CC BY
27
окрашивание флюорохромом и травление 0,5%-м раствором калия перманганата или 10%-м раствором хлорида железа, что обеспечивает потемнение фона. В отечественной лабораторной практике для окрашивания М нашла применение модификация этого метода, известная под названием «флюоресцентное окрашивание микобактерий по Поляковой» (цит. по [1]). Автор пользовалась двумя вариантами флю-орохромных красителей: 1) смесью 0,1%-го водного раствора аурамина ОО и 0,01%-го водного раствора родамина С; 2) смесью аурамина ОО (0,12 г), карболовой кислоты (5 мл) и дистиллированной воды (до 100 мл).
При окрашивании методом П.К.Х. Хагемана в ГП сильно деформируются клетки и тканевые структуры, что не всегда приемлемо. В связи с этим А.М. Роулатт и Л.А. Корнер предложили следующий метод окраски ГП:
1. Осветление ксилолом и обезвоживание в градиенте этилового спирта срезов зафиксированного в формалине материала.
2. Окрашивание теплым (60 °С) феноловым раствором аурамина! — 15 мин.
3. Промывание водой.
4. Дифференциация 0,5%-м раствором соляной кислоты,
приготовленным на 70%-м этиловом спирте, — 1 мин.
5. Промывание в проточной воде — несколько минут.
6. Окрашивание 0,01%-м водным раствором основного фуксина — 30 с.
7. Промывание в проточной воде, обезвоживание в трех сменах абсолютного этилового спирта до приобретения препаратом светло розового цвета.
8. Просветление двумя сменами ксилола.
При проведении флюоресцентной микроскопии в синем спектре от кислотоустойчивых бактерий исходит светло-желтое свечение, а фон и ткани окрашены в красно-оранжевый цвет. Только коллаген имеет желтый цвет, но его легко отличить от бактерий.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Шуляк Б.Ф. Руководство по бактериальным инфекциям собак, т.1. Грамп-оложительные бактерии. - М.: Олита, 2003.
2. Hagemann P.K.H. Munch Med Wschr, 1938, 85, 1066.
3. Rowlatt A.M., Corner L.A. The use of a conventional counterstain with the auramine fluorescent stain for acid-fast organisms, to obtain better histological contrast. Austr Vet J, 1981, 57, 53—54.
B.P. Equi. Staining acid-fast bacteries
УДК 6 9:619, 612.015: 6 6.9 ПерВЫЙ ^уНЯй иЗолЯЦии
энтерогеморрагического серотипа O145:H кишечной палочки от крупного рогатого скота в Аргентине
Н.Л. Падола1, M.E. Санз, П.М.А. Лючези1, И.Е. Бланко2, Дж. Бланко2, M. Бланко2, A.I. Эчеверрия1, Г.Х. Арройо1, А.Е. Парма1
1 Universidad Nacional del Centro-CIC (г. Тандил, Аргентина)
2 Laboratorio de Referencia E. coli Universidad Stgo. de Compostela (г. Люго, Испания)
Сокращения: КРС — крупный рогатый скот; Mp — мегаплазмида; ЭГШК — энтерогемморагические штаммы кишечной палочки
Введение
Основной причиной геморрагическтого колита, тромбо-гемолитической тромбоцитопенической пурпуры1 и гемолитического уремического синдрома человека считают ЭГШК [17, 22]. В предыдущих публикациях мы сообщали о частом обнаружении ЭГШК в кишечнике КРС, особенно телят, и предположили, что люди чаще всего заражаются ими при употреблении в пищу сырого молока и мяса, не прошедших адекватной термической обработки [5, 11, 16, 28]. За последнее десятилетие в США, Канаде, Великобритании, Японии и ряде других стран зарегистрировали ряд вспышек упомянутых выше синдромов [1, 9, 15, 26]. В Аргентине отмечают самую высокую инцидентность гемолитического уремического синдрома (300...400 случаев/год — ежегодно заболевают 22 ребенка из 100 000 детей моложе 4-летнего возраста). Этот показатель составляет в штате Орегон (США) 2,6/100 000, в штате Вашингтон — 3,0/100 000, в Канаде, Великобритании, Чили и Уругвае — 3.5/100 000 [13]. Несмотря на то, что в Аргентине уже изолировали от больного гемолитическим уремическим синдромом ЭГШК, относящийся к серотипу 0157:
Синонимы: болезнь Мошкович, тромботическая микроангиопатия.
H7 [25], считается, что этот серотип распространен в нашей стране не так широко, как в США [13]. Недавно мы опубликовали перечень ЭГШК, не относящихся к серотипу O157: H7, которые обнаружены в Аргентине у КРС и в кормах [21], причем некоторые из них известны как возбудители тромбо-цитарной тромбоцитопенической пурпуры и гемолитического уремического синдрома.
В Европе 80 % веротоксинпродуцирующих штаммов E. coli, изолируемых от пациентов с диареей, относятся к серогруп-пам O26, O91, 0103, O111, O113, O128, O145, а не к O157 [6]. В 1984 г. Ю. Кюдох и соавт. [12] описали вспышку болезни, поразившей 100 детей. От них впервые в Японии выделили серотип O145:H- кишечной палочки. Л. Бьютин и соавт. [2] отнесли этот серотип к числу новых опасных патогенов. В последующем исследователи изолировали его от КРС и людей в США, Канаде и Бельгии [7, 11, 23, 27, 29, 31]. Другой серотип, O145:H25, оказался причастен к заболеванию гемолитическим уремическим синдромом жителей Великобритании [31]. Тем временем от клинически здорового КРС в Канаде [27] и Германии [30] изолировали серотипы O145:H8 и O145:H28 соответственно.
Арсенал факторов вирулентности ЭГШК включает веро-токсины (VT1, VT2 и их варианты), ген eae, обеспечивающий прикрепление к клеткам эпителия кишечника и сглаживание их поверхности, и Mp размером 60 МДт [17]. Цели данной публикации состоят в информировании о первом случае изо-
ляции серотипа O145:H- от КРС в Аргентине и наборе факторов вирулентности, найденных у нескольких таких изолятов. Эта информация будет полезна для оценки риска его передачи людям через продукты питания.
Материалы и методы
Сбор проб от КРС. Пробы патологического материала для бактериологического исследования брали от откармливаемого КРС на аргентинских фермах, пользуясь ранее описанным методом [28]. Коротко: у 59 голов КРС на протяжении 6 мес с интервалом в 2 нед брали ректальные смывы. Их помещали в транспортную среду и немедленно доставляли в лабораторию. Там патологический материал высевали на агаровую среду МакКонки и инкубировали 24 ч при 37 °С. Часть выросших колоний (приблизительно 100) пересевали в бульон Лурия-Бертани. Посевы инкубировали 3 ч при 37 °С и экстрагировали из них ДНК [20, 28]. К 1 мл каждой культуры добавляли глицерин и замораживали при -70 °С. Для получения отдельных VT+ колоний (50...100 колоний/ пробу) материал высевали в чашки Петри с агаровой средой МакКонки. Идентификацию E. coli проводили по биохимическим свойствам (способности ферментировать декстрозу лактозу сахарозу, цитрат, образовывать индол, сероводород, наличию уреазы и др.).
Обнаружение VT1, VT2, eae и Мр в полимеразной цепной реакции. ДНК изолятов E. coli экстрагировали так, как описано ранее [20, 28]. Использовали праймеры eae-1 и eae-2, позволяющие амплифицировать участок гена eae, консервативный для ЭГШК и энтеропатогенных штаммов E. coli. Последовательность нуклеотидов праймеров VT1, VT2 и eae приведена в ранее опубликованной статье [28]. Для выявления Мр пользовались праймерами MFS1F 5' ACGATGTGGTTTAT-TCTGGA 3' и MFS1R 5' CTTCACGTCACCATACATAT 3' [8]. Tm рассчитывали для каждого из них с помощью программы Oligo 4.0 (Primer Analysis Software, National Biosciences). Амплификацию бактериальной ДНК проводили в реакционной смеси объемом 50 мкл. В качестве негативных контролей пользовались реакционной смесью без тестируемой пробы, а также смесями, содержащими ДНК штаммов E. coli, не имеющих генов VT1, VT2, eae и Mp. Два референтных штамма серотипа O157:H7 служили положительными контролями. Условия амплификации VT1, VT2, eae и Мр описаны ранее [8, 20, 28]. Продукты амплификации анализировали с помощью гель электрофореза.
Ферментация сорбита. Способность VT+ штаммов ферментировать сорбит изучали на агаровой среде МакКонки с этим углеводом.
Серотипирование. Антигены O и H типировали в реакции микроагглютинации, которую проводили в пробирках и планшетах по методу П.А.М. Гвинии и соавт. [10] в модификации Дж. Бланко и соавт. [4] c применением антисывороток к известным (O1...O175) и 6 новым (OX176...OX181) O-антигенам [24], а также H-антигенам (H1..H56) [18]. От неспецифических агглютининов антисыворотки освобождали абсорбцией перекрестнореагирующими антигенами. Определяли принадлежность к О-серогруппе всех веротоксигенных штаммов E. coli. Серотипирование по Н-антигену проводили только штаммов, выделенных от одного и того же животного, при обнаружении у них различий факторов вирулентности или в случае их принадлежности к разным О-серогруппам. Реакция случайной амплификации полиморфной ДНК. Культуры бактерий выращивали в течение ночи при 37 °C в бульоне при постоянном встряхивании. Пробу культуры разводили в 10 раз водой для определения оптической плотности при длине волны 600 нм. Для получения оптической плотности, равной 0,5, пробу культуры на стационарной фазе роста объемом 500 мкл центрифугировали (2 мин при 12 000 g) и ресуспендировали в 500 мкл бидистиллированной воды. За-
тем суспензию кипятили 10 мин и центрифугировали (2 мин при 12 000 g), а надосадочную жидкость хранили при -70 °C. В качестве матрицы для амплификации использовали 5 мкл этого материала. Тест проводили с общим объемом реакционной смеси, равным 50 мкл; она состояла из 20 мМ сульфата аммония, 75 мМ Tris-HCl (pH 9.0), 0,1 % (масса/объем) твина 20, 2,5 мМ хлорида магния, 200 мкм каждого дезоксинуклео-зидтрифосфата, 1 мкм праймера, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы. Сравнение трех праймеров 1281 [14], 970-11 и М13 [3] показало недискриминаторный характер первых двух из них.
Амплификацию проводили в термоциклере Genius (Te-chne, Cambridge Ltd.) по схеме: начальная денатурация при 94 °C — 5 мин (при скорости нагрева 60 °С/мин), 40 циклов денатурации при 94 °C — по 1 мин (при скорости нагрева 29 ^/мин), отжиг при 50 °C — 1 У мин (при скорости охлаждения 26 ^/мин) и элонгация — 1У мин при 72 °C (при скорости нагрева 29 ^/мин). Анализ продуктов реакции (10 мкл) проводили в 1,8%-м агарозном геле после окраски этидиумом бромидом.
Результаты и обсуждение
В Аргентине от откармливаемого КРС изолировали 9 шигатоксинпродуцирующих серогрупп и 11 нетипируемых штаммов E. coli (данные не представлены). О наличии одной из этих серогрупп (O145) в нашей стране ранее известно не было. Все штаммы этой серогруппы охарактеризовали как H-. Ранее японские исследователи выделили данный серо-тип (O145:H-) при вспышке гемолитического уремического синдрома [12]. При изучении генома аргентинских изолятов серотипа O145:H- выявили следующие комбинации факторов вирулентности: VT2+eaeA+ Mp+ (5 изолятов), VT2+eaeA+ (1 изолят), VT1+eaeA+ Mp+ (2 изолята) и VT1+eaeA+ (1 изо-лят). Все они ферментировали сорбит в течение 18-часовой инкубации при 37 °C. Изоляты, выделенные от одного и того же животного, считали разными штаммами, если они различались по факторам вирулентности.
молекулярная rapd профиль 1 rapd профиль 2
масса
123 456 789
Результаты реакции случайной амплификации полиморфной ДНК, проведенной с праймером M13. В колонке «Молекулярная масса» показаны ДНК-маркеры молекулярной массы (с шагом в 100 пар оснований, Promega, Madison, WI)
Фенотипическая характеристика серотипа O145:H-, изолированного от КРС
Количество животных Количество проб Факторы вирулентности Профиль вирулентности Полосы (рисунок)
VT1 VT2 eaeA Mp
52 1 - + + + 1 1
18 1 - + + + 1 2
27 3 - + + + 1 3
46 3 - + + + 1 4
38 4 - + + + 1 5
27 3 - + + - 2 6
1 1 + - + + 3 7
17 11 + - + + 3 8
1 1 + - + - 4 9
По результатам исследования в реакции случайной амплификации полиморфной ДНК изоляты O145:H- разделили на две группы: VT1 + и VT2+ (рис. 1, профили 1 и 2 соответственно). Этим методом не удалось дифференцировать изоляты, у которых имелась или отсутствовала Мр. Данный факт указывает на необходимость использования новых праймеров при проведении реакции случайной амплификации полиморфной ДНК с целью оценки родства изолятов.
На основании наличия генов, кодирующих веротоксины (1 или 2), способности индуцировать прикрепление к энтеро-цитам и сглаживать их поверхность (ген eaeA), а также экс-прессировать гемолизин (ген Hly) серотип O145:H- E. coli следует отнести к патогенам, способным заражать людей через продукты питания. Этот энтерогеморрагический серотип ранее никогда не изолировали от КРС в Аргентине [21]. Такая находка обязательно должна привлечь внимание руководителей здравоохранения и ветеринарной службы в связи с очень высокой инцидентностью гемолитического уремического синдрома в нашей стране.
Заключение
Нам удалось впервые изолировать от КРС ЭШГК, относящиеся к серотипу O145:H-. Тем самым расширился перечень известных в Аргентине серотипов E. coli этого вида животных. Все изученные штаммы серотипа O145:H- обладали несколькими факторами вирулентности — это позволяет предположить возможность того, что они способны вызывать у людей гемолитический уремический синдром. По результатам исследования в реакции случайной амплификации полиморфной ДНК изоляты O145:H- разделили на две группы, различавшиеся типом образуемого веротоксина.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Barret T.J., Lior H., Green J.H. et al. J Clin Microbiol, 1994, 32, 3013— 3017.
2. Beutin L., Zimmermann S., Gleier K. Association between serotypes, virulence markers and disease in a group of 679 verocytotoxin-producing E. coli (VTEC) strains isolated from human patients in Germany (1997-1999). Conf. Epidemiology of VTEC and Workshop on "Typing methods for VTEC strains", Malahide, Ireland, 2001.
3. Birch M., Denning D.W., Law D. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1996, 15 297—302.
4. Blanco J., Blanco M., Alonso M.P. et al. FEMS Microbiol Letters, 1992, 75, 155—159.
5. Blanco M., Blanco J.E., Blanco J. et al. Vet Microbiol, 1997, 54, 309—319.
6. Caprioli A., Tozzi A.E. Epidemiology of Shiga toxin-producing E. coli infections in continental Europe. In: Escherichia coli O15 7: H7 and other Shiga toxin-producing E. coli strains 1998, 38—48.
7. Clarke R.C., Wilson J.B., Read S.C. et al. Verocytotoxin-producing E. oli (VTEC) in the food chain: preharvest and processing perspectives. In: Recent adv-
ances in Verocytotoxin-producing E. coli infections 1994, 17—24.
8. Fratamico P.M., Sackitey S.K., Wiedmann M. et al: J Clin Microbiol, 1995, 33, 2188—2191.
9. Griffin P.M., Bell B.P., Cieslak P.R. et al. Large outbreak of E. coli O157:
H7 infections in the western United States: the big picture. In: Recent advences in verocytotoxin-producing E. coli infections 1994, 7—12.
10. Guinee P.A.M., Jansen H.W., Wasdtrom T. et al: E. coli associated with neonatal diarrhoea in piglets and calves. In: The Laboratory diagnosis in neonatal calf and pig diarrhoea. Current topics in veterinary and animal science 1981, 13, 126—162.
11. Johnson R.P., Clarke R.C., Wilson J.B. et al. J Food Prot, 1996, 59, 1112— 1122.
12. Kudoh Y., Kai A., Obata H. et al. Epidemiological surveys on verocytotoxin-pr-
oducing E. coli infections in Japan. In. Recent advances in verocytotoxin-producing E. coli infections 1994, 53—56.
13. Lypez E.L., Contrini M.M., De Rosa M.F. Epidemiology of Shiga toxin-producing E. coli in South America. In: Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxin-producing E. coli strains 1998, 30—37.
14. Madico G., Akopyants N.S., Berg D.E. J Clin Microbiol, 1995, 33, 1534— 1536.
15. Michino H., Araki K., Minami S. et al. Recent outbreaks of infections caused by Escherichia coli O157:H7 in Japan. In: Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxin-producing E. coli strains, 1998, 73—81.
16. Montenegro M.A., Bulte M., Trumpf T. et al. J Clin Microbiol, 1990, 28, 1417—1421.
17. Nataro J.P., Kaper J.B. Clin Microbiol, Rev, 1998, 11, 142—201.
18. Orskov F., Orskov Y. Methods in Microbiology, 1984, 14, 43—112.
19. Pacheco A.B.F., Guth B.E.C., Soares K.C.C. et al. J Clin Microbiol, 1997, 35, 1521—1525.
20. Parma A.E., Vicas M.R., Sanz M.E. J Microbiol Meth, 1996, 26, 81—85.
21. Parma A.E., Sanz M.E., Blanco J.E. et al. Eur J Epidemiol, 2000, 16, 757— 762.
22. Paton J.C., Paton A.W. Clin Microbiol Rev, 1998, 11, 450—479.
23. Pierard D., Stevens D., Moriau L. et al. Three years PCR screening for VTEC
in human stools in Brussels. In: Recent advances in verocytotoxin-producing E. coli infections, 1994, 33—36.
24. Pradel N., Livrelli v., De Champs C. J Clin Microbiol, 2000, 38, 1023— 1031.
25. Rivas M., Voyer L., Tous M. et al. Medicina (Buenos Aires), 1993, 53, 487— 490.
26. Rowe P.C., Orrbine E., Lior H. et al. Epidemiol Infect, 1993, 110, 1—7.
27. Sandhu K.S., Clarke R.C., McFadden K. et al. Epidem & Inf, 1996, 116, 1—7.
28. Sanz M.E., Vicas M.R., Parma A.E. Eur J Epidemiol, 1998, 14, 399—403.
29. Wells J.G., Shipman L.D., Greene K.D. et al. J Clin Microbiolol, 1991 29, 985—989.
30. Wieler L.H., Vieler E., Erpenstein C. J Clin Microbiol, 1996, 34, 2980— 2984.
31. Willshaw G.A., Scotland S.M., Smith H.R., Rowe B. J Inf Dis, 1992, 166, 797—802.
N.L. Padola, M.E. Sanz, P.M.A. Lucchesi, J.E. Blanco, J. Blanco, M. Blanco, A.I. Etcheverria, G.H. Arroyo, A.E. Parma. First isolation of the enterohaem-orrhagic Escherichia coli O145:H- from cattle in feedlot in Argentina. BMC Microbiology 2002, 2:6 Doi:10.1186/1471-2180-2-6. OA.
