CC BY
73
УДК 602.3:579.6
DOI 10.18286/1816-4501-2018-2-110-113
УСТАНОВЛЕНИЕ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ МЕТОДОМ MALDI-TOF MS
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Мастиленко Андрей Владимирович, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Cyльдинa Екатеpинa Влaдимиpовнa, ассистент кафедры «Микробиология, вирусология, эпи-оотология и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 8(8422)55-95-47; e-mail: feokna@yandex.ru
Ключевые слова: Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Enterobacter cloacae, MALDI-TOF-профилирование, масс-спектрометрия.
В статье представлены результаты использования масс-спектрометрии MALDI-TOF с целью идентификации микроорганизмов видов Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Enterobacter cloacae, которые были выделены в 2016 году из патологического материала и объектов санитарного надзора животноводческих и птицеводческих помещений хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям. Первично видовая дифференциация проводилась на основании изучения тинкториальных, культурально-морфологических и биохимических свойств. Для исследования протеомов бактериальных культур было проведено их MALDI-TOF-профилирование (анализ профилей белков, которые извлекаются из целых бактерий) и подтверждено их соответствие определяемым видам. Отпечатки белков с различными молекулярными массами получали с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра Microflex LT (BrukerCorp., Billerica, USA) с обнаружением в линейном положительном режиме на частоте лазера 50 Гц и в диапазоне масс от 2000 до 30 000Да. Напряжение разгона составляло 20 кВ, а время задержки экстракции 200 нс. Для генерации каждого ионного спектра использовалось не менее 10лазерных снимков на образец. Для каждого бактериального образца в общей сложности 100 отпечатков белков с различными молекулярными массами усредняли и обрабатывали с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper (BrukerCorp., Billerica, USA). Так, в проведенных исследованиях установлено, что штамм Prot2 принадлежит к виду Proteus mirabilis, Ye3 -Yersinia enterocolitica, En2 - Enterobacter cloacae.
Исследования проводятся при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект «Ге-номика и биология кандидатных бактериофагов для терапии энтеробактериальных инфекций
в ветеринарной медицине» № 16-44-732038.
Введение
Геномная информация в микробной клетке биоинформирует нас о наличии более чем 2000 белков [1]. Считается, что для геномов, которые содержат менее 1000 генов, более 50 % прогнозируемого протеома может быть идентифицировано из генома. Аналогично, 30 % и 10 % прогнозируемого протеома могут быть идентифицированы из геномов, которые несут около 2500 и около 4000 генов соответственно [2]. Таким образом, микробный геном, содержащий 600-7000 предсказанных генов, представляет собой среднюю или сложную систему, где применение протеомики может обеспечить знание значительной части протеома микроорганизма.
Характеристика и дифференциация микробного протеома развивались и прогрессировали с использованием методов разделения белка в геле. Разделение нативных клеточных белков в по-лиакриламидном геле (ПААГ) в сочетании с компьютерным анализом использовали в нескольких исследованиях для идентификации и классифи-
кации микроорганизмов [3]. При выполнении в стандартизированных условиях эта методика была достаточно воспроизводимой. Однако профилирование белков в ПААГ не стало популярным среди микробиологов. Это может быть связано с:
- отсутствием обширных баз данных для идентификации неизвестных микроорганизмов;
- требованием высоко стандартизированных условий, включающих рост неизвестных микроорганизмов на идентичных средах, стандартизированные электрофоретические условия, процедуры окрашивания и последующий анализ образцов;
- техника не являлась достаточно точной для различия сильно похожих штаммов.
Двумерный гель-электрофорез (2^) также не стал популярным среди микробиологов, так как он был трудоемким практическим методом, даже после того, как появились готовые решения для его проведения и улучшенное программное обеспечение для анализа геля [4]. Достоинства и недостатки других протеомных подходов были
также рассмотрены [5].
Цель работы - установление видовой принадлежности штаммов бактерий Prot2, Ye3, En2, выделенных коллективом авторов в 2016 году, методом MALDI-TOF спектрометрии.
Объекты и методы исследований
Штаммы бактерий Prot2, Ye3, En2, которые были выделены коллективом авторов из патологического материала и объектов санитарного надзора животноводческих и птицеводческих помещений из хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям, и идентифицированы на основании изучения тинкториальных, культураль-но-морфологических и биохимических свойств следующим образом: Prot2 определена как Proteus mirabilis, Ye3 - как Yersinia enterocolitica, En2 - Enterobacter cloacae [6, 7].
В исследованиях использовали следующие материалы: синапиновая кислота (Sigma-Aldrich, USA), ацетони-трил (Sigma-Aldrich, USA), триф-торуксусная кислота (Sigma-Aldrich, USA), мясо-пептонный бульон (ГМФ-агар), (НИЦФ, Санкт-Петербург, РФ), мясо-пептонный агар (ГМФ-агар) (НИЦФ, Санкт-Петербург, Россия), спирт этиловый 70°.
Для культивирования бактерий использовались стандартные условия. Бактерии выращивались на мясопептон-ном бульоне (МПБ) в условиях термостата при 37 °С в течение 12 часов, затем культура рассе-валась методом штриха на мя-сопептонный агар (МПА) для получения отдельных колоний.
Клетки каждого штамма непосредственно наносили на стальной планшет MALDI (две одиночные колонии в дубликатах) с использованием одно-
Mb Detected Species Log(Score)
Proteus mirabilis: IFX1 22086112 MLD 2.311
П Proteus mirabilis 13210 1 CHE 2.210
h 1 Proteus mirabilis DSM 30115[iSM 2.168
M Proteus mirabilis 3402 2 CHB 2.1 S3
fi Proteus mirabilis RV412 Al 2010 DCbLGK 2.123
M 1 Proteus mirdbiisDSM 18254D5M 2.074
Ы Proteus mirabilis DSM 758 DSM 1.93G
H 1 Proteus mirabilis DSM 509Û3 D5M 1.963
M , Proteus mirabilis DSM 4Ê22? DSM 1.Э11
• Proteus vuloafis IPX1 220B6128 MLD 1.612
Рис. 1 - Показатели белковых спектров бактериального изолята Proteus mirabilis Prot2 и его идентификация по результатам использования программного обеспечения MALDI Biotyper
4
Mr Detected Species Log(Scofe)
■ Yersinia enterocolitica ssp enterocolitica fserovar 081ATCC ... 1.547
Yersinia enterocolitica ssp Yersinia enterocolitica ssp enterocolitica DSM 4790T DSM enterocolitica DSM 9676 DSM 1.47Э 1.400
Yersinia enterocolitica ssp Yersinia enterocolitica ssp enterocolitica fserovar 081 DSM ... enterocolitica DSM 11503 DSM 1.340 1.330
Yersinia enterocolitica ssp enterocolitica DSM 9499 DSM Yersinia enterocolitica ssp enterocolitica DSM 11067 DSM Aspergillus niqet A.TCC 6275 K7440 HED 1.311 1.300 1.225
Yersinia enterocolitica iserovai 041 431 31075 RKB 1.217
Yersinia enterocolitica fserovar 030) 3 RKB 1.214
Рис. 2 - Показатели белковых спектров бактериального изолята Yersinia enterocolitica Ye3 и его идентификация по результатам использования программного обеспечения MALDI Biotyper
ТГГ Enterobacter cloacae MB 11506 1 CHB 1.896
9 1 Enterobacter cloacae DSM 46348 DSM 1.653
« I Enterobacter cloacae MB 8779 05THL 1.544
» 1 Enterobacter cloacae DSM 30062 DSM 1.533
г in Enterobacter hormaechei ssp hormaechei DSM 12409T DSM 1.497
un Enterobacter cloacae MB 5277 05 THL 1.4B5
1 in Enterobacter cloacae 13159 1 CHB 1.415
МП Enterobacter cloacae ssd ctoacae DSM 30054T HAM 1.391
» « Enterobacter cloacae DSM 3264 BRB 1.371
• > Enterobacter cloacae 20105 2 CHB 1.361
Рис. 3 - Значения белковых спектров изолята Enterobacter cloacae En2 и его идентификация по результатам использования программного обеспечения MALDI Biotyper
si s &
es
»1
s H
^ es
CJ ;>i
1 ■ 1 H
■■■ H
ca 'S iE SS
разовой петли и с добавлением 1 мкл матрицы, состоящей из насыщенного раствора синапиновой кислоты в 60 % ацетонитрила - 0,3 % трифторуксус-ной кислоты и высушивали на воздухе в течение нескольких минут при комнатной температуре.
Отпечатки белков с различными молекулярными массами получали при помощи MALDI-TOF масс-спектрометра Microflex LT (BrukerCorp., Billerica, USA) с обнаружением в линейном положительном режиме на частоте лазера 50 Гц и в диапазоне масс от 2000 до 30 000 Да. Напряжение разгона составляло 20 кВ, а время задержки экстракции составляло 200 нс. Для генерации каждого ионного спектра использовалось не менее 10 лазерных снимков на образец. Для каждого бактериального образца в общей сложности 100 отпечатков белков с различными молекулярными массами усредняли и обрабатывали с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper (BrukerCorp., Billerica, USA).
Результаты исследований
В ходе выполнения масс-спектрометрии MALDI-TOF были получены следующие результаты, представленные на рисунках 1-3.
Выводы
Для установления видовой принадлежности выделенных нами в 2016 году из патологического материала и объектов санитарного надзора бактериальных культур было проведено их MALDI-TOF-профилирование. Так, с помощью анализа протеомов штамм Prot2 определен как Proteus mirabilis, Ye3 - как Yersinia enterocolitica, En2 - Enterobacter cloacae. Идентификация вышеназванных штаммов первоначально проводилась по общеизвестным схемам бактериологической дифференциации представителей семейства En-terobacteriaceae, основанной на изучении тинкто-риальных, культурально-морфологических и биохимических свойств. Для определения ферментативной активности использовался классический метод инокуляции культуры в пробирки, содержащие субстраты и индикаторы [6, 7]. Полученный результат позволил определить вид микроорганизма в течение 6-7 суток.
В последние годы в нескольких отчетах была продемонстрирована возможность использования масс-спектрометрии (MSF) (MALDI-TOF) для идентификации микроорганизмов [8]. Обнаружение образцов массы белка стало удобным инструментом для быстрого анализа бактерий [9]. Метод анализирует профили белков, которые извлекаются из целых бактерий. Масс-спектрометр MALDI может эффективно обнаруживать многочисленные молекулы одновременно. Массовые образцы белка могут использоваться для родо-
вой, видовой и в некоторых случаях внутривидовой идентификации микроорганизмов. Данный метод обнаружения подтвержден в нескольких исследованиях для различных грамотрицатель-ных патогенов, передающихся через пищевые продукты [10-14].
Библиографический список
1. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium / V.C. Wasinger, S.J. Cordwell, A. Cerpa-Poljak [et al.] // Electrophoresis. -1995. - Vol. 16. - P. 1090-1094.
2. Jungblut, P.R. Proteomics of microbial рathogens / P.R. Jungblut, M. Hecker // Proteomics. - 2004. - Vol. 4, № 10. - P.2829-2830.
3. Polyphasic analysis of strains of the genus Cap-nocytophaga and Centers for Disease Control group DF-3 / P. Vandamme, M. Vancanneyt, A. van Belkum [et al.] // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1996. - Vol. 46, № 3. - P. 782-791.
4. Cash, P. Proteomics in the study of the molecular taxonomy and epidemiology of bacterial pathogens / P. Cash // Electrophoresis. - 2009. - Vol. 1. - P. 133-141.
5. Tiwari, V. Quantitative proteomics to study car-bapenem resistance in Acinetobacter baumannii / V. Tiwari, M. Tiwari // Front. Microbiol. - 2014. - Vol. 5, № 512. - Р.1-7.
6. Васильев, Д.А. Выделение и изучение биологических свойств бактерий рода Proteus / Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2017. - № 2 (38). - С. 70-76.
7. Cyльдинa, Е.В. Выделение бактерий и бактериофагов Yersinia enterocolitica / Е.В. Cyльдинa, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. -2017. - № 3 (39). - С. 50-55.
8. Sauer, S. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria / S. Sauer, M. Kliem // Nat. Rev. Microbiol. - 2010. - Vol. 8. - Р. 74-82.
9. Rapid classification and identification of salmo-nellae at the species and subspecies levels by whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry / R. Dieckmann, R. Helmuth, M. Erhard [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2008. - Vol. 74. - Р. 7767-7778.
10. Rapid identification of Vibrio parahaemo-lyticus by whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry / T.H. Hazen, R.J. Martinez, Y. Chen [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. -2009. - Vol. 75. - P. 6745-6756.
11. Species specific identification and differentiation of Arcobacter, Helicobacter and Campylobacter by full-spectral MALDI-TOF MS analysis / M. Alispahic, K. Hummel, D. Jandreski-Cvetkovic [et al.] // J. Med. Microbiol. - 2010. - Vol. 59. - P. 295-301.
12. Rapid genus and species specific identification
of Cronobacter spp. by MALDI-TOF Mass spectrometry / R. Stephan, D. Ziegler, V. Pflüger [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48. - P. 2846-2851.
13. Liquid chromatography/mass spectrometry characterization of Escherichia coli and Shigella species /
R.A. Everley, T.M. Mott, S.A. Wyatt [et al.] // J. Am. Soc. MassSpectrom. - 2008. - Vol. 19. - P. 1621-1628.
14. Integrated microanalytical technology enabling rapid and automated protein identification / S. Ekström, P. Onnerfjord, J. Nilsson [et al.] // Anal. Chem. - 2000. - Vol. 72, № 2. - P. 286-293.
SPECIES IDENTIFICATION OF ENTEROBACTERIA STRAINS BY MEANS OF MALDI-TOF MS Vasiliev D.A., Feoktistova N.A., Mastilenko A.V., Suldina E.V.
FSBEI HE Ulyanovsk SAU 432017. Ulyanovsk, Novyy Venets Boulevard, 1; 8 (8422) 55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Key words: Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Enterobacter cloacae, MALDI-TOF profiling, mass spectrometry.
The article presents results of MALDI-TOF mass spectrometry usage for identification of microorganisms of Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Enterobacter cloacae species, which were isolated in 2016 from pathological material and sanitary control facilities of livestock and poultry farms, unfavourable as far as gastrointestinal diseases were concerned . Primarily, species differentiation was carried out on the basis of studying tinctorial, cultural-morphological and biochemical properties. To study the proteomes of bacterial cultures, their MALDI-TOF profiling (analysis of protein profiles that are extracted from whole bacteria) was carried out and their compliance was confirmed. Prints of proteins with different molecular weights were obtained using a MALDI-TOF Microflex LT mass spectrometer (BrukerCorp., Billerica, USA) with detection in a linear positive mode at a laser frequency of 50 Hz and in the mass range from 2000 to 30,000 Da. The creep voltage was 20 kV, and the extraction dwell time was 200 ns. To generate each ion spectrum, at least 10 laser images per sample were used. For each bacterial sample, a total of 100 prints of proteins with different molecular weights were averaged and processed using the MALDI Biotyper software (BrukerCorp., Billerica, USA). Thus, in the studies it was established that the Prot2 strain belongs to Proteus mirabilis species, Ye3-Yersinia enterocolitica, En2-Enterobacter cloacae.
Bibliography
1. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium / V.C. Wasinger, S.J. Cordwell, A. Cerpa-Poljak [et al.] // Electrophoresis. -1995. - Vol. 16. - P. 1090-1094.
2. Jungblut, P.R. Proteomics of microbial pathogens / P.R. Jungblut, M. Hecker // Proteomics. - 2004. - Vol. 4, No. 10. - P.2829-2830.
3. Polyphasic analysis of strains of the genus Capnocytophaga and Centers for Disease Control group DF-3 / P. Vandamme, M. Vancanneyt, A. van Belkum [et al.], Int. J. Syst. Bacteriol. -1996. - Vol. 46, No. 3. - P. 782-791.
4. Cash, P. Proteomics in the study of the molecular taxonomy and epidemiology of bacterial pathogens / P. Cash // Electrophoresis. - 2009. - Vol. 1. - P. 133-141.
5. Tiwari, V. Quantitative proteomics to study carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii/ V. Tiwari, M. Tiwari//Front. Microbiol. 2014. Vol. 5, No. 512. - R.1-7.
6. Vasiliev, D.A. Isolation and study of biological properties of bacteria of Proteus genus / D.A. Vasiliev, N.A. Feoktistova, S.N. Zolotukhin // Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. - 2017. - No. 2 (38). - P. 70-76.
7. Suldina, E.V. Isolation of Yersinia enterocolitica bacteria and bacteriophages /E.V. Suldina, D.A. Vasiliev, S.N. Zolotukhin // Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. - 2017. - No. 3 (39). - P. 50-55.
8. Sauer, S. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. S. Sauer, M. Kliem, Nat. Rev. Microbiol. - 2010. - Vol. 8. - P. 74-82.
9. Rapid classification and identification of salmonellae at the species and subspecies levels by whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry /R. Dieckmann, R. Helmuth, M. Erhard [et al.]. Environ. Microbiol. - 2008. - Vol. 74. - P. 7767-7778.
10. Rapid identification of Vibrio parahaemolyticus by whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry/ T.H. Hazen, R.J. Martinez, Y. Chen [et al.], Appl. Environ. Microbiol. - 2009. - Vol. 75. - P. 6745-6756.
11. Species specific identification and differentiation of Arcobacter, Helicobacter and Campylobacter by full-spectral MALDI-TOF MS analysis / M. Alispahic, K. Hummel, D. Jandreski-Cvetkovic [et al.]//J. Med. Microbiol. - 2010. - Vol. 59. - P. 295-301.
12. Rapid genus and species specific identification of Cronobacter spp. by MALDI-TOF Mass spectrometry /R. Stephan, D. Ziegler, V. Pflüger [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48.-P. 2846-2851.
13. Liquid chromatography /mass spectrometry characterization of Escherichia coli and Shigella species /R.A. Everley, T.M. Mott, S.A. Wyatt [et al.]//J. Am. Soc. MassSpectrom. - 2008. - Vol. 19. P. 1621-1628.
14. Integrated microanalytical technology enabling rapid and automated protein identification /S. Ekström, P. Onnerfjord, J. Nilsson [et al.]//Anal. Chem. - 2000. - Vol. 72, No. 2. - P. 286-293.
