CC BY
69
МИКРОБИОЛОГИЯ
Пробл. особо опасных инф. 2016; 2:91-94. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-91-94
УДК 616.98:579.842.23
А.н.спицын, Д.В.Уткин, н.Е.Щербакова, с.А.Портенко, А.с.Абдрашитова, и.АЖасьян,
В.Г.Германчук, В^Жуклев
maldi-tof масс-спектрометрический анализ штаммов
возбудителя чумы
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»», Саратов, Российская Федерация
цель. Продемонстрировать целесообразность создания базы данных референсных масс-спектров возбудителей особо опасных инфекций методом MALDI-TOF масс-спектрометрии на примере штаммов возбудителей чумы. материалы и методы. В работе использовался метод MALDI-TOF масс-спектрометрии для получения масс-спектров рибосомальных белков исследуемых микроорганизмов с помощью масс-спектрометров Microflex LT. результаты и выводы. Проведено сравнение полученных масс-спектров 10 штаммов Y. pestis с референсны-ми спектрами Y. pseudotuberculosis коммерческой базы данных MALDI Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics, Германия). Произведено апробирование базы данных при проведении идентификации штаммов чумного микроба, выделенных из природных очагов чумы на территории Российской Федерации в 2012 и 2014 гг. Разработанная база данных позволяет осуществлять идентификацию штаммов Y. pestis до вида.
Ключевые слова: Y. pestis, MALDI-TOF масс-спектрометрия, база данных, идентификация, референсные масс-спектры.
Корреспондирующий автор: Спицын Алексей Николаевич, e-mail: [email protected].
A.N.Spitsyn, D.V.Utkin, N.E.Shcherbakova, S.A.Portenko, A.S.Abdrashitova, I.A.Kas'yan, V.G.Germanchuk, V.E.Kuklev
MALDI-TOF Mass-Spectrometry Analysis of Plague Agent Strains
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Objective of the study was to demonstrate practicability of data base creation, containing reference mass-spectra of agents of particularly dangerous infections, using MALDI-TOF mass-spectrometry, by the example of plague agent strains. Materials and methods. MALDI-TOF mass-spectrometry was deployed for the obtainment of mass-spectra of ribosomal proteins from the microorganisms under investigation with the help of mass-spectrometers - Microflex LT. Results and conclusions. Carried out was comparative analysis of the obtained mass-spectra of 10 Y. pestis strains and reference spectra of Y. tuberculosis, contained in commercial data base of MALDI Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics, Germany). Developed data base was validated in the process of identification of plague microbe strains, isolated in the territory of natural plague foci of the Russian Federation. That data base provided for correct identification of Y. pestis strains up to a species.
Key words: MALDI-TOF mass-spectrometry, database, identification, reference mass-spectra.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Aleksey N. Spitsyn, e-mail: [email protected].
Citation: Spitsyn A.N., Utkin D.V., Shcherbakova N.E., Portenko S.A., Abdrashitova A.S., Kas'yan I.A., Germanchuk V.G., Kuklev V.E. MALDI-TOF Mass-Spectrometry Analysis of Plague Agent Strains. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; 2:91-94. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2016-2-91-94
В последнее время широкое распространение в идентификации микроорганизмов получил метод времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS). Масс-спектрометрия - метод исследования и анализа вещества, основанный на ионизации атомов и молекул, входящих в состав исследуемого образца, и регистрации спектра масс образовавшихся ионов. Полученный спектральный паттерн (белковый профиль) является уникальной родо-, видо-, а в некоторых случаях штаммоспеци-фичной характеристикой, которая позволяет идентифицировать микроорганизм до рода, вида и иногда осуществить подвидовую дифференциацию.
высокая точность идентификации микроорганизмов с помощью данного метода, основанного на анализе белкового состава микроорганизмов, была отмечена многими исследователями [3, 4, 5, 6]. Применение метода прямого белкового профили-
рования позволяет сократить время идентификации выделенных культур микроорганизмов (до 2 ч) по сравнению с общепринятыми методиками (6-48 ч), а также снижает стоимость исследований и увеличивает пропускную способность лаборатории [1, 2, 7]. Одним из необходимых условий достоверной видовой дифференциации является наличие достаточной масс-спектрометрической базы данных белковых профилей микроорганизмов.
При идентификации микроорганизмов на MALDI-TOF масс-спектрометрах Microflex в работе используют коммерческие базы данных (MALDI Biotyper 3.1, Bruker Daltonics, Германия). Однако в коммерческой базе данных программы MALDI Biotyper 3.1, поставляемой в Российскую Федерацию, отсутствуют референсные спектры возбудителей опасных инфекционных болезней, в частности, микроорганизмов вида Yersinia pestis. Цель данной работы заключалась в дополнении существующей базы данных спектрами
2016, issue 2
91
штаммов Y. pestis для использования в дальнейшем при идентификации чумного микроба методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Для решения данной проблемы специалистами учреждений Роспотребнадзора ведется работа по созданию библиотек и баз данных спектров штаммов Y pestis.
Материалы и методы
В работе использовали 25 штаммов Y pestis, выделенных в период с 1970 по 2014 год в различных природных очагах чумы, из них 10 штаммов - для создания референсных масс-спектров (таблица) и 15 штаммов - при апробации созданной базы данных в ходе идентификации штаммов чумного микроба. Штаммы Y pestis из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» являются типичными по культурально-морфологическим, биохимическим и молекулярно-генетическим свойствам. Штаммы чумного микроба для получения масс-спектров культивировали на агаре Хоттингера (pH 7,2) при температуре 28 °C в течение 24-48 ч.
Методика масс-спектрометрического анализа
для создания референсных масс-спектров (MSP) возбудителей особо опасных инфекционных болезней и внесения их в базу данных используют белковые экстракты исследуемых культур микроорганизмов. Белковую экстракцию проводили с использованием 96 % этанола и 70 % водного раствора муравьиной кислоты по стандартной методике, рекомендованной Bruker для проведения MALDI-TOF прямого белкового профилирования неспорообра-зующих микроорганизмов.
Полученный супернатант (1 мкл), содержащий белковый экстракт, наносили на ячейку 96-луночного MSP-чипа (MSP 96 target polished steel BC, microScout Target). На поверхность супернатанта в чипе наносили 1 мкл раствора матрицы (насыщенный раствор а-Циано-4-гидроксикоричной кислоты (a-HCCA) с 50 % содержанием ацетонитрила и 2,5 % трифторук-
сусной кислоты (TFA)) и высушивали при комнатной температуре.
чип с нанесенными на него образцами помещали в MALDI-TOF масс-спектрометр microflex LT. После позиционирования чипа в ионизационной камере и достижения необходимых значений рабочих параметров прибора проводили калибровку с помощью нанесенного калибровочного стандарта. После этого приступали к сбору спектров в ручном или автоматическом режиме, устанавливая необходимые параметры. для получения одиночного масс-спектра использовали 40 импульсов лазера (частота 60 гц). Анализируемый диапазон масса/заряд составлял 2000-20000 Да.
для штаммов Y. pestis сбор спектров проводили по следующей схеме: с 8 ячеек MSP-чипа (для каждого штамма) были получены 24 исходных масс-спектра. В программе flexAnalysis (Bruker Daltonics) проводилась оценка качества исходных масс-спектров, сглаживание, выравнивание и вычет фоновой линии. Далее в программе «MALDI Biotyper 3.1 (Offline classification)» из отобранных исходных масс-спектров были созданы референсные масс-спектры. Для создания референсного масс-спектра одного штамма необходимо не менее 20 исходных.
Результаты и обсуждение
В результате проведенного масс-спектромет-рического анализа были получены референсные масс-спектры десяти штаммов возбудителя чумы Y. pestis (таблица). В ходе проведения эксперимента исследуемые типичные штаммы Y. pestis с использованием референсных масс-спектров, содержащихся в базе данных программы MALDI Biotyper 3.1, были идентифицированы как микроорганизмы вида Y pseudotuberculosis. При построении MALDI-TOF дендрограммы масс-спектров в программе Biotyper по алгоритму метода попарного внутригруппового невзвешенного среднего (англ. Unweighted Pair Group
Штаммы Y. pestis, используемые для создания референсных масс-спектров
Название штамма Место выделения Природный очаг Дата выделения
Y. pestis ssp. pestis М-1773 [1047 Аст.] Y. pestis ssp. pestis М-1864 (883-Аст)
Y pestis ssp. pestis М-978 [1109 Астр.]
Y pestis ssp. caucasica C-740 [494]
Y pestis ssp. pestis C-627 [176 КБ]
Y pestis ssp. pestis А-1809
Y pestis А-1815 [257/17]
Y pestis ssp. ulegeica КМ-684 (И-2422)
Y pestis ssp. altaica И-2998 [62]
Y pestis ssp. pestis 1116-Д
Астраханская область, Красноярский район
Республика Калмыкия, Лаганский район
Калмыкская АССР, Юстинский район, Черные земли
Республика Дагестан, Кулинский район, с. Хозрек
Карачаево-Черкесская Республика, г. Кызыл-Кала
Урочище Карагайлы (долина реки Беш-Таш) Таласского хребта Тянь-Шаня
таласский район, урочище Карагайлы
МНР, Баян-Улэгэйский аймак, г. Цаган-Нур
Республика Алтай, Кош-Агачский район, Кызыл-Тас
Малгобекский эпидотряд, 5 км севернее с. Ачалуки
Волго-Уральский песчаный 17.05.2002
Прикаспийский песчаный 16.04.2009
Прикаспийский Северо-Западный степной 14.04.1990
Восточно-Кавказский высокогорный 08.06.1998
Центрально-Кавказский высокогорный 28.08.1986
Таласский высокогорный 28.08.1980
Таласский высокогорный 06.09.1980
27.06.1974
Горно-Алтайский высокогорный 27.08.1982
Терско-Сунженский низкогорный 23.06.1970
МИКРОБИОЛОГИЯ
MSP Dendrogramm
Distance Level
- M-1864
- C-740
- C-627
- KM-684 " M-978
- 1116-fl
- A-1815
- A-1809
- M-2998
- M-1773
- Yersinia pseudotuberculosis DSM 8992T DSM
- Yersinia pseudotuberculosis Typ3 p- inv+ RKB
- Yersinia pseudotuberculosis I RKB inia pseudotuberculosis CIP 55_86 CIP
-| Yersinia pseudotuberculosis 29827 RKB
- Yersinia pseudotuberculosis DSM 8992T HAM
- Yersinia pseudotuberculosis 29490 RKB
- Yersinia pseudotuberculosis A188_1_04_2 FLR
- Yersinia pseudotuberculosis CIP A1 CIP
- Yersinia pseudotuberculosis CIP 104897 CIP
- Yersinia pseudotuberculosis 55_88 CIP
- Yersinia pseudotuberculosis CIP 104896 CIP
Рис. 1. Кластерный анализ MALDI-TOF-MS спектров штаммов Y. pseudotuberculosis, содержащихся в базе данных программы MALDI Biotyper 3.1 и вносимых в базу данных штаммов возбудителя Y. pestis. Расстояние отображается в относительных единицах
Method with Arithmetic Mean, UPGMA) было установлено, что исследуемые штаммы микроорганизмов
вида Y. pestis и вида Y. pseudotuberculosis кластеризуются двумя четко различимыми группами (рис. 1).
Рис. 2. Пики, специфичные и общие для Y pestis и Y. pseudotuberculosis
2016, Issue 2
93
Сравнительный анализ полученных масс-спектрометрических профилей Y. pestis позволил определить специфичный пик для основного подвида pestis (m/z 3061) и общие пики для Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (m/z 4830, 5426, 8366, 9658, 10297, 13268) (рис. 2).
Следующий этап работы заключался в апробации созданной базы данных масс-спектров при проведении идентификации 15 штаммов возбудителя чумы: Y. pestis основного подвида (штамм 1454) и Y. pestis алтайского подвида, выделенных на территории горно-Алтайского природного очага чумы в 2012 и 2014 гг. (штаммы 1307, 2397, 2416, 2513-15, 2633, 2639, 2739, 2774, 2881, 2967, 3021, 2691, 3057, 3067). Во всех случаях культуры были идентифицированы как Y. pestis со значением score >2,3.
Таким образом, полученные результаты исследования показали возможность создания баз данных возбудителей опасных инфекций, что, в свою очередь, позволяет проведение их идентификации методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Спицын А.Н., Уткин Д.В., Куклев В.Е., Портенко С.А., Германчук В.Г., Осина Н.А. Применение MALDI масс-спектрометрии в диагностике инфекционных болезней. Современное состояние и перспективы. Пробл. особо опасных инф. 2014; 3:77-82.
2. Ayyadurai S., Flaudrops C., Raoult D., Drancourt M. Rapid identification and typing of Yersinia pestis and other Yersinia species by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. BMC Microbiology. 2010; 10:285.
3. Bader O., Weig M., Taverne-GhadWal L., Lugert R., Cross U., Kuhns M. Improved clinical laboratory identification of human pathogenic yeasts by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Microbiol. Infect. 2011; 17:135965. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2010.03398.x.
4. Cherkaoui A., Hibbs J., Emonet S., Tangomo M., Girard M., Francois P., Schrenzel J. Comparison of Two Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry Methods with Conventional Phenotypic Identification for Routine Identification of Bacteria to the Species Level. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(4):1169-75. DOI: 10.1128/JCM.01881-09.
5. Croxatto A., Prod'hom G., Greub G. Applications of
MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMSMicrobiol. Rev. 2011; 36:380-407. DOI: 10.1111/j.1574-6976.2011.00298.x.
6. Veen van S.Q., Claas E.C.J., Kuijper Ed. J. High-Throughput Identification of Bacteria and Yeast by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry in Conventional Medical Microbiology Laboratories. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(3):900-7. DOI: 10.1128/JCM.02071-09.
7. Wittwer M., Lasch P., Drevinek M., Schmoldt S., Indra A., Jacob D., Grunow R. First Report: Application of MALDI-TOF MS within an External Quality Assurance Exercise for the Discrimination of Highly Pathogenic Bacteria from Contaminant Flora. Applied Biosafety. 2012; H(2):59-63.
References
1. Spitsyn A.N., Utkin D.V., Kuklev V.E., Portenko S.A., Germanchuk V.G., Osina N.A. [Application of MALDI mass-spectrometry for diagnostics of particularly dangerous infectious diseases: current state of affairs and prospects]. Probl. Osobo. Opasn. Infek. 2014; 3:77-82.
2. Ayyadurai S., Flaudrops C., Raoult D., Drancourt M. Rapid identification and typing of Yersinia pestis and other Yersinia species by matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. BMC Microbiology. 2010; 10:285.
3. Bader O., Weig M., Taverne-Ghadwal L., Lugert R., Cross U., Kuhns M. Improved clinical laboratory identification of human pathogenic yeasts by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrom-etry. Clin. Microbiol. Infect. 2011; 17:1359-65. DOI: 10.1111/j.1469-0691 .2010.03398.x.
4. Cherkaoui A., Hibbs J., Emonet S., Tangomo M., Girard M., Francois P., Schrenzel J. Comparison of Two Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry Methods with Conventional Phenotypic Identification for Routine Identification of Bacteria to the Species Level. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(4): 1169-75. DOI: 10.1128/JCM.01881-09.
5. Croxatto A., Prod'hom G., Greub G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol. Rev. 2011; 36:380-407. DOI: 10.1111/j.1574-6976.2011.00298.x.
6. Veen van S.Q., Claas E.C.J., Kuijper Ed. J. High-Throughput Identification of Bacteria and Yeast by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry in Conventional Medical Microbiology Laboratories. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(3):900-7. DOI: 10.1128/JCM.02071-09.
7. Wittwer M., Lasch P., Drevinek M., Schmoldt S., Indra A., Jacob D., Grunow R. First Report: Application of MALDI-TOF MS within an External Quality Assurance Exercise for the Discrimination of Highly Pathogenic Bacteria from Contaminant Flora. Applied Biosafety. 2012; 17(2):59-63.
Authors:
Spitsyn A.N., Utkin D.V., Shcherbakova N.E., Portenko S.A., Abdrashitova A.S., Kas'yan I.A., Germanchuk V.G., Kuklev V.E. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: [email protected].
Об авторах:
Спицын А.Н., Уткин Д.В., Щербакова Н.Е., Портенко С.А., АбдрашитоваА.С., КасьянИ.А., ГерманчукВ.Г., КуклевВ.Е. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected].
Поступила 07.05.15.
