаммов Y. pestis. Для каждого штамма готовили 3 серии белковых препаратов. Полученные экстракты, а также смывы с поверхности MSP-чипа с нанесенным на него экстрактом и матрицей исследовали на наличие живых Y. pestis в соответствии с Инструкцией по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного или холерного микробов [10].

Для масс-спектрометрического анализа по 1 мкл белкового экстракта вносили в лунку 96-луночного MSP-чипа. После подсыхания при комнатной температуре в течение 10—15 мин на образец наносили матрицу (насыщенный водный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты, содержащий 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты). В качестве контроля и калибровочного стандарта использовали белковый экстракт штамма E. coli DH5a (ref. № 255343; "Bruker Daltonics", Германия).

Сбор спектров проводили на масс-спектрометре Microflex™ LT MALDI-TOF ("Bruker Daltonics", Германия). Для получения одиночного масс-спектра использовали 40 импульсов лазера (частота 60 Гц), анализируемый диапазон масса/заряд составлял 2000—20 000 Да. С каждой лунки чипа снимался исходный спектр, представляющий собой сумму 6 одиночных спектров (240 импульсов лазера).

Семь штаммов Y. pestis, выращенных на питательном агаре, использовали для создания референсных спектров. Для этих штаммов исследование проводили в 12 повторах. MALDI-ToF масс-спектрометрическую идентификацию исследуемой выборки штаммов осуществляли в автоматическом режиме.

Анализ спектров, генерацию референсных библиотек и идентификацию выполняли с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0 ("Bruker Daltonics", Германия). Заключение о таксономической принадлежности микроорганизма делали на основании значения индекса совпадения (параметр score value — SV). Значение SV > 2,3 соответствовало достоверной идентификации до вида, sv < 2,299, но > 2,000 — достоверной идентификации до рода, вероятной идентификации до вида, значение SV в диапазоне 1,7 — 1,999 рассматривали как вероятную идентификацию до рода и < 1,7 — как недостоверный результат.

Кластерный анализ и построение дендрограмм осуществляли с использованием инструментов MAlDI Biotyper 3.0 ("Bruker Daltonics", Германия) и BioNumerics 6.6 ("Applied Maths", Бельгия).

Рис. 1. Масс-спектры 7 штаммов Y pestis (И-3236, И-3268, И-3447, И-3472, И-3474, И-3478, EV), использованных для создания референсных спектров.

kE

tE

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 Distance Level

100

Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia Yersinia

pseudotuberculosis DSM 8992T HAM

osis 298: osis Tvp: osis osis

3seuc 3seuc sseuc 3seuc

зегси зегси зегси зегси

17 RKB р- inv+ RKB 1 04 2 FLR

a'ie^síciaf D'S'lví

KB

EÄЖМЖЖ

'м^ттт*

aldovae enteroco enteroco enteroco enteroco enteroco enteroco

enteroco______

ohdei DSM^l

ristenseriii enteroco enteroco enteroco enteroco

serovar 09) H 705 86 RKB 'serovar ОЗОГЗ RKB

?sp enteroccíliticajserovar 08) ATOO 9610T RKB

SSW RKB ¡tica ps^ ertep^li^^^rovar 08) DSM 4780T RKB

itica ssp

pestis ssp. altaica 13446

:estis ss :estis ss oestis ss 3estis ss nestis ss testis ss :estis ss :estis ss :estis ss testis ss testis ss testis ss :est¡s ss 3estis ss testis ss testis ss vestís ss oestis ss :estis ss :est¡s ss lestis ss testis ss nestis ss :estis ss :estis ss testis ss

pestis EY pestis 132^ .. altaica "J 5. pestis ■ pestis :iestis :estis :estis :estis :estis altaica altaica 3. pestis 13450 - estis V"' taica taica taica estis |: Itaica

estis I34H3 __ estis 13449

3. altaica I33BÍ pestis 13236 3 estis 13353 í estis 13472 pestis 13431

!40

Ш

w

o

Рис. 2. Кластеризация представителей рода Yersinia, выполненная на основе референсных спектров (MSP) базы данных MAL-DI Biotyper 3.0 и спектров исследуемых штаммов вида Y. pestis.

MALDI

г

г

t гГ гГ

гГ^

гС гС

aii JÜüu.....I.

üjjlJÜLjLjl ■ I

Im ».Iii

JUtkjJiUj

jJjJL

..Uli. I

UjJLkUli ' ■ I

1ШЫ1

Ii,

.Lu.JiH, I

■iluülilJjLuL

lLlJLUJ

iL,. I.JIIiI

JJJULL

jjJLLLJl

juJUUL i

JLLLL

Ju^,

.„iii

ljlLl.

Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis EV Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp. Y. pestis ssp.

altaica 1-3474 (248) altaica 1-3429 (571) altaica I-3447 (1396) altaica I-3476 (2242) altaica I-3478 (3131) altaica I-3368 altaica I-3373 altaica I-3446 (1374) altaica I-3475 (1940) pestis I-3485 (979) pestis I-3484 (573) pestis 1-3469(3) pestis 1-3520(306)

pestis 1-3470 (625-628) pestis 1-3483(468-472) pestis 1-3472(850) pestis 1-3268 pestis 1-3502 (272) pestis 1-3482 (480) pestis 1-3240 pestis 1-3449(1095) pestis 1-3431 (896) pestis I-3236 pestis I-3450 (1552) pestis I-3353 pestis I-3504 (793)

Altai, Sered. Elangasha 2003 Amphalius runatus

Altai, East pt. Kuray mount 2000 Ochotona pricei

Altai, Sered. B. Shibet 2001 Paradoxopsyllus scorodumovi

Altai, Sered. Chagan-Uzuna 2003 Paradoxopsyllus scorodumovi

Altai, Sered. Chagan-Uzuna 2003 Ochotona pricei

Altai, Kochkor-Bas 1994 Lepus tolai

Altai, Stacionar 1994 Ochotona pricei

Altai, Sered. B. Shibet 2001 Paradoxopsyllus scorodumovi

Altai, East pt. Kuray mount 2003 Ctenophyllus hirticrus

Tuva, Mongun-Taiga, Kurgak-Sai 2004 Citellophilus tesquorum

Tuva, Tolailyg, Ak-karasug 2004 Citellophilus tesquorum

Tuva, Uzun-Hem, Mongun-Taiga 2003 Citellus undulatus

Tuva, Mongun-Taiga,Ush-Dorgun 2007 Citellophilus tesquorum

Tuva, Suur-Taiga, Mongun-Taiga 2003

Tuva, Mongun-Taiga, Suur-Taiga 2004

Tuva, Mongun-Taiga, Ouk-Hem 2003

Tuva, Boro-Shay 1990 Tuva, Mongun-Taiga,Bich-Chal-lash2006

Tuva, Mongun-Taiga, Ouk-Hem 2004 Mongolia, Bauan-Ulegey aimak, De. 1988

Tuva, Tolailyg, Buure 2001

Tuva, Mongun-Taiga,Chal-lash 2000

Tuva, Barlyk, Onachi 1988

Tuva, Kadir-Oruk, Mongun-Taiga 2001

Tuva, Uzun-Hem, Mongun-Taiga 1992

Tuva, Barlyk, Onachi, p25 2006

Citellus undulatus Citellus undulatus Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Marmota baibacina Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum Oropsylla asiatica Rhadidipsillus. scaloni Citellophilus tesquorum Citellophilus tesquorum

Рис. 3. Дендрограмма исследуемых штаммов К. pestis основного и алтайского подвидов. Указаны инвентарный номер штамма, место, год и источник выделения.

Для определения достоверности различий значений SV спектров исследуемых штаммов при использовании разных питательных сред применяли непараметрический критерий Вилкоксона.

Результаты и обсуждение. Конструктивные особенности масс-спектрометра Microflex Bruker Daltonics не предусматривают дезинфекции внутренней рабочей зоны прибора. В связи с этим возникла необходимость проверки инактиви-рующей способности метода пробоподготовки вирулентных штаммов Y. pestis (I группа патогенности).

Метод спиртовой обработки с последующей экстракцией муравьиной кислотой и ацетонитрилом обеспечивает обеззараживание патогенных иерсиний, а также удовлетворительное качество получаемых спектров и сохранность белковых экстрактов [11, 12]. Исследования на специфическую стерильность подтвердили отсутствие жизнеспособных форм Y. pestis в белковых экстрактах, а также смывах с поверхности MS-чипа, что позволяет осуществлять дальнейшие манипуляции в соответствие требованиями, предъявляемыми к обеззараженному материалу.

Референсные спектры Y. pestis, импортированные в базу данных программы MALDI Biotyper 3.0, получены из белковых экстрактов 7 штаммов Y. pestis подвидов altaica и pestis, выращенных на питательном агаре для культивирования микроорганизмов, при этом 6 штаммов являлись вирулентными, а седьмой, Y. pestis EV, — вакцинным. Масс-спектрометрические профили штаммов представлены на рис. 1. Параметры получения масс-спектров: алгоритм идентификации пика — Centroid, отношение сигнал/шум для пиков спектров — не менее 2, минимальная интенсивность пика — не менее 100 относительных единиц, количество качественных пиков — до 300, ширина пика — 4 m/z (отношение массы к заряду). Дополненная база данных использована для дальнейшей работы по идентификации.

На следующем этапе исследовали 20 штаммов Y. pestis подвидов altaica и pestis, выращенных на питательном агаре для культивирования микроорганизмов. Результаты масс-спектрометрической идентификации полностью совпадали с данными классического бактериологического анализа. Среднее значение SV для исследованных микроорганизмов составило 2,552 (минимальное значение — 2,319, максимальное — 2,668), что свидетельствует о достоверной видовой идентификации. Ранее в некоторых работах были получены противоречивые результаты дифференциации Y. pestis от других видов близкородственных иерсиний, в первую очередь от Y. pseudotuberculosis [13]. Однако при сравнительном анализе спектров исследуемых штаммов Y. pestis и спектров других представителей рода Yersinia, имеющихся в базе программы "BioTyper", наблюдалась корректная таксономическсая дифференциация разных видов этого рода (рис. 2).

Детальный анализ спектров выявил отсутствие пика со значением m/z 3065±2 у штаммов Y pestis ssp. altaica. В предшествующих работах данный пик, соответствующий пептиду, состоящему из 30 аминокислотных остатков и образующемуся в процессе посттрансляционной модификации молекулы активатора плазминогена (Pla) в результате отщепления N-концевого фрагмента, рассматривали как видоспецифичный для Y. pestis биомаркер [14]. Очевидно, отсутствие этого маркера у штаммов алтайского подвида требует поиска дополнительных масс-спектрометрических биомаркеров, специфичных для возбудителя чумы неосновных подвидов.

При сопоставлении результатов исследования штаммов, выращенных на разных питательных средах, выявлена значимая зависимость sv от вида среды: среднее значение sv при исследовании одних и тех же штаммов с питательного агара составляло 2,665, а с агара Хоттингера — 2,44 (р = 0,017961). Это свидетельствует о необходимости одинаковых условий при подготовке штаммов как для создания референсных спектров, так и для масс-спектрометрических исследований. Однако необходимо отметить, что при использовании любой

из двух использованных сред удалось идентифицировать микроорганизм до вида.

Предпринята попытка оценки возможности использования масс-спектрометрического анализа для внутривидовой дифференциации исследуемых штаммов. Данный методологический подход ранее применяли для идентификации штаммов чумы, относящихся к различным биоварам [15], а также для установления вероятного источника происхождения штамма Y. pestis, выделенного на не свойственной для него территории [16]. Дендрограмма, построенная на основании сравнительного анализа масс-спектров штаммов 2 подвидов, основного и алтайского, демонстрирует эффективное разделение штаммов Y. pestis разных подвидов (рис. 3).

Полученные результаты свидетельствуют об эффективности применения масс-спектрометрического анализа для достоверной и эффективной межвидовой дифференциации возбудителя чумы от других представителей рода Yersinia. Перспективным представляется также использование метода для внутривидовой идентификации и эпидемиологического типирования Y. pestis, в основе которого лежат усовершенствованные подходы математического и статистического анализа.

ЛИТЕРАТУРА

(пп. 4 — 9, 11 — 15 см. в REFERENCES)

1. Онищенко Г.Г., ред. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: Медицина; 2004.

2. Балахонов С.В. Геномные маркеры возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, холеры, бруцеллеза: автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. Иркутск; 2000.

3. Афанасьев М.В., Чипанин Е.В., Шестаков В.Е., Денисов А.В., Фомина Л.А., Остяк А.С. и др. Разработка и использование ПЦР-системы в режиме реального времени для детекции Yersinia pestis в полевом материале. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 3: 38—41.

10. Инструкция по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного и холерного микроба. Саратов; 1982. 16. Балахонов С.В., Афанасьев М.В., Шестопалов М.Ю., Остяк А.С., Витязева С.А., Корзун В.М. и др. Первый случай выделения Yersinia pestis subsp. pestis в алтайском горном природном очаге чумы. Сообщение 1. Микробиологическая характеристика, молекулярно-генетическая и масс-спектрометрическая идентификация изолята. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 1: 60—5.

REFERENCES

1. Onishchenko G.G., ed. Natural foci of plague of Caucasus, Caspian, Central Asia and Siberia. Moscow: Meditsina; 2004. (in Russian)

2. Balakhonov S.V. Genomic markers of plague, pseudotuberculosis, cholera, and brucellosis pathogens. Diss. Irkutsk; 2000. (in Russian)

3. Afanas'ev M.V., Chipanin E.V., Shestakov V.E., Denisov A.V., Fomi-na L.A., Ostyak A.S. et al. The development and implementation of polymerase chain reaction to detect in real-time operation mode Yersinia pestis in field material. Klinicheskaya laboratornaya diagnos-tika. 2013; 3: 38—41. (in Russian)

4. Chase C.J., Ulrich M.P., Wasieloski L.P. Jr., Kondig J.P., Garrison J., Lindler L.E. et al. Real-time PCR assays targeting a unique chromosomal sequence of Yersinia pestis. Clin. Chem. 2005; 51: 1778—85.

5. Radnedge L., Chin S.G., Mccready P.M. Worsham P.L., Andersen G.L. Identification of nucleotide sequences for the specific and rapid detection of Yersinia pestis. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67: 3759—62.

6. Zhou D., Han Y., Dai E., Pei D., Song Y., Zhai J. et al. Identification of signature genes for rapid and specific characterization of Yersinia pestis. Microbiol. Immunol. 2004; 48: 263—9.

7. Seng P., Drancourt M., Gouriet F., La Scola B., Fournier P.E., Rolain J.M. et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 2009; 49 (4): 552—3.

8. Karas M., Bahr U. Laser desorption ionization mass spectrometry of large biomolecules. Trends Anal. Chem. 1990; 9 (10): 321—5.

9. "MALDI Biotyper 3.0 User Manual. Rev 2" (Bruker Daltonics, Germany. Feb., 2011).

10. Instructions for the control of specific .sterility of experimental drugs prepared from cultures of the plague and cholera microbe. Saratov; 1982. (in Russian)

11. Couderc C., Nappez C., Drancourt M. Comparing inactivation protocols of Yersinia organisms for identification with matrix-assisted laser esorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2012; 26: 710—4.

12. Drevinek M., Dresler J., Klimentova J., Pisa L., Hubalek M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 2012; 55: 40—6.

13. Wittwer M., Heim J., Schär M., Dewarrat G., Schürch N. Tapping the potential of intact cell mass spectrometry with a combined data ana-

lytical approach applied to Yersinia spp.: detection, differentiation and identification of Y. pestis. Syst. Appl. Microbiol. 2011; 34: 12—9.

14. Lasch P., Drevinek M., Nattermann H., Grunow R., Stämmler M., Dieckmann R. et al. Characterization of Yersinia using MALDI-TOF mass spectrometry and chemometrics. Anal. Chem. 2010; 82: 8464—75.

15. Ayyadurai S., Flaudrops C., Raoult D., Drancourt M. Rapid identification and typing of Yersinia pestis and other Yersinia species by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDITOF) mass spectrometry. BMC Microbiol. 2010; 10: 285.

16. Balakhonov S.V., Afanasiev M.V., Shestopalov M.Yu., Ostyak A.S., Vityazeva S.A., Korzun V.M. et al. The first case of allocation of Yersinia pestis subsp. pestis in the Altai mountain natural focus of plague. Message 1. Microbiological characterization of molecular-genetic and mass spectrometric identification of the isolate. Prob-lemy osobo opasnykh infektsiy. 2013; 1: 60—5. (in Russian)

Поступила 14.12.13 Received 14.12.13

© коллектив авторов, 2014

УДК 616.832-001-06:616.24-002-022.7-078

Ульянов в.Ю.1, определенцева СБ.1, Швиденко и.Г.2, Норкин и.А.1, Коршунов Г.в.1, Гладкова Е.в.1

БИОЛОГИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА БИОПЛЕНОК КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS И PSEUDOMONAS AERUGINOSA, ВЫДЕЛЕННЫХ У БОЛЬНЫХ С БРОНХОЛЕГОЧНЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ ПРИ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СПИННОГО МОЗГА

1ФГБУ "Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии" Минздрава России, 410002, Саратов; 2ГБоУ впо "Саратовский государственный медицинский университет им. в.И. Разумовского" Минздрава России, 410012, Саратов

В статических условиях культивирования в течение 24, 48, 72 и 96 ч изучена способность и интенсивность формирования микробных биопленок у 24 клинических штаммов Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, выделенных у больных с бронхолегочными инфекционными осложнениями в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга.

Ключевые слова: бактериальные биопленки; золотистый стафилококк; синегнойная палочка; бронхолегочные осложнения; травматическая болезнь; спинной мозг.

V.Yu. Uliyanov1, S.V. Opredelentseva1, I.G. Shvidenko2, I.A. Norkin1, G.VKorshunov1, E.V. Gladkova1

THE BIOLOGICAL KINETICS OF BIOFILMS OF CLINICAL STRAINS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND PSEUDOMONAS AERUGINOSA SEPARATED FROM PATIENTS WITH BRONCHOPULMONARY COMPLICATIONS UNDER TRAUMATIC DISEASE OF SPINAL CORD

1The Saratov research institute of traumatology and orthopedics of Minzdrav of Russia, 410012 Saratov, Russia 2The V.I. Razumovskiy Saratov state medical university of Minzdrav of Russia, 410012 Saratov, Russia

The capacity and intensity of formation of microbial biofilms was analyzed in 24 strains of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa in static conditions of cultivation during 24, 48, 72 and 96 yours. The microorganisms were separated from patients with bronchopulmonary infectious complications in acute and early periods of traumatic disease of spinal cord.

Keywords: bacterial biofilm; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; bronchopulmonary complication; traumatic disease; spinal cord.

Бактериальные инфекции нижних дыхательных путей, вызванные условно-патогенными возбудителями, являются наиболее ранними осложнениями, развивающимися в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга [1, 2]. Возникновение гнойно-воспалительных осложнений в бронхиальном дереве у больных с травматическими повреждениями шейного отдела позвоночника и спинного мозга обусловлено выраженным неврологическим дефицитом, характеризующимся параличом диафрагмы и других вспомогательных дыхательных мышц [3]. Неврологический дефицит в посттравматическом периоде приводит к неэффективной экс-пекторации, нарушениям мукоцилиарного клиренса, умень-

Для корреспонденции:

Ульянов Владимир Юрьевич, науч. сотр. Адрес: 410002, Саратов, ул. Чернышевского, 148. E-mail: [email protected]

шению резистентности и инфицированию слизистой оболочки нижних дыхательных путей [4]. Среди возбудителей бронхолегочных осложнений наибольшее клиническое значение в посттравматическом периоде имеют Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, общим свойством которых является высокая патогенность, обусловленная наличием межклеточной сигнальной системы quorum sensing и способностью микроорганизмов к биопленкообразованию [5—7]. Способность к формированию биопленки определяется не только видом возбудителя, но и характером инфекционного процесса (аспирационный пневмонит, постинтубационные осложнения, функционирующая трахеостома, эндобронхит, пневмония), развивающегося на фоне иммуносупрессии и синдрома системного воспалительного ответа [8—10]. В основе патогенеза бронхолегочных инфекционных осложнений при травматической болезни спинного мозга лежит переход от планктонного фенотипа микроорганизмов к формированию